培养细胞的生物学特点余莉

内容提要培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察2009/12/04当前第1页\共有179页\编于星期四\16点内容提要培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察2009/12/04当前第2页\共有179页\编于星期四\16点培养细胞的生长方式按生长方式:2型粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才

能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而

在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，

只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞

可在悬浮状态下生长

2009/12/04当前第3页\共有179页\编于星期四\16点一：粘附生长型细胞（较为多见）粘附:是大多数有机体细胞在体内

生存和生长发育的基本存在方式含义:

两方面其一是细胞与细胞之间相互接触其二是细胞与细胞外基质结合结果:基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，

有机体的绝大多数细胞必须

粘附于一固相表面

才能生存和生长。

2009/12/04当前第4页\共有179页\编于星期四\16点培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞。一：粘附生长型细胞（较为多见）2009/12/04当前第5页\共有179页\编于星期四\16点类型

细胞在体内、外的粘附方式：存在差异

体内：粘附是全方位

外形具有复杂的立体特征

体外：多数情况，细胞只有一个附着平面

外形一般与体内时明显不同

一：粘附生长型细胞（较为多见）2009/12/04当前第6页\共有179页\编于星期四\16点按照培养细胞的主要形态,可将其分为成纤维细胞型上皮细胞型游走型细胞多型性细胞2009/12/04当前第7页\共有179页\编于星期四\16点1.成纤维型细胞：(fibroblast)来自中胚层名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核2009/12/04当前第8页\共有179页\编于星期四\16点生长特点:排列成放射状，漩涡状,并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而,单独行动游离的单独的成纤维样细胞常有几个伸长的细胞突起1.成纤维型细胞：(fibroblast)来自中胚层2009/12/04当前第9页\共有179页\编于星期四\16点1.成纤维型细胞：(fibroblast)来自中胚层2009/12/04当前第10页\共有179页\编于星期四\16点2、上皮细胞型(epithliumcelltype)

名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于--来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞

扁平，不规则多角形，中有圆形核2009/12/04当前第11页\共有179页\编于星期四\16点生长特点

易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状

生长时呈膜状移动

很少脱离细胞群而单个活动2、上皮细胞型(epithliumcelltype)

2009/12/04当前第12页\共有179页\编于星期四\16点2、上皮细胞型(epithliumcelltype)

2009/12/04当前第13页\共有179页\编于星期四\16点肺微血管内皮细胞2、上皮细胞型(epithliumcelltype)2009/12/04当前第14页\共有179页\编于星期四\16点2、上皮细胞型(epithliumcelltype)2009/12/04当前第15页\共有179页\编于星期四\16点3、游走型细胞(wanderingcelltype)

特点：在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则,密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。

2009/12/04当前第16页\共有179页\编于星期四\16点

表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞,如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(pffercell)以及某些肿瘤细胞等。在植块培养时,这类细胞最先从植块迁移出来。3、游走型细胞(wanderingcelltype)

2009/12/04当前第17页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第18页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第19页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第20页\共有179页\编于星期四\16点4、多形型细胞(polymorphiccelltype)特点：无规律的形态，如神经细胞。2009/12/04当前第21页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第22页\共有179页\编于星期四\16点新生24小时wistar大鼠皮质神经细胞1.细胞种类：大鼠皮质神经细胞；2.培养的天数：5天；3.放大倍速：倒置显微镜X200倍；4.培养基种类：DEME-F12＋N25.细胞状态与特征简述：神经细胞聚集成球，向外爬行生长，各神经球之间有丰富的神经丝联系。单个神经细胞胞体呈锥形或圆形，树突交错呈网，贴壁生长。2009/12/04当前第23页\共有179页\编于星期四\16点（二）悬浮生长型细胞(suspendedcelltype)

概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团2009/12/04当前第24页\共有179页\编于星期四\16点优点

生存空间大，提供数量大

传代方便(不需消化)

易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)

（二）悬浮生长型细胞(suspendedcelltype)

2009/12/04当前第25页\共有179页\编于星期四\16点胚胎干细胞悬浮培养形成的拟胚体倒置显微镜×20（二）悬浮生长型细胞(suspendedcelltype)

2009/12/04当前第26页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第27页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第28页\共有179页\编于星期四\16点强调：一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。如：反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。细胞在接种时呈三角型状态，经培养一定时间后，细胞在传代前已形成上皮型细胞。

细胞形态受环境的影响2009/12/04当前第29页\共有179页\编于星期四\16点

细胞贴壁延展过程2009/12/04当前第30页\共有179页\编于星期四\16点培养细胞形态不稳定

血清Hela高血清低血清

成纤维细胞样上皮样细胞

pH

Hela太酸或太碱标准pH

成纤维细胞样上皮样细胞

细胞密度3T3低密度高密度

成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变

悬浮或贴附悬浮贴附

圆形成纤维或上皮样

转化与否未转化转化后

成纤维样可成上皮样细胞形态受环境的影响2009/12/04当前第31页\共有179页\编于星期四\16点衰退期细胞2009/12/04当前第32页\共有179页\编于星期四\16点衰退期细胞2009/12/04当前第33页\共有179页\编于星期四\16点内容提要培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察2009/12/04当前第34页\共有179页\编于星期四\16点总的：与体内仍有相似--

体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、

细胞和基质的相互关系但有不同

相对孤立、相对单一

失去原有组织结构和细胞形态

分化减弱或不显

万变不离其宗，入乡随俗1.去分化2.贴壁和铺展3.接触抑制和密度依赖性生长抑制二、培养细胞的生物学特点2009/12/04当前第35页\共有179页\编于星期四\16点1.去分化

细胞分化(celldifferentiation)细胞分化是指在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。分化的结果是在空间上，细胞之间出现差异；在时间上同一细胞和它以前的状态有所不同。从本质上说，细胞分化是从化学分化到形态、功能分化的过程。只有通过细胞分化,才能形成各种不同的细胞,进而形成不同的各具功能的器官,使生物体成为一个个体,否则假如细胞只是长大变多也就是说只有干重的增加而不分化,所有的细胞都只能保持原始的干细胞的状态也就无法形成生物体了。2009/12/04当前第36页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第37页\共有179页\编于星期四\16点培养细胞分化状态的变化

体内细胞--三方面的影响与调节:

体外环境的影响

体内神经—体液因素的调节

细胞与局部微环境的相互作用

控制--

维持着细胞的分化特征。体外培养时，

失去了--

分化特征逐渐减弱

2009/12/04当前第38页\共有179页\编于星期四\16点去分化(脱分化):

是指已分化成熟的细胞和组织倒退分化,返回原始幼稚的状态(逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性)

有2点去分化2009/12/04当前第39页\共有179页\编于星期四\16点1.

去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态

如:高度分化的神经细胞和心肌细胞

已经丧失的增生活性不可能恢复

但已经具备的生物电活动特性

不会完全失去去分化2009/12/04当前第40页\共有179页\编于星期四\16点2.可重新表现出分化特点

如：

把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成

含大量角蛋白丝的角质细胞

内皮细胞--

但，这种能力会随着培养时间延长

逐渐丧失

总之，体外培养,使细胞

结构与功能上的“可塑性”增大

去分化2009/12/04当前第41页\共有179页\编于星期四\16点2.贴附和铺展

2010/11/29当前第42页\共有179页\编于星期四\16点贴附(粘附)和附着

粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求

细胞被接种到培养器皿内以后

首先要发生粘附(adherence)，

是细胞培养以后能否成功的第一步.

细胞悬液后

耽搁得越久，越容易发生退化

提供什么样的生长表面

是细胞能否成功粘附的主要因素。

2009/12/04当前第43页\共有179页\编于星期四\16点

不同细胞的粘附能力不同

如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强

能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面

如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱

需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面粘附能力强的细胞---粘附能力弱的细胞---可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）

分离、纯化细胞贴附(粘附)和附着

2009/12/04当前第44页\共有179页\编于星期四\16点细胞形态

因是否贴附于底物而不同

悬浮的细胞:

基本圆形

粘附和贴壁的细胞:

扁平圆形

相差显微镜

“亮圈”

很快过渡--贴附(粘附)和附着

2009/12/04当前第45页\共有179页\编于星期四\16点贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步

牢固附着—伸展贴附(粘附)和附着

2009/12/04当前第46页\共有179页\编于星期四\16点各种细胞不同如接种30’后…第二瓶30’…(附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞

——上皮细胞——血细胞(最弱)生物因素血清、培养液中的促附着因子

机械，物理等其他因素因素离心：促进附着

流动：培养液流动可阻止细胞附着低温：可抑制附着影响因素2009/12/04当前第47页\共有179页\编于星期四\16点1.包被

对分化程度高、生长能力差的细胞

可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和

生长的生物活性物质如:--

通过其所带电荷先吸附--,培养的细胞再与其结合。

血清内含有多种能够

促进细胞粘附的成分

细胞本身也可能产生一些粘附分子

措施（因素）2009/12/04当前第48页\共有179页\编于星期四\16点2.减少接种时细胞悬液的量

待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少培养液中血清的含量

使培养液黏度降低4.培养液中离子成分及其浓度

如，培养液中的Ca含量过低时不利于

细胞的粘附、贴壁和铺展5.培养液的温度

低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁措施（因素）2009/12/04当前第49页\共有179页\编于星期四\16点铺展

铺展（伸展）(spread)

进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为铺展状况制约细胞的分裂增殖活动

过程，细胞先由圆形变为

圆饼形(放射状铺展细胞)

逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞

极性细胞就是各种有机体细胞

在体外的特征性细胞形态

2009/12/04当前第50页\共有179页\编于星期四\16点铺展状况

是调节细胞形状的主要方面

铺展得越好，细胞越扁

意味着细胞与生长基质表面接触面越大铺展状况

与细胞的生长有密切关系

只有当细胞铺展到合适的程度

DNA合成才开始进行通过比较贴壁依赖性细胞

不同铺展程度与DNA合成率之间的关系

发现细胞越扁(厚度越小)

DNA合成率越高铺展

2009/12/04当前第51页\共有179页\编于星期四\16点合适的细胞形状-伸展

细胞形状(伸展)与细胞的生长对正常细胞的DNA合成重要

对其生长重要伸展的意义2009/12/04当前第52页\共有179页\编于星期四\16点实验一

成纤维细胞

1.附着于玻璃或塑料底物:细胞增殖

2.

悬浮培养:细胞不增殖

3.a.培养在悬浮的玻璃纤维上:

若够长:细胞可增殖

若短于20um,细胞可附着,但增殖很慢

或不增殖

伸展的意义2009/12/04当前第53页\共有179页\编于星期四\16点原因分析

在1.附着培养物上:细胞很扁平,很伸展

在2.悬浮培养中:细胞圆球形,未伸展

在3.培养中:细胞维持介于扁平与圆球之间

因此,细胞形状,至关重要

伸展至原来的形态,才能增殖伸展的意义-实验2009/12/04当前第54页\共有179页\编于星期四\16点

细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状当接触坚硬平面即铺展于底物上，扁平状

与底物形成很多接触点伸展过程2009/12/04当前第55页\共有179页\编于星期四\16点(1)开始阶段开始附着铺开细胞附着于底物球形的细胞，下方表面与底物接触成扁但尚未形成新的伪足伸展分几个阶段2009/12/04当前第56页\共有179页\编于星期四\16点(2)

放射状铺展阶段

在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起

伪足形状

主要柱形丝状:直径0.2-0.5um长10-20

扁平片状:厚0.1-0.5宽2-5

尚有:小泡状叶状:直径1-2

开始时:絲状多

以后:片状增加

伸展分几个阶段2009/12/04当前第57页\共有179页\编于星期四\16点

许多伪足

形成薄的胞质小片牢固贴于底物

胞体中央部分扁

整亇细胞扁平(3)极化阶段

伸展分几个阶段2009/12/04当前第58页\共有179页\编于星期四\16点底物细胞能在很多固体表面附着最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素：活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，

或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上如胶原，聚赖氨酸机械，物理因素附着、伸展的条件2009/12/04当前第59页\共有179页\编于星期四\16点3.接触抑制和密度依赖性生长抑制正常细胞：细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contactinhibition)。肿瘤细胞：没有这种现象，可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使细胞发生堆积(piledup)。由于细胞不断增殖分裂，细胞数量持续增多，培养液的营养成分减少，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Densityinhibition),导致细胞分裂停止。2009/12/04当前第60页\共有179页\编于星期四\16点3.接触抑制和密度依赖性生长抑制2009/12/04当前第61页\共有179页\编于星期四\16点运动的接触抑制

2009/12/04当前第62页\共有179页\编于星期四\16点密度依赖性生长抑制增殖的密度抑制实验方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，

5d细胞计数于加入10％、20％、30％牛血清的

培养液中，结果：

2009/12/04当前第63页\共有179页\编于星期四\16点结果：①10％血清：

20hr后铺满

(汇合confluent)

以后至5d细胞数不再增加

(细胞数约106／6cm皿)

密度抑制30%血清：

以后经常换液至5d，

细胞密度继续增加

(可达6xl06／6cm皿)说明:密度抑制---铺满后

不再增殖(分裂停止)

血清可降低密度抑制密度依赖性生长抑制2009/12/04当前第64页\共有179页\编于星期四\16点只加入于3T3停止生

长的培养液中

细胞不生长当再加入血清

细胞又生长说明

血清可消除密度抑制密度依赖性生长抑制2009/12/04当前第65页\共有179页\编于星期四\16点(2)转化细胞的密度抑制降低①用此培养液

3T3细胞不再分裂增殖②当再加入10％血清，

3T3细胞可再增殖表示血清可消除密度抑制③但当用此培养液，

于转化的3T3细胞

(SV3T3)

却生长良好表示转化细胞密度抑制降低

(血清需要降低)说明：转化细胞的密度抑制降低.

可生长至较高的密度密度依赖性生长抑制2009/12/04当前第66页\共有179页\编于星期四\16点总的说明：①细胞生长有密度抑制②血清可降低密度抑制③转化细胞可降低密度抑制

密度依赖性生长抑制2009/12/04当前第67页\共有179页\编于星期四\16点内容提要培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察2009/12/04当前第68页\共有179页\编于星期四\16点三、培养细胞的生长过程细胞系的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程细胞周期（细胞分裂周期）2009/12/04当前第69页\共有179页\编于星期四\16点体外培养细胞的整个生命活动可分为原(初)代培养期传(继)代培养期衰退期三个时期（一）细胞系的生长过程2009/12/04当前第70页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第71页\共有179页\编于星期四\16点1、原代培养期取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。组织到第一次传代时间大约为1～4周特点：细胞活跃移动,分裂,但不旺盛,多呈二倍体核型。原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。异质性各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloningefficiency)下降，表明细胞独立生存性差。2009/12/04当前第72页\共有179页\编于星期四\16点2、传代培养期初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cellline)特点：细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploidcellline)为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。一般细胞在10代以内冻存。细胞逐渐进入去分化状态。原本成分混杂的培养物中,某一种增殖能力较强的细胞会逐渐处于优势,比例越来越大,而将其它数量较少比例较小的细胞逐渐淘汰掉。2009/12/04当前第73页\共有179页\编于星期四\16点3、衰退期特点：细胞仍生存增殖减慢不增殖轮廓增强衰退凋亡注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期）在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneoustransformation);2009/12/04当前第74页\共有179页\编于星期四\16点细胞可能获得永生性(immortality)或称为恶性(malignancy)。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuouscellline)。而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。2009/12/04当前第75页\共有179页\编于星期四\16点有限细胞系及连续细胞系的特征特征有限细胞系连续细胞系倍性整倍体，二倍体非整倍体，异倍体转化正常永生性，成瘤性停泊依赖性是否接触抑制是否细胞增殖密度抑制是减弱或消失生长方式单层单层或悬浮维持周期性稳定状态血清需求高低克隆形成率低高标志组织特异的标志染色体的，酶的，抗原的标志特殊功能可能保留常常消失生长速率慢快产量地高控制参数代数，组织特异标志株特征2009/12/04当前第76页\共有179页\编于星期四\16点细胞株(CellStrain)

：系用克隆培养、物理分离或其他选择方法分离选择，在培养的细胞群体中获得了已经被确认的某种特殊特征，这样的细胞系被称之为细胞株。2009/12/04当前第77页\共有179页\编于星期四\16点游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）

(二)每代贴附生长细胞的生长过程2009/12/04当前第78页\共有179页\编于星期四\16点细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时游离期：2009/12/04当前第79页\共有179页\编于星期四\16点细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）贴壁期：2009/12/04当前第80页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第81页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第82页\共有179页\编于星期四\16点

潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。(1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见分裂相，细胞有运动活动。(2)初代培养细胞潜伏期约为24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6～24小时。(3)细胞接种密度大潜伏期短。(4)细胞出现分裂相增多时，标志细胞进入指数增生期。潜伏期(latentphase)：

2009/12/04当前第83页\共有179页\编于星期四\16点对数生长期(logarithmicgrowthphase)特点：细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多。细胞分裂指数(mitotieindexMI)：表示每1000个细胞中的分裂相数。条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。2009/12/04当前第84页\共有179页\编于星期四\16点细胞分裂指数：初代细胞：在0.1％～0.5％之间,连续分裂细胞和肿瘤细胞：3～5％。指数增生期是作为细胞一代活力最好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。指数增生期持续3～5天，细胞数量增多后生长空间变小，细胞相互接触可连接成片。对数生长期(logarithmicgrowthphase)2009/12/04当前第85页\共有179页\编于星期四\16点特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。机制：接触抑制、密度依赖性抑制注意：传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传1～2代,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。在这一点上要特别注意。停止期(stagnatephase)／平台期（plateauphase）：2009/12/04当前第86页\共有179页\编于星期四\16点细胞生长曲线2009/12/04当前第87页\共有179页\编于星期四\16点（三）细胞周期（细胞分裂周期）概念：指单个细胞的生长过程，亦指母细胞分裂后形成的细胞到下一代再分裂成两个子细胞之间的时期。细胞周期或者定义为：细胞从一次分裂结束时起，到下一次分裂结束为止的一段时期。

2009/12/04当前第88页\共有179页\编于星期四\16点具有进入细胞周期能力的G0期细胞／静止细胞（Quiescentcell，Q细胞）／休止细胞（Restingcell)最终要死亡的终止分化细胞／终端分化细胞不分裂细胞间期细胞（G1＋S＋G2）有丝分裂期细胞（M）分裂期细胞群体细胞整个细胞周期的组成即为（G1／0＋S＋G2＋M）2009/12/04当前第89页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第90页\共有179页\编于星期四\16点细胞周期可划分为四个阶段2009/12/04当前第91页\共有179页\编于星期四\16点细胞周期调控

2001年10月8日美国人Leland

Hartwell、英国人PaulNurse、Timothy

Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获2001年诺贝尔生理医学奖Leland

Hartwell分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，CDC)，如芽殖酵母的CDC28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。PaulNurse同样发现了许多细胞周期调控基因，如裂殖酵母的CDC2、CDC25。进一步的研究发现cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。Timothy

Hunt1983年首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮细胞间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白(cyclin)。2009/12/04当前第92页\共有179页\编于星期四\16点内容提要培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察2009/12/04当前第93页\共有179页\编于星期四\16点常规观察

培养液的颜色与透明度细胞形态变化细胞污染的观察及防治细胞生长状况2009/12/04当前第94页\共有179页\编于星期四\16点状态好的细胞透明度大，折光性强，轮廓清楚，分裂期细胞多见。状态差的细胞，失去原来的特点，胞质出现空泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。培养液澄清，培养液颜色在指示剂的反映下显示为中性范围。（一）培养液的颜色和透明度2009/12/04当前第95页\共有179页\编于星期四\16点（二）培养细胞的形态观察1、常规采用倒置显微镜观察，最基本有两种形态：2009/12/04当前第96页\共有179页\编于星期四\16点倒置显微镜2009/12/04当前第97页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第98页\共有179页\编于星期四\16点上皮细胞型

来源于内、外胚层的细胞，如皮肤、乳腺、肝、肺泡、消化道上皮、形态为扁平的多角型、胞质近中有圆形细胞核，生长特点为细胞之间紧密相靠，互相衔接，具有连成片的能力。2009/12/04当前第99页\共有179页\编于星期四\16点成纤维细胞型

来源于中胚层的细胞，如纤维结缔组织，平滑肌、心肌，血管内皮细胞，形态具有长短不等的数个细胞突起，成棱形、不规则三角型。核为卵圆形，位于靠近胞质的中央，。生长特点为细胞排列为漩涡状、放射状、或栅栏状。2009/12/04当前第100页\共有179页\编于星期四\16点相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。2、活细胞的观察2009/12/04当前第101页\共有179页\编于星期四\16点(三)细胞生长状况的观察2010/11/29当前第102页\共有179页\编于星期四\16点1、细胞计数它是了解细胞生长状态的量化指标制备细胞悬液，密度不低于10000细胞／ml，用10×物镜观察计数板四角大方格的细胞数。计数：细胞数／ml原液＝（4大格细胞数之和÷4）×10000注意要点：细胞分散均匀制成单个细胞悬液；计数时数上不数下；数左不数右。2009/12/04当前第103页\共有179页\编于星期四\16点

一个血球计数器含有两个chamber。每一chamber中有九个1mm2的大方格，且chamber高度为0.1mm，所以每一个大方格的体积为0.1mm3。2009/12/04当前第104页\共有179页\编于星期四\16点细胞多于1000个/mm32009/12/04当前第105页\共有179页\编于星期四\16点2、培养细胞活力测定任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。2009/12/04当前第106页\共有179页\编于星期四\16点2、培养细胞活力测定--台盼蓝法

活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。2009/12/04当前第107页\共有179页\编于星期四\16点培养细胞活力测定---伊红Y(EosinY)

细胞悬液与7倍量的0.15%伊红Y染液（生理盐水配制）混合2分钟后镜检，死细胞为桃红色。2009/12/04当前第108页\共有179页\编于星期四\16点2、细胞活力测定---MTT比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。2009/12/04当前第109页\共有179页\编于星期四\16点（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线操作步骤2009/12/04当前第110页\共有179页\编于星期四\16点（四）细胞污染观察与防治CELLCULTURECONTAMINATION2009/12/04当前第111页\共有179页\编于星期四\16点简介introduction凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性2009/12/04当前第112页\共有179页\编于星期四\16点细胞污染的分类物理污染化学污染生物污染（支原体污染）提纲outline控制污染掌握良好的无菌操作技术建立细胞库合理应用抗生素保持工作区清洁建立良好的规章制度检测细胞污染2009/12/04当前第113页\共有179页\编于星期四\16点温度孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置放射线试剂周围不能放同位素振动孵箱周围不能放引起振动的设备辐射试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中物理污染Physicalcontamination2009/12/04当前第114页\共有179页\编于星期四\16点化学污染血清培养液及试剂水培养用器皿孵箱化学污染chemicalcontamination2009/12/04当前第115页\共有179页\编于星期四\16点化学污染chemicalcontamination培养液及试剂选用纯度最高的试剂经过权威机构认定正确的储存方法血清新购买的血清用之前要试应选用同一批次的血清2009/12/04当前第116页\共有179页\编于星期四\16点实验试剂：缩写为LR，又称四级试剂。

化学纯试剂：缩写为CP，又称三级试剂，一般瓶上用深蓝色标签。

分析纯试剂：缩写为AR，又称二级试剂，一般瓶上用红色标签。

保证试剂：缩写为GR，又称一级试剂，一般瓶上用绿色标签（又称优级纯）2009/12/04当前第117页\共有179页\编于星期四\16点水用来配液和清洗容器传统用双蒸和三蒸水现在用纯水仪millipore超纯水放置过久纯度下降化学污染chemicalcontamination2009/12/04当前第118页\共有179页\编于星期四\16点容器生产过程中有毒物质残留消毒剂和清洗剂的残留铝箔和包裹纸残留化学污染chemicalcontamination孵箱co2混有有毒气体消毒剂和清洗剂的残留2009/12/04当前第119页\共有179页\编于星期四\16点生物污染biologicalcontamination生物污染外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、细菌、支原体和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染容易发现的生物污染包括细菌、霉菌和酵母菌不容易被发现的生物污染包括病毒、原虫、昆虫、支原体和其它细胞系2009/12/04当前第120页\共有179页\编于星期四\16点生物污染biologicalcontamination对实验人员是一个潜在的危险因素细胞系交叉污染污染在这是个错误的用词难于发现若出现传代细胞的生长速度异常，考虑交叉污染同一时间只传同一种细胞每种细胞要有单独的液体建立细胞库每三个月更换一次细胞支原体污染细菌、霉菌和酵母无抗生素污染易被发现抗生素存在易造成隐性污染隐性污染引起严重后果病毒最难发现和清除严格的宿主性自限性2009/12/04当前第121页\共有179页\编于星期四\16点细菌与真菌的污染2010/11/29当前第122页\共有179页\编于星期四\16点细菌污染检测肉眼直接观察法：培养液浑浊或细胞生长缓慢。培养检查法：用肉汤培养基或琼脂培养基37度培养待检样品数日，观察肉汤培养基有无浑浊，或琼脂培养基有无菌落形成。显微镜观察法：镜下可见大量菌体细菌与真菌的污染2009/12/04当前第123页\共有179页\编于星期四\16点真菌污染的检测肉眼直接观察法：大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面显微镜观察法：镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错。念珠菌或酵母菌形态呈卵圆形。细菌与霉菌的污染2009/12/04当前第124页\共有179页\编于星期四\16点细菌与真菌的污染常见污染的细菌有革兰阴性菌如：大肠埃希菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有葡萄球菌、枯草杆菌等.真菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有意物质杀死细胞。镜下可见脑浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。2009/12/04当前第125页\共有179页\编于星期四\16点

霉菌污染容易发现，大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。2009/12/04当前第126页\共有179页\编于星期四\16点常见真菌形态2009/12/04当前第127页\共有179页\编于星期四\16点真菌污染的成纤维细胞2009/12/04当前第128页\共有179页\编于星期四\16点白假丝酵母菌污染

2009/12/04当前第129页\共有179页\编于星期四\16点细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。2009/12/04当前第130页\共有179页\编于星期四\16点支原体（杂草）支原体污染biologicalcontamination2009/12/04当前第131页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第132页\共有179页\编于星期四\16点支原体（杂草）支原体污染biologicalcontamination污染严重难发现难去除显微镜看不到不引起培养液浑浊和PH改变营养要求高不容易用传统的微生物培养法检测到不能通过过滤清除大多数抗生素对其无效2009/12/04当前第133页\共有179页\编于星期四\16点支原体污染来源人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体，操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。牛血清中能分离到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源2009/12/04当前第134页\共有179页\编于星期四\16点支原体污染危害1）杂交瘤技术

1融合细胞无分泌单抗的能力

2杂交瘤细胞产生的单抗不是针对靶抗原，而是针对支原体

3支原体消耗胸腺嘧啶，干扰HAT*筛选

4在HAT筛选过程中丧失了杂交瘤细胞2）细胞遗传学

1造成羊水污染

2姊妹染色单体交换增多

3染色体随机断裂和畸变增多

4产生额外的染色体

5干扰羊水培养的结果

6精子污染后受精能力下降

7染色体数目减少2009/12/04当前第135页\共有179页\编于星期四\16点3）病毒学

1转录酶活性下降

2干扰某些逆转录病毒的分离

3降低禽痘病毒的感染力及空斑的形态

4诱导人单核细胞产生干扰素

5抑制腺病毒的增殖

6诱导小鼠脾细胞产生干扰素

7污染病毒疫苗

8引起巨细胞病毒及带状病毒形成假空斑

9降低腺病毒及SV40胸腺嘧啶的掺入

10抑制腺病毒和单纯疱疹病毒的增殖

11抑制脊髓灰质炎病毒和牛痘病毒的增殖

12支原体与病毒在蔗糖梯度离心中共沉淀

13抑制新城病病毒（NDV）产生干扰素

支原体污染危害2009/12/04当前第136页\共有179页\编于星期四\16点4）代谢

1降低鸟氨酸脱羧酶的产生

2降低蛋白质和RNA的产生

3消耗培养液中的精氨酸

4改变尿苷／尿氨酸的比例

5降低DNA和RNA的合成

6增加胸腺嘧啶的降解

7诱导3T3细胞产生胶原酶

8增加致癌物诱导芳香烃羟化酶的产生

9促进淋巴瘤细胞的增殖

10降低嘌呤替代途径

11降低ATP水平5）生物反应性引起鼠的淋巴细胞发生转化支原体污染危害2009/12/04当前第137页\共有179页\编于星期四\16点支原体污染检测由于支原体污染并不引起细胞外观的明显变化，故常规的支原体检测非常必要的。人们可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。因此，有必要对不同检测方法的灵敏度及局限性有所了解。

2009/12/04当前第138页\共有179页\编于星期四\16点支原体检测方法支原体污染检测biologicalcontamination方法敏感性优点缺点直接DNA染色(如Hoechst33258)低快速，便宜需要荧光显微镜结果不易解释指示细胞上间接DNA染色(如

Vero)中放大污染结果易解释费时免疫荧光单克隆抗体易操作灵敏需要荧光显微镜肉汤和琼脂培养高灵敏慢需要专业解释ELISA中快速检查种类有限PCR中-高特异性强快速需要PCR设备2009/12/04当前第139页\共有179页\编于星期四\16点直接培养法是最敏感的，但也是最耗时的检测方法，大约需28天。从理论上讲，只需一个有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照，而且耗时，操作繁琐，因而不适于大多数实验室。支原体检测方法2009/12/04当前第140页\共有179页\编于星期四\16点间接检测法包括：PCR、ELISA、电子显微镜检查、DNA探针、DNA荧光染色及生化分析法等。间接法能检测到107／L的滴度。通常情况下，支原体污染后其滴度一般超过109／L，故尽管间接法不敏感，但相对较精确。由于支原体的多样性，表达不同特异性的抗原及酶，为生化及免疫检测法带来技术上的困难。在选择PCR、DNA探针等方法前，应考虑好选择合适的靶序列及引物序列。

支原体检测方法2009/12/04当前第141页\共有179页\编于星期四\16点DNA荧光染色法原理︰利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA的(A-T)rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而得以检测。被支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体之污染。2009/12/04当前第142页\共有179页\编于星期四\16点细胞DNA支原体DNA荧光染色法2009/12/04当前第143页\共有179页\编于星期四\16点阳性阴性DNA荧光染色法2009/12/04当前第144页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第145页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第146页\共有179页\编于星期四\16点DNA荧光染色法质控与提示（1）标记的靶细胞除CKI－1和vero细胞外，3T6细胞（ARCCCCL96）也可使用。本法成功的要点之一是用作靶细胞质控的管理应严格，必预先确认该细胞无支原体的污染才能冻存使用。（2）要明确本检体的结果判定，必须使用不含抗生素的培养液。（3）染色液：Hoechst染液不稳定，故每次检测前须新鲜配制，使用DAPI也可以，均应新鲜配制。2009/12/04当前第147页\共有179页\编于星期四\16点（4）试验检体：被试细胞回收时用橡胶刮匙刮下，不能用胰蛋白酶等水解酶类消化，制备好的检体细胞保存在－80℃冰箱中可存放数月。（5）阳性对照：本试验采用支原体M.hyorhinis和M.orale为阳性对照，要十分注意避免有新的污染源。DNA荧光染色法质控与提示2009/12/04当前第148页\共有179页\编于星期四\16点（6）特异性与敏感性：本法不是支原体的特异性检出法，对DNA进行染色观察，对其他微生物（细胞内寄生的霉菌、细菌等）的污染，也可看出同样的荧光染色。本法针对这些支原体污染的检出敏感度为1cfu，而一般污染细胞中的支原体浓度为103－108cfu/mL，故本法仍具有很好的实用性。DNA荧光染色法质控与提示2009/12/04当前第149页\共有179页\编于星期四\16点DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原体检测的金标准。美国、加拿大和欧共体国家生物制药及诊断的监督机构推荐使用这种方法。其基本原理在于利用不同的技术，多次检测，以弥补各种检测技术的缺陷，增加检测结果的可信度。

DNA荧光染色法质控与提示2009/12/04当前第150页\共有179页\编于星期四\16点PCRkit-Fisher,Strategene,Sigma2009/12/04当前第151页\共有179页\编于星期四\16点分子量对照2阴性对照3-8原有细胞的悬液9阳性对照VenorGeM试剂盒2009/12/04当前第152页\共有179页\编于星期四\16点细胞系交叉污染2009/12/04当前第153页\共有179页\编于星期四\16点细胞系交叉污染2009/12/04当前第154页\共有179页\编于星期四\16点生物污染控制biologicalcontamination树立“预防为主”的思想保证细胞来源干净确保基质和器材无菌严格无菌操作细胞培养时避免交谈操作结束时消毒台面每传15代的细胞应更换所有细胞培养材料丢弃前应高压消毒2009/12/04当前第155页\共有179页\编于星期四\16点控制污染controlcontamination良好的无菌操作合理利用抗生素建立细胞库保持工作区清洁良好的规章制度细胞污染的检测2009/12/04当前第156页\共有179页\编于星期四\16点良好的无菌操作所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌避免溢出、溅出和气溶胶；吸入或吸出液体时避免倾倒；吸入或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口；液体应分装并置4-8oC保存；每种细胞应使用单独的液体；清洁区和污染区的材料应单独处理；控制污染controlcontamination2009/12/04当前第157页\共有179页\编于星期四\16点合理利用抗生素过度依赖抗生素会使人们忽略无菌操作滥用抗生素常导致耐药菌的产生牢记抗生素不能代替无菌操作控制污染controlcontamination2009/12/04当前第158页\共有179页\编于星期四\16点建立细胞库减少从主管单位获得细胞的运输费冻存的细胞生物性状不发生改变消除了隐蔽污染的潜在危害控制污染controlcontamination2009/12/04当前第159页\共有179页\编于星期四\16点2009/12/04当前第160页\共有179页\编于星期四\16点良好的规章制度只有相关人员才可进入细胞培养区细胞培养区必须和其他区域分开每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处理细胞时避免不必要的走动细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染控制污染controlcontamination2009/12/04当前第161页\共有179页\编于星期四\16点控制污染controlcontamination保持工作区清洁常规清洗地面和台面CO2孵箱每2-3个月消毒清洗孵箱所有溅出或溢出的液滴应立即擦拭并消毒每周孵箱内水盘需彻底消毒清洗定期清洁水浴箱生物安全柜每次使用后应清洁和消毒安全柜的内表面定期消毒安全柜工作面下层的盘子；及时清理废弃物，高压感染材料2009/12/04当前第162页\共有179页\编于星期四\16点控制污染controlcontamination细胞污染的检测支原体的检测其它生物污染的检测使用传统的微生物学检测方法化学污染的检测常被误认为生物污染要靠逐一替换的方法确定化学污染的来源2009/12/04当前第163页\共有179页\编于星期四\16点1）使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗。

清除污染方法controlco