微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析

欢迎各位同学批评指正！当前第1页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放马放哈尔滨工业大学环境科学与工程系城市水资源与水环境国家重点实验室StateKeyLaboratoryofUrbanWaterResourceandEnvironmentDept.ofEnvironmentalScienceandEngineering,HIT微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析当前第2页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放主要内容传统环境微生物分析方法面临的挑战现代环境微生物分析方法发展概述rDNA序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析中的应用PCR扩增技术的应用核酸探针杂交技术的应用DNA指纹图谱技术当前第3页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放传统环境微生物分析方法面临的挑战

利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括纯种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。当前第4页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放微生物与农业微生物与工业微生物与医学微生物与环境保护微生物与能源开发传统环境微生物分析方法面临的挑战传统微生物培养技术的现状——微生物与人类社会当前第5页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放

在分子生物学诞生的20多年时间里，人们运用基因工程的几大基本技术：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化技术、DNA序列分析技术及基因定点突变技术，对食品、医学、农业及环境保护等各个领域的应用微生物进行基因改造，实现了人为改造或修饰生物遗传特性并创造生物新性状的梦想。传统环境微生物分析方法面临的挑战传统微生物培养技术的现状——微生物与现代分子生物学当前第6页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放基因改造后的工程菌野生菌株基因改造技术工程菌性能YarrowialipolyticaDC-3-2N+离子束注入诱变育种对油脂的降解率提高了11.09%Sphingomonassp.BHC-A转座子介导同源重组获得了降解有机磷农药的功能Candidatropicalis

和Candidalipolytica电融合融合菌的耐pH及耐高浓度铬的能力均优于亲本菌工业用酿酒酵母HDY-01基因敲除乙醇产量降低，适于生产低醇啤酒Chaetomiumcupreum多点突变提高几丁质酶的表达量Bacillusthuringiensis定点突变提高对农业害虫甜菜夜蛾的毒力传统环境微生物分析方法面临的挑战当前第7页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放传统环境微生物分析方法面临的挑战

随着现代分子生物学的发展，尤其是可以利用16SrRNA技术鉴定纯培养物种的归属，大大丰富了我们所获得的环境微生物种类及遗传多样性。从分子水平上对微生物进行基因研究，为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的线索和思路。

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纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研究的不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性——平板计数异常(PlateCountanomaly)，即环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间存在巨大差异。传统环境微生物分析方法面临的挑战当前第9页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放造成平板计数异常的原因：由于实验室难以再现微生物的自然生存条件大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的生长

传统环境微生物分析方法面临的挑战

因此，利用传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未培养微生物或不可培养微生物(UnculturedMicroorganism)。当前第10页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放微生物的自然多样性结构多样性代谢多样性行为多样性进化多样性生态多样性传统环境微生物分析方法面临的挑战土壤海洋肠道当前第11页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放传统环境微生物分析方法面临的挑战

科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105-106。采用传统微生物培养技术对不同生境微生物可培养性的验证来看，海水中可培养的微生物约占0.001%-0.1%，淡水约占0.25%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%左右。许多实验室证实，有些微生物处于一种活的但不可培养(ViablebutNonculturable，VBNC)的状态。据报道，至少有16个属的30种细菌属于此类微生物。

因此，纯培养技术的局限性已经成为研究微生物自然生态和多样性的主要瓶颈，这迫使我们不得不重新审视传统的纯培养技术。

当前第12页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放The‘omics’组学技术GenomeTranscriptomeProteomeMetabolome现代分子生物学技术现代环境微生物分析方法发展概述系统生物学当前第13页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放现代环境微生物分析方法发展概述组学技术在微生物群落结构解析方面的应用当前第14页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放现代环境微生物分析方法发展概述微生物非培养技术的产生与发展

微生物学家运用非培养方法来研究自然界中的微生物，即避开传统的微生物分离培养方法，利用DNA含有不同的信息内容和信息容量这一特性，直接研究细胞的DNA以获取自然界微生物的多样性及群落组成的信息，及从分子生态学的角度研究未培养微生物在环境中的变化。非培养技术的主要任务在于：革命性地改变了人们对原核生物多样性和自然界微生物群落组成的理解，并提供开发不可培养微生物资源的新途径。

当前第15页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放微生物多样性群落分析生物材料获取

DNA-DNA复性

G+C含量分析DNA指纹分析直接PCR扩增宏基因组技术现代环境微生物分析方法发展概述非培养技术的分类当前第16页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放现代环境微生物分析方法发展概述

以群落分析为目的的非培养技术

大尺度的分析群落DNA的非培养法有DNA-DNA复性和G+C含量分析两种方法，它们能分别给出所研究微生物群落总的基因多样性和结构的改变。DNA指纹技术大尺度群落分析变性梯度凝胶电泳(DGGE)扩增rDNA限制性分析(ARDRA)末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)核糖体基因间序列分析(RISA)当前第17页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放现代环境微生物分析方法发展概述以生物材料获取为目的的非培养技术

1.基于目标瞄定的PCR直接扩增法，即不需知道基因的序列，仅根据保守序列设计引物，就可以直接从环境DNA中扩增到目的基因，该法方便、简单、快速但不易获得新型基因。2.宏基因组技术，即通过对环境DNA构建插入基因组文库，并利用活性或序列筛选的方法以获取目标基因的新技术。

宏基因组技术不仅可以将系统发育信息和未培养群落成员隐含的功能信息以及未被发现的有意义的新的功能基因联系起来，而且还可用于共生关系或其他简单群落中未培养群落的全基因组测序，有利于我们重新认识有意义但未被开发的生物学过程。

当前第18页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放现代环境微生物分析方法发展概述微生物非培养技术的优势与局限性

微生物非培养技术的优越性

(1)发现新种(2)评价具有重要生态地位的种类(3)古菌的研究(4)菌种与环境功能的关联

非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆文库测序不完全，细胞裂解程度的不同、特定细胞DNA被优先扩增以及由PCR的循环步骤带来的一些分析难题影响着克隆文库的应用。当前第19页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放现代环境微生物分析方法发展概述微生物非培养技术的应用前景

(1)微生物多样性程度的测定(2)生态学和进化(3)目标基因的获取(4)非培养微生物特征的鉴定(5)系统水平理解微生物群落动力学当前第20页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析

研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中，最常见的靶基因是16SrDNA和核糖体DNA的基因间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)。细菌的rRNA组成当前第21页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放

细菌的23SrDNA、16SrDNA和5SrDNA分别含有约为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析CarlWoese上世纪60年代末，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rDNA特征序列，认为16SrDNA及其类似的rDNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。当前第22页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析rDNA序列的微生物鉴定主要依据为：rDNA是生物体细胞中必要的成分，具有功能同源性且最为古老，而且同时含有保守序列和可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应等。

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用于一些DNA指纹分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是针对16SrDNA为靶基因的引物，通过它的分析可以直接鉴定到属或种。根据核糖体16SrDNA结构变化规律，在所测定的区域中包括了V1、V2、V3、……、V8共8个高变区，尤其是V3这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。常用引物包括341F/534R（V3区）、968F/1401R（V6-V8区）、63F/534R（V1-V3区）、341F/926R（V3-V5区）等。

rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析16SrDNA当前第24页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放常用16SrDNA序列引物引物序列（5’→3’）应用范围27fAGAGTTTGATCNTGGCTCAGPCR测序、多数真细菌109r1ACGYGTTACKCACCCGT广泛特异性109r2AKRCATTACTCACCCGT多数γ-紫细菌和一些β-紫细菌342rCTGCTGCSYCCCGTAG多数真细菌357rCTCCTACGGGAGGCAGCAG多数真细菌519rGWATTACCGCGGCKGCTG多数真细菌、真核生物、古菌530rGTGCCAGCMGCCGCGG多数真细菌、真核生物、古菌685r1TCTACGRATTTCACCYCTACα-紫细菌、δ-紫细菌、梭菌属685r2TCTACGCATTTCACYGCTACα-紫细菌、γ-紫细菌685r3TCTRCGCATTYCACCGCTAC多数G+、蓝细菌、混杂细菌907rCCGTCAATTCMTTTRAGTTT多数真细菌、真核生物、古菌926fAAACTYAAAKGAATTGACGG多数真细菌、真核生物、古菌1100rGGGTTGCGCTCGTTG多数真细菌1114fGCAACGAGCGCAACCC多数真细菌1392rACGGGCGGTGTGTRC多数真细菌、真核生物、古菌1406fTGYACACACCTCCCGT多数真细菌、真核生物、古菌1492rTACGGYTACCTTGTTACGACTT测序多数真细菌、古菌1525rAAGGAGGTGWTCCARCC测序多数真细菌、古菌注：M=C或A，Y=C、A或T，K=G或T，R=A或G，S=G或C，W=A或T。当前第25页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放

1980年，Brosius等利用23SrRNA基因序列测定的方法推导出大肠杆菌23SrRNA的全部核苷酸排列顺序，整个分子含有2904个核苷酸。1981年相继有三个实验室提出了大肠杆菌23SrRNA的二级结构模型。目前已经获得了大量有关23SrRNA基因序列的信息，不同来源的23SrRNA约有60%~70%的结构共同性。大肠杆菌23SrRNA的一级结构与酵母也有很大相似性。虽然已有大量的大肠杆菌23SrRNA基因序列信息，但是相比于16SrRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中还没有得到广泛的应用。rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析23SrDNA

当前第26页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析核糖体DNA的基因间隔区(ITS区)

细菌的rDNA通常由5S、16S和23S及一些间隔序列组成。近十几年来，人们成功的以核糖体大小亚基基因间的间隔序列为对象，对细菌进行更细致的分类和鉴定，并对细菌群落的结构和多样性进行分析。

核糖体DNA的基因间隔区示意图当前第27页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放PCR扩增技术的应用

PCR扩增原理示意图（左）及PCR仪工作原理曲线（右）

DNA指纹技术通常需要大量的DNA片段，因此，需要一种手段能够同比例的放大混合DNA样品的量。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）通过试管中进行的DNA复制反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增几百万倍。当前第28页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放不同种类的PCR方法方法名称基本原理适用范围特点巢式PCR利用两套PCR引物（巢式引物）对DNA模板进行两轮PCR扩增反应。一般应用于动物方面，如：病毒、梅毒螺旋体、HIV、肿瘤基因的检测等。降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性及检测的可靠性。反向PCR用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段。仅知部分序列的全长cDNA的克隆，曾被用于扩增基因文库的插入DNA。简单快速，可以研究许多独立克隆。对条件要求较高，需优化。原位PCR在不破坏细胞的前提下利用原位的完整细胞作为一个微反应体系来扩增细胞内的靶片断的方法，是一种把PCR和原位杂交结合起来的新方法。可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心细胞、悬浮细胞等）的不同拷贝数目序列（病毒的或基因组的DNA或RNA）的扩增。既有高度的敏感性，又有精确的定位。定量PCR主要利用加入PCR反应体系中的荧光基团或荧光染料来对扩增产物进行连续检测，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。已成功运用于水资源及居家办公环境中的大肠杆菌、藻青菌和一些寄生虫的检测；转基因生物鉴定和生物种类鉴定等方面。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应后不用电泳检测等。反转录PCR先用寡聚胸苷作为引物在逆转录酶作用下，反转录所有mRNA成cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物PCR扩增该段cDNA的方法。对表达信息进行检测或定量分析；测定基因表达的强度；鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性等。快速灵敏。多重PCR在一个反应管中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的方法。各类病原的检测与鉴别、遗传疾病诊断、以及基因缺失、突变和多态性分析等。能够同时检测多种目的DNA，节省样品，操作简单。但对条件要求较高，需优化。热不对称交错PCR利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。用于分离获得克隆载体上的DNA序列，也能够用于基因组小的物种如拟南芥、水稻和基因组大的物种，如小麦以及哺乳动物的已知序列两侧翼的DNA序列的分离。操作简单，特异性高，高效灵敏，快速，不涉及连接反应，反应产物准确可靠，重复性好。但其需要的组合较多，而且有时存在假阳性。当前第29页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放巢式PCR技术

巢式PCR原理示意图巢式PCR(nestedPCR)，是指利用两套PCR引物(巢式引物)对DNA模板进行两轮PCR扩增反应。当前第30页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放反向PCR技术反向PCR的原理示意图常规PCR是扩增两引物之间的DNA片段，反向PCR（reversePCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段。

当前第31页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放原位PCR技术

原位PCR可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心细胞、悬浮细胞等）不同拷贝数目的序列（病毒的或基因组的DNA或RNA），扩增方法可分为单个或多个引物对，检测系统也分为直接和间接两种。原位PCR的大致流程主要包括：染色体、细胞及组织切片样品的制备PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用反转录PCRd.原位杂交及检测。当前第32页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放定量PCR技术

定量PCR技术的方法主要包括：PCR产物的直接定量、有限稀释法、外对照PCR定量、内对照PCR定量、竞争性PCR定量以及荧光定量PCR。其中又以实时荧光定量PCR（RealtimeFluorescentQuantitativePCR，RFQ-PCR）的方法应用最为广泛。

当前第33页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放实时荧光定量PCR的两种定量技术原理定量PCR技术

实时荧光定量PCR的动态变化图（左）和标准曲线图（右）当前第34页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放反转录PCR技术

反转录PCR（ReversedTranscriptPCR，RT-PCR），是一种将cDNA合成与PCR技术结合，用以分析基因表达的快速、灵敏的方法。

反转录PCR原理示意图当前第35页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放热不对称交错PCR技术

热不对称交错PCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，简称TAIL-PCR）是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。TAIL-PCR反应流程当前第36页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放核酸探针杂交技术的应用

分子杂交技术(techniqueofmolecularhybridization)又称核酸杂交技术，是利用现代分子生物学技术手段从分子水平探讨组织细胞内特定基因的表达变化规律，并阐明细胞功能调节机制的一种极为重要的方法，在一定程度上具有其他生物检测技术所不能替代的作用。当前第37页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放常规分子杂交技术的定义及分类菌落原位杂交分子杂交技术常规分子杂交技术荧光原位杂交技术生物芯片技术固相杂交液相杂交斑点杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交组织原位杂交夹心杂交DNA斑点杂交RNA斑点杂交完整细胞斑点杂交吸附杂交发光液相杂交液相夹心杂交复性速率液相分子杂交HAP吸附杂交亲和吸附杂交磁珠吸附杂交能量传递法吖啶翁酯标记法亲和杂交采用多组合探针和化学发光检测基因芯片蛋白质芯片芯片实验室其他类型生物芯片cDNA微阵列芯片寡核苷酸芯片技术组织芯片细胞芯片糖芯片当前第38页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放菌落原位杂交

菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA与探针进行杂交反应的方法。用菌落原位杂交方法进行的FASTPlaqueTB实验当前第39页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放Southern印迹Southern印迹杂交的操作流程当前第40页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放荧光原位杂交技术原位杂交(InSituHybridization，ISH)技术是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。

ANAMMOX污泥中浮霉状细菌荧光原位杂交分析当前第41页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术的基本原理是基于碱基互补的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与待检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA相互补的核酸探针进行染色体水平上的原位杂交，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位。

样品的固定样品的制备和预处理预杂交探针和样品变性用不同的探针杂交以监测不同的靶序列漂洗去除未结合的探针杂交信号的检测和结果分析FISH技术具体步骤当前第42页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放荧光原位杂交技术将中期细胞固定于玻片上将DNA变性成单链双链DNA探针荧光标记探针变性成单链探针与靶DNA杂交荧光检测图像获取和分析mFISH技术的实验路线图当前第43页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放荧光原位杂交技术利用荧光原位杂交技术观测铁沉积样品中的微生物群落结构当前第44页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放生物芯片技术

生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞及蛋白质、核酸等生物分子进行准确、快速、高通量检测。生物芯片的本质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。

生物芯片各部分高度整合当前第45页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放生物芯片技术生物芯片新技术及其优点核酸芯片相关的新技术优点长链探针技术特异性和灵敏度较高凝胶微阵列芯片技术固定探针能力强，探针分子更易于与目标分子反应，生物兼容性好侵入式探针技术操作简便，恒温反应，费用低，准确性高，易于自动化和高通量操作捕获探针技术灵敏度高，分析时间较短，成本较低固相引物延伸技术灵敏度较高，易于高通量操作电子生物芯片反应效率较高，特异性较好LNA技术杂交特异性较好，生物学稳定性较高PNA技术更好的结合能力和更高的特异性当前第46页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放生物芯片技术基因芯片技术的原理当前第47页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放生物芯片技术cDNA微阵列芯片原理图当前第48页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放生物芯片技术核酸编程的蛋白质芯片制备原理当前第49页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放DNA指纹图谱技术DNA指纹技术包括：

变性梯度凝胶电泳（DGGE）温度梯度凝胶电泳（TGGE）单链构象多态性分析（SSCP）限制性片段长度多态性分析（RFLP）末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）核糖体基因间隔序列分析（RISA）扩增的rDNA限制酶切分析技术（ARDRA）随机扩增多态性DNA分析（RAPD）

当前第50页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放DNA指纹图谱技术总DNA的提取、纯化与检测PCR扩增及限制性内切酶酶切PCR扩增产物（或其酶切产物）的分离图谱解析及数据分析等DNA指纹图谱的建立过程示意图总DNA提取流程示意图当前第51页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放匹配指纹技术的电泳技术

分类依据名称应用分离对象蛋白质电泳研究蛋白质的理化性质及免疫学特征核酸电泳分离、鉴定及制备纯化核酸支持物琼脂糖凝胶电泳（图6-15a）分离、鉴定核酸及蛋白质聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳（图6-15b）分离、鉴定蛋白质及核酸醋酸纤维膜电泳分离、鉴定蛋白质自由溶液电泳分离、鉴定蛋白质及核酸电泳机理等电聚焦电泳分离、鉴定蛋白质，测定蛋白质等电点十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS）凝胶电泳（图6-15c）分离、鉴定蛋白质，测定蛋白质分子量双向电泳分离、鉴定蛋白质及细胞蛋白组成脉冲场电泳分离、鉴定及大病毒DNA免疫电泳分析、鉴定蛋白质的免疫学性质其它转印电泳蛋白质的免疫学分析及核酸的分子杂交鉴定毛细管电泳分离鉴定蛋白质、多肽、核苷酸、核酸及小分子化合物当前第52页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放DNA指纹图谱技术琼脂糖凝胶电泳示意图当前第53页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放DNA指纹图谱技术聚丙烯酰胺电泳示意图当前第54页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放常见DNA指纹技术的比较方法名称基本原理基本步骤特点变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，进而导致DNA双链迁移速度的不同，将不同序列DNA片段分开，从而产生不同的指纹图谱。①样品总DNA提取及纯化；②样品16SrDNA片段的PCR扩增；③预实验，对化学变性剂浓度范围进行确定；④样品的DGGE分析。具有重现性强、可靠性高、速度快等优点，但该项技术具有对样品预处理过程要求较高、操作较为繁琐等局限性。温度梯度凝胶电泳（TGGE）TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，变性条件由不同浓度梯度的变性剂变成温度梯度。①样品总DNA提取及纯化；②样品16SrDNA片段的PCR扩增；③预实验，对化学变性剂浓度范围进行确定；④样品的DGGE分析。具有重现性强、可靠性高、速度快等优点，但该项技术具有对样品预处理过程要求较高、操作较为繁琐等局限性。单链构象多态性分析（SSCP）相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，因而电泳迁移率不同而在凝胶中被分开，产生指纹图谱。①样品总DNA提取及纯化；②样品靶基因片段的PCR扩增；③非变性聚丙烯酸胺凝胶电泳分离。具有操作简单；周期短；成本较低等特点，适合于大样本筛查等。扩增片段长度多态性分析（AFLP）对基因组酶切片段的选择性扩增，将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不同扩增片段长度的多态性。①样品总DNA提取及纯化；②双酶切及连接；③PCR预扩增；④PCR选择性扩增；⑤变性聚丙烯酰胶胺凝胶电泳。具有效率、分辨率高；重复性好；操作简便；样品用量少、适用性广等特点。但存在技术费用昂贵、对模板反应迟钝、在对等位基因的精确定位等方面存在一定的局限性。末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）微生物群落中任何具有特异性的DNA片段都可以作为目标分析序列，包括微生物核糖体小亚基（SSU）16SrRNA（原核生物）和18SrRNA（真核生物）的基因序列，以及一些保守的功能基因序列等。通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构和功能。①样品总DNA的提取；②PCR扩增③PCR扩增产物的限制性酶切；④变性聚丙烯酸胺凝胶电泳分离。具有分辨率高、易于实现自动化等特点。但存在PCR差异性、无法准确的分析较大量生物信息等局限性。当前第55页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放常见DNA指纹技术的比较核糖体基因间隔序列分析（RISA）细菌16S和23SrDNA间隔片段（ITS）的大小可因不同的物种而变化，利用PCR将ITS扩增出来，并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，即可产生RISA指纹图谱。①样品总DNA的提取；②ITS序列的PCR扩增；③用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物及解析图谱。具有简单经济；易操作等特点。但同时存在精度较差等缺点。扩增的rDNA限制酶切分析技术（ARDRA）一定长度的DNA经某种限制性内切酶消化后，产生若干不同长度的小片段，其数量和每一片断长度反映了DNA上该限制性内切酶酶切位点的分布。这些不同的片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，根据其显示的带型，可以判断样品间的差异。①样品总DNA提取及纯化；②PCR扩增；③限制性酶切；④用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离酶切的DNA片段并解析图谱。具有特异性强、效率高的特点。随机扩增多态性DNA分析（RAPD）利用一系列随机引物，以DNA为模板，通过基因放大器进行多态性DNA片段的随机合成。①样品总DNA提取及纯化；②随机性PCR扩增；③用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并解析图谱。具有效率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点。扩增功能DNA限制性分析（AFDRA）对基因组中功能基因的选择性扩增，利用限制性内切酶对功能基因进行酶切，后利用琼脂糖凝胶电泳分离得到酶切片段多样性图谱，以判断功能基因的多样性。①样品总DNA提取及纯化；②利用设计的特异性引物对功能基因进行PCR扩增；③限制性酶切；④用含有Nusieve（FMC的生物产物）的琼脂糖凝胶矩阵分离酶切的DNA片段并解析图谱。专用于功能基因多样性的分析，具有效率高、特异性强、检测灵敏度高等特点。但引物的设计对结果影响较大，预实验较为繁琐。当前第56页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放DNA指纹图谱技术变性梯度凝胶电泳(DGGE)DGGE的原理是：在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降，因此，将PCR扩增得到的等长DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带，每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同序列的DNA。

当前第57页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放DNA指纹图谱技术不同偶氮染料脱色菌群的DGGE指纹分析图谱当前第58页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政环境工程学院环境科学与工程系马放温度梯度凝胶电泳(TGGE)DNA指纹图谱技术TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCR产物及目的片段。

大熊猫面部菌群的TGGE图谱当前第59页\共有67页\编于星期四\17点6/2/2023市政