第六章生长繁殖及其控制(修改)

第六章微生物的生长第一节微生物的生长繁殖第二节环境因素对微生物生长的影响第三节有害微生物的控制一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内每个个体的进一步生长群体的生长群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）微生物生长:在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。生物个体细胞原生质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大(或重量增加)

的生物学过程。生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。单细胞微生物的生长以群体细胞数目的增加为标志丝状微生物（霉菌和放线菌等）的生长表现为菌丝的伸长和分枝，其生长通常以菌丝的长度、体积和重量的增加来衡量，只有通过形成无性孢子或有性孢子使其个体数目增加才称为繁殖。

一、测生长量

（一）测生长量直接法测体积法：粗放型，在刻度离心管中测沉降量称干重法：精确型，离心法和过滤法获得菌体细胞，微生物的干重一般为其湿重的10％～20％。测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法第一节测定生长繁殖的方法1.比浊法

用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用450～650nm波段。（二）间接法2.生理指标法

微生物的生理指标，如氮、碳、DNA、ATP等物质的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。二、计繁殖数测定繁殖，一定要一一计算各个体的数目。单细胞状态的细菌和酵母菌放线菌和霉菌等丝状生长的微生物计算其孢子数计算各个体的数目1.计数板直接计数法

指采用计数板（细菌计数板或血细胞计数板），在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。计算一定容积里样品中微生物的数量！（一）直接法平板菌落计数法

可用浇注平板（pourplate）或涂布平板（spreadplate）等方法进行。此法适用于各种好氧菌或厌氧菌。（二）间接法液体稀释法测定生长繁殖的方法计繁殖数测生长量间接法直接法间接法直接法测体积法称干重法比浊法生理指标法测含碳量测含氮量其他（P、ATP）计数板直接计数法染色后活菌计数法比例计数法过滤计数法平板菌落计数法膜过滤培养菌落计数法厌氧菌的菌落计数法一、微生物的同步培养P168同步培养：是使微生物群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞的一种培养方法。其生长曲线呈阶梯状。硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法第二节微生物的个体的生长与同步生长1.机械方法密度梯度离心分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜洗脱法一、微生物的同步培养图4-4同步培养方法A.膜洗脱法；B.密度梯度离心法同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。2.环境条件诱导法温度培养基成分控制其他（加代谢抑制剂，光照、黑暗交替，加热处理等）由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。二、单细胞微生物的典型生长曲线将少量单细胞纯培养物接种到恒定容积新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可以画出一条由延滞期、对数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。生长曲线(growthcurve):定量描述液体培养基中细菌群体生长规律的实验曲线。单细胞微生物的生长以群体细胞数目的增加为标志。研究细菌群体生长规律通常采用分批培养。细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图见P164根据细菌生长繁殖速率的不同，可将曲线大致分为:

延迟期、对数期、稳定期与衰亡期4个阶段

微生物的典型生长曲线见P164（一）迟缓期(Lagphase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。分裂迟缓、代谢活跃①细胞分裂迟缓，生长速率常数R为零；②细胞体积和重量增长快，使细胞形态变大或细胞长轴伸长，细胞质均匀，贮藏物质消失；③蛋白质和DNA、RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；④合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，容易产生各种诱导酶等。⑤对不良环境因素如高温、低温和高浓度的盐溶液及抗生素等理、化因素比较敏感，容易死亡。细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。迟缓期的特点：迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。（见P164）调整代谢迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。微生物的典型生长曲线影响延迟期长段的因素1.接种龄2.接种量3。培养基的成分在生产实践中缩短迟缓期的常用手段（见P164）(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量。微生物的典型生长曲线（二）对数生长期(Logphase)：对数期又称指数期。细菌细胞经过延迟期的调整后，细胞数以几何级数增加，

即以20→21→22→23→24→…2n增长的一段时间，这段时期称对数期。在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。代时通常以G表示。(1)繁殖代数(n)

如果在时间t1时菌数为x1，经过一段时间为t2时，繁殖n代后菌数为x2，则：x2=x1·2n

以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2

∴n=(lgx2–lgx1)/lg2=3.322(lgx2-lgx1)(2)生长速率常数(R)

：

R=n/t2-t1=3.322(1gx2-lgx1)/t2-t1(3)世代时间(G)

G=1/R=t2-t1/3.322(1gx2-lgx1)

影响微生物增代时间（代时）的因素：1）菌种:不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同2）营养成分:在营养丰富的培养基中生长代时短3）营养物浓度:在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，凡处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的某营养物成分，就称为生长限制因子。4）温度:在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关①细胞快速分裂，生长速率常数R最大，细胞每分裂一次所需世代时间(简称代时，又称增代时间)最短而稳定；②菌体平衡生长，其个体形态、细胞化学组成和生理特征比较均匀一致；③酶活力高而稳定，代谢旺盛。对数生长期的群体细胞是研究微生物基本代谢的良好材料。发酵工业上，以对数期的种子接种可以缩短迟缓期，并采用连续发酵的措施尽量延长对数期，可以提高发酵生产力。此期菌体较典型，抵抗力较强，灭菌不如迟缓期容易。对数生长期的特点：纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。产生原因：由于营养物质不断被消耗，酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积和pH、氧化还原电位等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率R降低直至零。(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。（三）稳定生长期(Stationaryphase)：①生长速率常数R等于零，活菌数保持相对稳定并达到最高水平，菌体产量也达到最高点；②细菌分裂速率降低，代时逐渐延长，细胞代谢活力减退，开始出现形态和生理特征的改变；③细胞内积累贮藏物质，如肝糖粒、异染颗粒、脂肪粒等；④多数芽孢细菌在此阶段形成芽孢；⑤许多重要的发酵代谢产物主要在此期大量积累并达到高峰。例如，某些放线菌在此期开始以初生代谢物作前体，通过次生代谢途径合成大量的抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。稳定生长期的特点：活细菌数最高并且稳定，是发酵生产收获的重要时期储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。稳定期对生产实践的指导特点：细胞重要的分化调节阶段：延长稳定期可以获得更多的菌体物质或代谢产物。生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。生产措施：稳定期过后，营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出“负增长”此阶段称衰亡期。（四）衰亡期(Decline或Deathphase)：①细胞形态发生改变，呈现多种形态，有时产生畸形；②细菌代谢活力降低，细菌衰老并出现自溶，释放代谢产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。

③有些G+细菌染色反应变为阴性；④有的细菌进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；而芽孢杆菌在此期释放芽孢。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。衰亡期的特点：研究生长曲线对研究工作和生产实践有指导意义。◆在研究细菌的代谢和遗传时，需采用生长旺盛的对数期的细胞；◆在发酵生产方面，使用的发酵剂最好是对数期的种子接种到发酵罐内，几乎不出现迟缓期，控制延长在对数期，可在短时间内获得大量培养物(菌体细胞)和发酵产物，缩短发酵周期，提高生产率。研究细菌生长曲线的意义三、微生物的连续培养P1691.连续培养的概念分批培养：培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养：当微生物培养到对数生长期时，在培养容器中以一定的速度连续流入新鲜培养基，同时以相同的速度连续流出培养物(菌体和代谢产物)，使细胞数量和营养状态达到动态平衡的一种培养方法。连续培养的基本原则：培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。第一节微生物的生长繁殖四、微生物的连续培养P169图4-5单批培养与连续培养的关系

1.连续培养的概念分批培养：在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。连续培养：微生物可长期保持在对数生长期的平衡生长状态的微生物培养方法。第一节微生物的生长繁殖(1)恒浊器测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；P171用途：用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物的生产2.连续培养装置的类型第一节微生物的生长繁殖(2)恒化器P171控制某种限制性营养物质的浓度和培养基的流速，来保持细胞生长速率恒定和培养液的流速不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置2.连续培养装置的类型第一节微生物的生长繁殖在恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量。细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率限制性因子:必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。(2)恒化器第一节微生物的生长繁殖通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物用途：多用于科研遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型；2.连续培养装置的类型P168三、微生物的连续培养恒化器：外控制培养液流速恒定

连续培养器按控制方式分恒浊器：内控制菌体密度恒定

按培养器串联级数分按细胞状态分按用途分单级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器小型连续培养器（实验室科研用）大型连续发酵罐（发酵生产用）P1713.连续培养的特点优点：（1）微生物以恒定的速率生长，有利于研究生长速率(或营养物质)对细胞形态、组成和代谢活动的影响，可筛选出新的突变株；（2）连续培养在生产上可缩短生产周期，减少非生产时间，提高设备利用率，便于自动化生产。已成为当前发酵工业的方向。缺点：营养物质利用率和产物浓度一般低于分批培养，且容易杂菌污染和菌种易衰退。第一节微生物的生长繁殖（1）营养基质六大营养要素：适宜的水分、碳源、能源、氮源、矿物质，必需的生长因子（2）温度多数细菌最适温度在20～40℃之间。（3）氢离子浓度(pH)多数细菌生长的最适pH为6.5～7.5

（4）渗透压在一定浓度的等渗溶液中生长繁殖

（5）呼吸环境根据呼吸类型，给予适宜的呼吸环境。

P1631.细菌生长繁殖的条件第三节影响微生物生长的环境因素对各种微生物的代谢过程产生影响，改变其生长速率。温度对微生物生长的影响具体表现在：①影响酶的活性。②影响细胞膜的流动性。③影响物质的溶解度。④影响机体生物大分子的活性。物理因素对微生物生长的影响物理因素：有温度、水分、渗透压、辐射和氧化还原电位等。一.温度低温型(专性嗜冷菌、兼性嗜冷菌)、中温型(嗜温菌)高温型(嗜热菌、超嗜热菌)每个类群又可分为生长温度三基点：最低温度最适温度最高温度1.温度生长的根据微生物最适生长温度范围不同分为：（1）微生物生长活动的温度类群

微生物类型生长温度/℃最低最适最高专性嗜冷微生物(psychrophiles)-105～1515～20兼性嗜冷微生物(psychrotrophiles)-5～010～2025～30嗜温微生物(mesophiles)10～2020～4040～45嗜热微生物(thermophiles)4550～6080超嗜热微生物(hyperthermophiles)6580～95100以上1.温度（1）微生物生长活动的温度类群①嗜冷微生物(又称低温型微生物)

嗜冷微生物：-10～20℃能生长，最适在10～15℃生长；兼性嗜冷菌：最适20℃，最高30℃或更高。专性嗜冷菌：最适15℃以下，最高20℃，最低0～-12℃例如：假单胞菌、乳酸杆菌和青霉等兼性嗜冷菌于低温(0～7℃)生长，引起冷藏食品变质。低温下生长机理：酶活性；细胞膜中不饱和脂肪酸含量1.温度（1）微生物生长活动的温度类群

②嗜温微生物(又称中温型微生物)

嗜温微生物：10～45℃能生长，最适在20～40℃生长；体温菌：最适37℃室温菌：最适25℃以下例如：土壤微生物和植物病原菌均属于室温菌。温血动物和人体中的病原菌，以及引起食品腐败变质菌类和发酵工业用菌种均属于体温菌。1.温度③嗜热微生物(又称高温型微生物)

嗜热微生物：45℃以上能生长，最适在50～60℃生长；兼性嗜热菌：37℃能生长，最适55℃专性嗜热菌：37℃不能生长，最适55℃在罐头工业中，嗜热菌常给食品杀菌带来麻烦。但在发酵工业中，如能筛选到嗜热菌作为生产菌种，可以缩短发酵时间，防止杂菌污染。工业上常用的德氏乳酸杆菌就属于此类，其最适生长温度为45～50℃。1.温度（1）微生物生长活动的温度类群

③嗜热微生物(又称高温型微生物)嗜热微生物能在高温下生长机理：①菌体内的酶和蛋白质更抗热；②能产生多胺、热亚胺和高温精胺，有稳定核糖体结构和保护大分子免受高温的损害；③核酸具有较高的热稳定性结构；④细胞膜含有较多饱和脂肪酸在高温下保持膜的半流动状态⑤在较高温度下嗜热菌的生长速率较快，能及时弥补被热损伤的大分子物质。1.温度（2）微生物生长速率和温度的关系常以温度系数Q10来表示，即温度每升高10℃后的微生物的生长速率与微生物未升高温度前的生长速率之比。即：多数微生物的温度系数Q10值为1.5～2.5，即在一定的温度范围内，温度升高10℃，微生物生长速率增快1.5～2.5倍。温度系数Q10=1.温度二、氧气根据微生物的呼吸作用不同，所含的呼吸酶系统是否完全，作为最终电子受体的物质是否是氧，以及微生物与分子氧的关系不同，

分成好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌、微好氧菌和专性好氧菌五种呼吸类型。

(1)耐氧菌(aerotolerantanaerobe)

有氧条件下进行厌氧生活，生长不需要氧，分子氧对它们无毒；

它们没有呼吸链，

细胞内有超氧化物歧化酶(SOD，superoxidedismutase)和过氧化物酶，

但无过氧化氢酶；靠专性发酵获得能量。

乳酸菌多数是耐氧菌。例如乳酸乳球菌乳酸亚种、粪肠球菌、乳酸乳杆菌以及肠膜明串珠菌等；(2)厌氧菌(anaerobe)

有一般厌氧菌和专性厌氧菌之分。

此类菌只能在无氧或低氧化还原电位的环境下生长，

分子氧对它们有毒，即使短期接触空气，也会抑制其生长甚至死亡；它们缺乏完整的呼吸酶系统，缺乏SOD和细胞色素氧化酶，多数还缺乏过氧化氢酶；

靠发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供所需能量。常见的厌氧菌有梭菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、消化球菌属、瘤胃球菌属、韦荣氏球菌属、脱硫弧菌属、甲烷杆菌属等。其中多数产甲烷细菌是极端厌氧菌。

(3)兼性厌氧微生物(facultativeaerobe)

此类菌在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好；

它们具有需氧菌和厌氧菌的两套呼吸酶系统，

细胞含SOD和过氧化氢酶；

有氧时靠有氧呼吸产能，无氧时籍发酵产能。

许多酵母菌、肠道细菌、硝酸盐还原菌(如脱氮小球菌)，人和动物的病原菌均属此类菌。

肠杆菌科的各种细菌包括大肠杆菌、产气肠杆菌和普通变形杆菌(Proteusvulgaris)等都是常见的兼性厌氧菌。(4)微好氧微生物(microaerophilicbacteria)

此类菌在有氧和绝对厌氧条件均不能生长，只能在较低的氧分压下才能正常生长；

它们具有完整的呼吸酶系统，

通过呼吸链并以氧为最终氢受体，

在(1～3)×103Pa大气压下进行呼吸产能。

例如霍乱弧菌、发酵单胞菌属、氢单胞菌、以及少数拟杆菌属的种等属于此类菌。在摇瓶培养时，菌体生长于液面以下数毫米处。

(5)专性好氧菌(strictaerobe)

必须在有分子氧存在的条件下才能生长；

它们具有完整的呼吸酶系统，

细胞含SOD和过氧化氢酶，

通过呼吸链并以分子氧作为最终氢受体，

在正常大气压(2×104Pa)下进行好氧呼吸产能。

多数细菌、放线菌、真菌属于此类菌。

一般实验室和工业生产上常用摇瓶振荡或通气搅拌供给充足的氧气。

厌氧菌的氧毒害机制

1971在McCord和Fridovich提出SOD的学说:

他们认为，厌氧菌因缺乏SOD，故易被生物体内产生的超氧阴离子自由基而毒害致死;

好氧菌因为细胞有SOD，剧毒的•O2-就被歧化成毒性稍低的H2O2，而后被过氧化氢酶分解为无毒的H2O。

厌氧菌因为不能合成SOD，又无H2O2酶，故无法使•O2-歧化成H2O2而被•O2-毒害致死。

在有氧存在时形成的•O2-就使其自身受到毒害。

多数耐氧菌都能合成SOD，且有过氧化物酶，故剧毒的•O2-可先歧化成有毒的H2O2，然后被过氧化物酶还原成无毒的H2O。即：过氧化氢酶

对于兼性厌氧的E.coli，如果使之发生缺乏SOD的突变，它即成为“严格厌氧菌”，即E.coli短期接触氧被毒害致死.

SOD能清除生物体内的•O2-而受到医药界的极大关注。外源SOD具有保护DNA、蛋白质和细胞膜的作用，使它们免遭•O2-的破坏。对治疗类风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、皮肤炎、红斑狼疮等疾病疗效较好，对辐射有保护作用。，

还发现SOD还具有防治人体衰老、抗癌、治疗肺气肿以及解除苯中毒等一系列疗效。同时，不管何种给药方式，均无发现任何副作用。因此，它是一种很有前途的药用酶。

氢离子浓度可表示为环境或培养基中的pH值。（1）微生物生长的pH范围

微生物存在最低、最适和最高生长pH值。微生物种类最低pH最适pH最高pH细菌放线菌酵母菌霉菌3.0～5.05.02.0～3.01.0～3.06.5～7.57.5～8.55.0～6.05.0～6.08.0～10.010.07.0～8.07.0～9.0表4-10微生物生长的pH范围

三.氢离子浓度化学因素对微生物生长的影响主要还有氢离子浓度和氧化还原电位。（2）pH对微生物的作用

①影响微生物对营养物质的吸收。②影响代谢反应中各种酶的活性。③不同pH还可引起代谢途径的变化。④pH的变化引起细胞一些成分的破坏。⑤影响环境中有害物质如消毒剂的电离度，从而影响消毒剂对微生物的毒性。1.氢离子浓度第二节环境因素对微生物生长的影响环境中Eh值与氧分压和pH值有关。标准氧化还原电位(Eh’)是pH=7时测得的Eh

。氧化能力强的物质具有较高的Eh，还原能力强的物质具有较低的Eh。在自然环境中，Eh’上限是＋0.82V(环境中存在高浓度O2)，Eh’的下限是-0.42V(富含H2的环境)。好氧菌：Eh+0.1V以上生长，以Eh为+0.3～+0.4V时为适宜；厌氧菌：Eh+0.1V以下生长。兼性厌氧菌：+0.1V以上进行有氧呼吸，+0.1V以下进行发酵微好氧菌：如乳酸杆菌和乳酸乳球菌等，在Eh稍偏低时，大约在+0.05V左右生长良好。第二节环境因素对微生物生长的影响2.氧化还原电位(Eh)P：在一定温度下基质(食品)水分所产生的蒸汽压水活度指食品中可被微生物实际利用的自由水或游离水的含量。水活度用Aw表示。定义是：在相同温度和压力下，食品的蒸汽压与纯水蒸汽压之比。即：Aw最大值为1，最小值为0。若基质的Aw值低于微生物生长的最低Aw时，微生物就停止生长。Aw=Po：在与P相同温度下纯水的蒸汽压。四.水分（1）水活度的概念微生物最低Aw值范围多数细菌0.900.90～0.99多数酵母菌0.870.87～0.91多数霉菌0.800.80～0.87嗜盐性细菌0.75

耐高渗透压酵母0.600.60～0.65干生性(耐旱)霉菌0.650.65～0.75假单胞菌0.97

大肠杆菌0.96

枯草芽孢杆菌0.95

产气肠杆菌0.945

肉毒梭菌0.93

金黄色葡萄球菌0.86

（2）微生物生长需要的水分活度各种微生物生长繁殖的在Aw范围在0.99～0.60之间。细菌Aw值均大于0.90；多数酵母菌生长Aw值在0.87～0.91；多数霉菌最低Aw值为0.80；当Aw值降至小于0.65时，一般微生物停止生长繁殖。（2）微生物生长需要的水分活度（3）环境相对湿度影响食品的水活度当食品的Aw与环境的相对湿度平衡时，此时食品的Aw为：Aw=R.H/100或R.H=100×Aw（4）食品保藏与水分活度的关系保藏食品常用加糖、加盐，冰冻、脱水干燥等方法降低Aw，延长了这些食品的保藏期。（5）微生物生长所需要的水活度值的可变性环境温度、有氧与无氧、pH值、某些有害物质的存在（6）高渗透压食品的水活度能引起高糖食品变质的微生物，只是少数酵母和丝状真菌，它们生长的最低Aw值都比较低，

如将微生物置于高渗溶液中，细胞内的水分渗透到细胞外，则细胞原生质因脱水收缩而发生质壁分离现象，造成细胞代谢活动呈抑制状态甚至死亡。总体来说，低渗对微生物的作用不太明显，而高渗对其生长有明显影响。（3）.渗透压第四节微生物培养法自学第五节有害微生物的控制二、常用加热灭菌的方法三、常用控菌的化学方法一、几个容易混淆的术语定义：指采用强烈的理化因素杀死物体内外部的所有微生物的措施。灭菌后的物体不再有存活的微生物，包括病原菌、非病原菌、芽孢和孢子，以及污染的杂菌和生产用菌。第五节有害微生物的控制（一）.灭菌商业无菌定义：食品经杀菌处理后，采用常规的培养方法无活菌检出或残存的非致病菌的数量很低，但要求它们在不适宜的pH、Eh和温度等储藏条件下不能在产品中生长繁殖的灭菌方法。在食品工业中，常用“杀菌”这个名词，它包括上述的消毒和灭菌，如牛奶的杀菌是指巴氏消毒；罐藏食品的杀菌指商业灭菌。一、几个基本概念定义：采用较温和的理化因素仅杀死物体表面或内部所有病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。消毒剂：能迅速杀灭病原菌的化学药物。一般消毒剂在常用浓度下只能杀死微生物的繁殖体，对芽孢则无杀灭作用。化学消毒剂高浓度时具有杀菌作用，低浓度时具有抑菌作用巴氏消毒属于物理方法。（二）.消毒定义：采用某种理化因素或生物因素防止或抑制微生物生长繁殖的一种措施。防腐手段很多，例如低温、高温、干燥、隔氧(充N2)、高渗(盐腌或糖渍)、高酸、辐射、防腐剂等方法都是食品防腐保藏的主要方式。（三）.防腐定义：利用具有高度选择毒力(即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性)的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，甚至杀灭，借以达到治疗疾病的一种措施。化学治疗剂：用于化疗目的的化学物质。包括各种抗生素、抗代谢类药物(磺胺类药物)和中草药中的有效成分等。（四）.化疗控制有害菌措施

杀灭抑菌彻底杀灭——部分杀灭——抑制腐败和霉变微生物——抑制宿主体内病原菌——灭菌消毒杀菌溶菌防腐化疗常用控菌方法之间的联系LTH法HTST法高温灭菌（消毒）法火焰灼烧法间歇灭菌法常规加压灭菌法烘箱热空气灭菌法湿热灭菌（消毒）法干热灭菌法巴氏消毒法煮沸消毒法常压下加压下连续加压灭菌法二、物理灭菌因素的代表——高温（1）火焰灭菌法

直接利用火焰烧灼将微生物烧死。优点：灭菌彻底、迅速。缺点：损伤或烧毁某些物品，使用范围受限。用途：主要用于实验室接种针(环)、玻璃和某些金属器械灭菌；工业发酵罐接种的环火保护；被传染病污染的材料（2）加热空气灭菌法

干燥箱中利用电加热空气。通常150～160℃保持1～2h；140℃保持3h，能将所有微生物(包括芽孢)全部杀死。主要用于玻璃器皿、金属用具及其它耐干燥耐热物品的灭菌。

1.干热灭菌利用水蒸汽的热量将物品灭菌。同样温度下，比干热灭菌更有效。（水蒸汽穿透力强，更易破坏蛋白质的氢键结构。）优点：经济和快速。广泛用于培养基和发酵设备等的灭菌。常用方法：煮沸灭菌、间歇灭菌、巴氏杀菌和高压蒸汽灭菌等。（1）煮沸消毒法

将物品在水中100℃煮沸15～20min即可杀死所有微生物的繁殖体(营养体)，但不能杀死芽孢。若要杀死芽孢一般要煮沸1～2h以上或在水中加2%～5%石碳酸或1%～2%的碳酸钠。该法用于饮用水、食品、器材、器皿和衣服等小型物品灭菌。二、常用加热灭菌的方法第三节有害微生物的控制2.湿热灭菌（3）巴氏消毒法

指在100℃以下，杀死食品中所有病原菌和多数腐败菌的繁殖体的措施。优点：能杀死病原菌并尽可能减少食品营养成分和风味的损失。根据巴氏消毒的具体温度和时间可有两种方法：低温长时杀菌法(LTLT)：采用63℃，30min进行间歇杀菌；高温短时杀菌法(HTST)：72℃，15min间歇杀菌或15s连续杀菌。二、常用加热灭菌的方法第三节有害微生物的控制2.湿热灭菌（2）间歇灭菌法

利用100℃流通蒸气30min杀死繁殖体,然后(28～37℃)间歇使芽孢萌发形成繁殖体，重复以上两次杀菌过程，保证杀死全部微生物和芽孢。常用于不耐高温的物品灭菌，如含糖培养基，牛乳等的灭菌。4.超高温瞬时灭菌法(简称UHT)

130～150℃，2～3s，污染严重的鲜乳在142℃以上。特点：既可杀死全部病原菌、营养细胞和耐热的细菌芽孢，又可最大限度减少营养成分的破坏。UHT广泛用于各种果汁、牛乳、花生乳、酱油等液态食品的杀菌二、常用加热灭菌的方法第三节有害微生物的控制2.湿热灭菌（2）加压法①常规加压蒸汽灭菌法（normalautoclaving）②连续加压蒸汽灭菌法（continuousautoclaving）①常规加压蒸汽灭菌法（normalautoclaving）

一般称作“高压蒸汽灭菌法”。这是一种利用高温（而非压力）进行湿热灭菌的方法。高压蒸汽灭菌法的原理：

将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压蒸汽灭菌锅（或家用压力锅）内，盖上锅盖，并打开排气阀，通过加热煮沸，让蒸汽驱尽锅内原有的空气，然后关闭锅盖上的排气阀阀门，再继续加热，使锅内蒸汽压逐渐上升，随之温度也相应上升到100℃以上。

（1）121℃（压力为1kg／cm2或15磅／英寸2），

15～20min；（2）115℃（0.7kg／cm2或10磅／英寸2），35min。高压蒸汽灭菌法常用参数：适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基、物料及多种器材的灭菌。高压蒸汽灭菌法的用途：优点：操作简便，效果可靠，广泛使用。高压蒸汽灭菌法的优缺点：缺点：破坏一些不耐热的营养成分。6.高压蒸汽灭菌法采用0.1Mpa(121.1℃)维持15～30min。在短时间内杀死全部微生物包括细菌芽孢。实验室：常用于培养基、各种缓冲液、玻璃器皿、金属器械和工作服等灭菌。对含糖培养基宜采用0.05Mpa(110℃)灭菌20～30min。对脱脂乳培养基宜采用0.07Mpa(115℃)灭菌20～30min。第三节有害微生物的控制2.湿热灭菌5.连续灭菌法一般采用135～140℃加热5～15s，然后在维持罐内继续保温5～8min，以达到彻底灭菌的目的。特点：既达到了灭菌目的，又减少了营养物质的损失；提高发酵罐的利用率。适合自动化操作。7.其他除菌过滤方法

对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基，可采用过滤除菌法达到灭菌目的。滤膜过滤装置：实验室：常用察氏(Seitz)滤器和一些膜过滤器，常用滤膜的孔径为0.45µm和0.22µm，可拦截细菌、放线菌、酵母和霉菌通过。缺点：无法去除其中的病毒。②连续加压蒸汽灭菌法

（continuousautoclaving）在发酵行业里也称“连消法”。连续加压蒸汽灭菌法的原理：

将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入无菌的发酵罐。利用温度进行杀菌的两种定量指标（1）热死时间（thermaldeathtime）（2）热死温度（thermaldeathpoint）

也称热致死时间，指在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。例如，E.coli在60℃下的热死时间为10min；Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）在58℃下为30min；Lactobacillusthermophilus（嗜热乳杆菌）在71℃下为30min。（1）热死时间（thermaldeathtime）（2）热死温度（thermaldeathpoint）

也称热死点，指在一定时间内（一般为10min），杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。例如，Agrobacteriumtumefaciens（根癌土壤杆菌）为53℃；Erwiniacarotovora（胡萝卜软腐欧文氏菌）为48～51℃等

。（三）高温对培养基成分的

有害影响及其防止1.有害影响（1）少数有利影响：长时间的高温对培养基中的淀粉成分有促进糊化和水解作用。（2）很多不利的影响：沉淀，褐变，改变pH，降低营养浓度等。导致培养基褐变的同时，还降低了有关营养物成分！产生褐变的机制氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质）羰基化合物（糖类）梅拉特反应（maillardreaction）2.防止法（1）采用特殊加热灭菌法（2）过滤除菌法（3）其他方法（1）采用特殊加热灭菌法①分别灭菌②低压灭菌③间歇灭菌④连续加压蒸汽灭菌112℃（0.57kg／cm2或8磅／英寸2）灭菌15min115℃（0.7kg／cm2或10磅／英寸2）灭菌35min②低压灭菌③间歇灭菌含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）间歇灭菌低压灭菌在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌等。④连续加压蒸汽灭菌（2）过滤除菌法

对空气和培养液中某些不耐热的成分可采用过滤除菌法“灭菌”。三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂抗微生物剂非选择性（对所有细胞均有毒性）有选择性（对病原微生物毒性更强）消毒剂（disinfectant）防腐剂（antisepsis）抗代谢药物抗生素中草药有效成分（化学治疗剂）化学表面消毒剂的种类繁多，其作用原理各不相同，包括酸类、碱类、氧化剂、重金属盐类、有机化合物等。选择化学消毒剂的原则：应选择杀菌力强，价格低廉，能长期贮存，无腐蚀作用，对人和其他生物无毒性或刺激性较小的化学物质。1.化学表面消毒剂类别名称浓度作用原理杀菌对象应用范围酸类乳酸0.33～1.0mol/L破坏细胞膜和蛋白质病原菌、病毒

房间熏蒸消毒

醋酸5～10ml/m3破坏细胞膜和蛋白质病原菌房间熏蒸消毒碱类石灰水1%～3%破坏细胞结构、酶系统细菌、芽孢、病毒粪便或地面

生石灰乳5%～10%破坏细胞结构、酶系统细菌、芽孢、病毒粪便或地面

烧碱2%～3%破坏细胞结构、酶系统细菌、芽孢、病毒食品设备用具

火碱1%～4%破坏细胞结构、酶系统细菌、芽孢、病毒食品设备用具氧化剂高锰酸钾0.1%氧化蛋白质活性基团细菌繁殖体皮肤、果蔬、餐具

过氧化氢3%氧化蛋白质活性基团细菌、厌氧菌皮肤、伤口、食品

20%以上氧化蛋白质活性基团细菌芽孢食品包装材料

过氧乙酸0.2%～0.5%氧化蛋白质活性基团细菌、真菌、病毒、芽孢皮肤、塑料、食品包装材料

臭氧约1mg/L氧化蛋白质活性基团细菌、真菌、病毒食品、饮水

氯气0.2～0.5mg/L氧化蛋白质破坏细胞膜多数细菌、病毒饮用水、游泳池水

漂白粉

0.5%～1.2%10%～20%氧化蛋白质破坏细胞膜氧化蛋白质破坏细胞膜多数细菌、芽孢多数细菌、芽孢饮水、果蔬地面、厂房

二氧化氯碘酒2%氧化蛋白质破坏细胞膜细菌、霉菌、病毒饮水、食品设备2.5%酪氨酸卤化，酶失活细菌、霉菌、病毒皮肤、伤口醇类乙醇70%～75%脱水、蛋白质变性、溶解脂类破环细胞膜细菌繁殖体皮肤、医疗器械醛类甲醛0.5%～10%破坏蛋白质氢键、氨基细菌繁殖体、芽孢熏蒸接种室(箱)酚类石炭酸3%～5%蛋白质变性、损伤细胞膜细菌繁殖体地面、家具、器皿煤酚皂(来苏儿)2%～5%蛋白质变性、损伤细胞膜细菌繁殖体皮肤、器械、地面表面活性剂新洁尔灭0.05%～0.1%蛋白质变性、破坏胞膜、细菌、真菌、病毒、皮肤、手术器械杜灭芬0.05%～0.1%蛋白质变性、破坏胞膜细菌、真菌、病毒皮肤、金属重金属盐类升汞0.1%与蛋白质、巯基结合失活所有微生物非金属物品、器皿红汞2%与蛋白质、巯基结合失活所有微生物皮肤粘膜、小伤口

硫柳汞硝酸银硫酸铜0.01%～0.1%0.1%～1.0%0.1%～0.5%与蛋白质、巯基结合失活蛋白质沉淀、变性与蛋白质巯基结合失活所有微生物所有微生物所有微生物皮肤、生物制品皮肤、眼睛发炎杀植物真菌、藻类染料龙胆紫2%～4%与蛋白质的羧基结合革兰氏阳性菌皮肤、伤口气体环氧乙烷600ml/L有机物烷化、酶失活病原菌、细菌芽孢手术器械、毛皮、（一）表面消毒剂

（surfacedisinfactant）

表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。共同规律：低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用,随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数（phenolcoefficient，PC）：

指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌（testorganism）的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度之比。一般规定处理时间为10min，供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。

在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸表面消毒剂的用途广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌：温度计、带有透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等，墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水，空气（1）酸类

强酸腐蚀性强，不宜做消毒剂；有机酸(如乳酸、醋酸等)电离度比无机酸小，但其杀菌作用要比无机酸强。有机酸的杀菌作用决定于整个分子和部分解离的阴离子。

常用酸类作食品化学防腐剂：苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、丙酸及其钙盐、脱氢醋酸及其钠盐等。其杀菌机理和应用参见第九章第三节“食品保藏技术”部分。第三节有害微生物的控制常用化学表面消毒剂（2）碱类

碱类具有杀菌和去油污作用。其杀菌能力决定于电离后的OH-浓度，浓度愈高，杀菌力愈强。杀菌机理：OH-在室温条件下可水解蛋白质和核酸，使微生物的细胞结构和酶系统受到破坏，同时还可分解菌体中的糖类，引起细胞死亡。G+菌、G―菌、芽孢和病毒对碱类敏感。食品工业中常用1%～3%石灰水、5%～10%生石灰乳、2%～3%烧碱(Na2CO3)溶液、1%～4%火碱(NaOH或KOH)等作为环境、冷库、机械设备与用具等的消毒剂。第三节有害微生物的控制常用化学表面消毒剂（3）氧化剂

氧化剂的杀菌力主要是氧化作用。氧化剂不稳定放出游离氧或其它化合物