蛋白质的测定方法比较

蛋白质的测定方法比较一、分光光度法1、 测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化毗啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。2、 测定步骤：试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g〜0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g〜1g（精确至0.001g）或液体试样1g〜5g（精确0.001g），移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，全液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。试样溶液的制备：吸取2.00mL〜5.00mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加1滴〜2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和全黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。标准曲线的绘制：吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00pg、5.00^g、10.0^g、20.0pg、40.0pg、60.0pg、80.0pg和100.0^g氮），分别置于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100°C水浴中加热15min。取出用水冷却全室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。试样测定：吸取0.50mL〜2.00mL（约相当于氮＜100pg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。以下按上述中“加4mL乙酸钠-乙酸缓酸溶液（pH4.8）及4mL显色剂……”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。3、特点：本法省去了蒸馏、滴定，简化了操作，无需特殊的仪器与试剂，便于广范应用，为蛋白质的测定提供了凯氏定氮法的简化方法。本法所用消化设备简便，常用，消化时间短，易于推广。本法采用硫酸铵作为铵离子标准溶液，避免引入其它杂质。二、凯氏定氮法1、 测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。2、 测定步骤：试样处理：称取充分混匀的固体试样0.2g〜2g、半固体试样2g〜5g或液体试样10g〜25g（约相当于30mg〜40mg氮），精确至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，全液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热）.5h〜1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。测定：装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1滴〜2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL〜10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH5.4；1份甲基红乙醇溶液与5份漠甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。同时作试剂空白。3、 特点：凯氏定氮法测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大;李宁认为凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法,适用样品广泛，测试结果准确，被国际国内作为法定的标准检验方法。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置，可同时测定几份样品，节省时间，提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定，具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。4、 注意事项：样品在消化时加入浓硫酸的量必须过量，一是脱水作用，将样品中有机物脱水然后碳化成C；二是氧化作用，浓硫酸和硫酸钾、硫酸铜一同加热使温度达400e以上，碳还原硫酸生成SO2,碳本身被氧化成CO2；三是分解作用，将蛋白质分解,SO2还原N生成NH+4,本身被氧化成SO3；四是吸收作用，生成的NH+4与浓硫酸反应生成(NH4)2SO4；五是生成的(NH4)2SO4保存在浓硫酸溶液中不至于损失。样品消化过程要加入催化剂，加入硫酸钾能够提高分解时溶液的温度，使溶液沸点由290e提高到400e,加入硫酸铜、氧化汞和硒粉则能促进试样的分解,缩短消化时间。样品消化过程中，消化液经过一系列改变最终转变为绿色透明状态，这种过程是碳化的有机物完全被氧化变化，但不表示样品中的氮素全部转变为NH+4。三、燃烧法1、 测定原理：试样在900°C-1200°C高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测仪(TCD)进行检测。2、 测定步骤：称取0.1g〜1.0g充分混匀的试样(精确至0.0001g)，用锡箔包裹后置于样

品盘上。试样进入燃烧反应炉（900°C-1200°C）后，在高纯氧（N99.99%）中充分燃烧。燃烧炉中的产物（NOx）被载气CO2运送至还原炉（800C）中，经还原生成氮气后检测其含量。四、滴定法（一）甲?（指示剂）滴定法（一）甲?（指示剂）滴定法1、 测定原理：酸消化液中的铵盐与中性甲醛作用，生成六次甲基四铵，同时释放出定量的酸，用碱标准溶液直接滴定。2、 特点：该法节省试剂，分析速度快操作简便易行。刘玉兰等分别用甲醛滴定法和凯氏定氮法测定棉籽饼、大豆、花生、小麦、玉米和蚕豆等蛋白质含量，结果基本一致，偏差＜0.20。（二）PH滴定法1、 测定原理：pH滴定法是指酸碱滴定至某一制定pH值时，根据滴定剂用量和有关公式计算被测物浓度或含量的方法。它是在水溶液中直接滴定极弱酸碱的最新方法。pH滴定法是将样品中蛋白质消化成（NH4）2SO4，然后用NaOH滴定至指定pH值，再根据有关公式计算样品中蛋白质含量。2、 特点：当滴定浓度不变时,被测组分弱酸（碱）的量直接与滴定剂加入量（体积）成正比，因而不必事先标定滴定剂浓度。该方法必须确定合适的pH值。五、Folin-酚试剂法（Lowry法）1、 测定原理：Folin-酚法是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应，第一步是在碱性条件下蛋白质中的肽键与铜试剂起显色反应,生成蛋白质）铜络合物;第二步是蛋白质）铜络合物上的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸残基将磷钼酸）磷钨酸试剂（酚试剂）还原,生成深蓝色的化合物，其颜色深浅与蛋白质含量呈正相关。2、 特点：Folin-酚法广泛应用于水溶性蛋白质含量的测定°Folin-酚法的灵敏度比双缩脲法高100倍，肽键显色效果增强减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法由于两步呈色反应可以叠加，其灵敏度特别高，所以适于20~250Lg微量蛋白质的测定，可检测的最低蛋白质量达5ug。在测定时应注意，酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此试验的反应只在pH=10时才发生，所以加酚试剂时必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。Folin-酚法试剂配制繁琐耗时。酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和脲素均会干扰反应，但质量分数或体积分数在5%时，尿素、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸、乙醇、乙醚和丙酮对显色无影响，高浓度时必须作校正曲线。六、BCA法1、 测定原理在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与测定试剂中的BCA（bicinchoninicacid,二喹啉甲酸）作用形成紫红色复合物，在562nm处具有最大吸收峰。在一定条件下，此复合物的光吸收强度与蛋白质浓度成正比。2、 特点BCA蛋白质检测试剂是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品，该法快速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数甚小，可检测到0.5ug，是目前已知的最灵敏的蛋白质检测试剂之一。该法操作简单,试剂十分稳定，因此对时间控制不需那么严格。显色后，1h内读A56值无变化。抗试剂十扰的能力强。七、双缩服法1、 测定原理具有两个酰胺基或两个相连的肽键的化合物皆有双缩脲反应！在碱性溶液中双缩脲与CU2+形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色成正比。2、 特点双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为1〜20mg蛋白质。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。双缩脲法在需快速但不需要精确的测定中比较实用，因为Cu2+很容易受到干扰而被还原。参考文献：GB5009.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].顾晓红.蛋白质测定方法[J].黑龙江农业科学，1999(4):40-42.李宁.几种蛋白质测定方法的比较.山西农业大学学报.2006；26(2)；132-134.李存富.关于蛋白质测定中几个问题的理论分析与讨论[J].中国酿造，2004(9):29-30张世军，孙淑斌,李思健.几种蛋白质微量测定方法的比较[J].曲阜师范大学学报，1995,21(32):87-90刘玉兰，李珊，刘坤.食品中蛋白质含量测定方法的改进和应用[J].青岛医学院学报，1999,35(2):123-124杨敏，宋晓锐，罗宗铭.蛋白