分子生物学基因组转录组蛋白组

MolecularGeneticsandGenomicsFallSemester,2010主讲教师：薛树林

联系电话：84396024地址：

金陵研究院316E-mail:植物应用基因组学与生物信息中心当前第1页\共有81页\编于星期五\17点1.出勤及回答问题情况：

30%

（

随机提问形式）2.期末考试：

70%

（闭卷）考核方式对于选修《基因组学》课程的同学，采取写一篇课程论文的考核方式（70%）。2学分，周五3-5节，教学楼B301当前第2页\共有81页\编于星期五\17点ReferencesGenomes2,Genomes3byBrownTAGeneVIII,GeneIXbyB.LewinJournalsonPlantMolecularGenetics《现代分子生物学》，朱玉贤，李毅

著《基因组学》杨金水著《分子克隆实验指南》（第3版），萨姆布鲁克（美）主编当前第3页\共有81页\编于星期五\17点Chapter1:Genomes,TranscriptomesandProteomesChapter2:StudyingDNAChapter3:MappingGenomesChapter4:SequencingandAnnotationofGenomesChapter5:EukaryoticNuclearGenomesChapter6:GenomesofProkaryotesandEukaryotic OrganellesChapter7:GenomeExpressionChapter8:GenomeEvolutionOutlineofthiscourse当前第4页\共有81页\编于星期五\17点Chapter1:

Genomes,TranscriptomesandProteomes当前第5页\共有81页\编于星期五\17点基因组（Genome）：由德国汉堡大学威克勒教授于1920年首创，指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。基因组学（Genomics）：由罗德里克于1986年首创，指研究生物的整个基因组，涉及基因组作图、测序和功能分析的一门学科。1.概述当前第6页\共有81页\编于星期五\17点32亿个nt,2n=46,35,000个基因16,569bp,环形分子，多拷贝,37个基因当前第7页\共有81页\编于星期五\17点基因组所包含的生物信息的利用需要酶及其他参与基因组表达过程中一系列复杂生化反应的蛋白质的协同活性。基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组由转录过程来维持。基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。这是通过翻译过程来完成的。当前第8页\共有81页\编于星期五\17点细胞的蛋白质库当前第9页\共有81页\编于星期五\17点DNA由JohannFriedrichMiescher在1869年发现,这位瑞士生物学家当时在德国蒂宾根（Tubingen）工作。2.DNA当前第10页\共有81页\编于星期五\17点2.1GenesaremadeofDNA奥地利神父孟德尔1865年根据7个碗豆性状的实验提出了遗传因子假说，认为每个性状由遗传因子控制，并提出了遗传因子的分离与自由组合两大遗传规律。当前第11页\共有81页\编于星期五\17点证明基因由核酸

(DNA或RNA)

组成的3个著名实验：①肺炎双球菌的转化试验；②噬菌体感染实验；③烟草花叶病毒的感染实验。当前第12页\共有81页\编于星期五\17点A.1928年，荷兰细菌学家格里菲斯（Griffith）的肺炎双球菌转化实验

Griffith在研究肺炎球菌时发现肺炎球菌有很多不同菌株，其中有一种菌株它的球菌有毒性，能引起小鼠得败血病。这些有毒的球菌外面有保护作用的多糖胶状荚膜，使它们可以不被宿主的正常保护机构所破坏；当它们生长在培养基上时，每一个细菌长成一个明亮的光滑菌落，叫光滑型（S）菌株；另外一些菌株无荚膜，菌落粗糙，没有毒性，不会引起疾病，叫R型菌株。当前第13页\共有81页\编于星期五\17点(1)(2)(3)(4)当前第14页\共有81页\编于星期五\17点这表明无毒性的R型活细菌在与被加热杀死的S型细菌混合后，转化成了有毒性的S型活细菌。这些转化成的S型细菌的后代也是有毒性的S型细菌，可见这种性状的转化是可以遗传的。1944年，艾弗里从S型活细菌中提取了DNA，蛋白质和多糖等物质，然后分别加入到培养R型细菌的培养基中。结果发现只有加入DNA时，

R型细菌才能转化成S型细菌。通过上述研究表明，DNA是使R型细菌产生转化的物质，所以DNA是遗传物质。当前第15页\共有81页\编于星期五\17点B.噬菌体感染实验

噬菌体T2有一个蛋白质的外壳，DNA裹在其中。当噬菌体T2感染大肠杆菌时，它的尾部吸附在菌体上。然后，菌体内形成大量噬菌体，菌体裂解后，释放出几十个乃至几百个与原来感染细菌一样的噬菌体T2。构成蛋白质的氨基酸中，甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫，DNA中不含S，所以S只存在于T2噬菌体的蛋白质。相反，P主要存在于DNA中，至少占T2噬菌体含磷量的99％。AlfedHershey和MarthaChase(1952)将宿主菌细胞分别放在含35S或含32P的培养基中。宿主细胞在生长过程中就被35S或32P标记上了。然后用噬菌体去感染分别被S或P标记的细菌，并在这些细菌中复制增殖。宿主菌裂解释放出很多子代噬菌体，这些子代噬菌体也被标记上35S或32P。当前第16页\共有81页\编于星期五\17点接着，用分别被35S或32p标记的噬菌体去感染没有被放射性同位素标记的宿主菌，然后测定宿主菌细胞带有的同位素。被35S标记的噬菌体所感染的宿主菌细胞内很少有35S，而大多数35S出现在宿主菌细胞的外面。也就是说，35S标记的噬菌体蛋白质外壳在感染宿主菌细胞后，并未进入宿主菌细胞内部而是留在细胞外面。被32p标记的噬菌体感染宿主菌细胞后，测定宿主菌的同位素，发现32p主要集中在宿主菌细胞内。所以噬菌体感染宿主菌细胞时进入细胞内的主要是DNA。由此可以得出结论：噬菌体注入宿主菌细胞内的物质是DNA，释放出来的是跟原先感染细菌细胞一样的噬菌体。可见在噬菌体的生活史中，只有DNA是联系亲代和子代的物质。当前第17页\共有81页\编于星期五\17点当前第18页\共有81页\编于星期五\17点C.烟草花叶病毒的感染实验对病毒的研究逐渐深入以后，发现一些植物的病毒仅含有RNA没有DNA。当用烟草花叶病毒（TMV）的RNA和蛋白质分别进行感染试验，发现只有RNA才能诱发感染。RNA也是遗传物质当前第19页\共有81页\编于星期五\17点RNA蛋白质RNA酶处理当前第20页\共有81页\编于星期五\17点2.2ThestructureofDNA核苷酸A.Nucleotidesandpolynucleotides2’-脱氧核糖当前第21页\共有81页\编于星期五\17点多聚核苷酸3’,5’-磷酸二酯键当前第22页\共有81页\编于星期五\17点DNA多聚核苷酸合成的聚合反应当前第23页\共有81页\编于星期五\17点2.2ThestructureofDNAB.Themodelofdoublehelix

DNA晶体X射线衍射图谱为揭示DNA分子的二级结构提供了重要实验证据威尔金斯弗兰克林当前第24页\共有81页\编于星期五\17点a.WatsonandCrick(1953)提出的DNA双螺旋结构模型：DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。戊糖－磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2.37nm。当前第25页\共有81页\编于星期五\17点Width2.37nm3.4nm当前第26页\共有81页\编于星期五\17点4314256当前第27页\共有81页\编于星期五\17点尽管氢键使得双链中的碱基间的配对具有特异性（只有互补的两条链之间才能形成DNA双链），但其对于双螺旋的总体上的稳定性并无太大贡献。核酸分子的稳定性的根源在于碱基对之间的疏水堆积力。作为芳香族化合物，碱基的平面使其不能在自由溶液中与水分子形成氢键，即它们是疏水的。疏水效应使双链DNA成为能量上最为稳定的结构。尽管这种堆积作用在RNA中也存在，但其在双链DNA中达到了最大化。b.DNA双螺旋结构的稳定力：碱基间形成的氢键相邻碱基间的疏水堆积力碱基相互作用的范德华力当前第28页\共有81页\编于星期五\17点c.DNA双螺旋结构的类型:三种形态的DNA：A-DNA,B-DNA,Z-DNA两类：右手螺旋和左手螺旋ABZ当前第29页\共有81页\编于星期五\17点ABZMiMaMaMiMiMa较宽，结构更紧密，是RNA及RNA与DNA杂合体的主要螺旋形式单一交替的嘧啶－嘌呤序列如5’-CGCGCG-3’不是体内核酸的主要形式所有DNA的稳定形式111210当前第30页\共有81页\编于星期五\17点DNA双螺旋不同构象的特征螺旋直径螺距当前第31页\共有81页\编于星期五\17点3.RNAandtheTranscriptome基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组中的RNA分子以及其他来自非编码基因的RNA都由转录过程产生。当前第32页\共有81页\编于星期五\17点3.1ThestructureofRNA核糖A,C,G,U稳定性差主要以单链形式存在2’,3’-环磷酸二酯当前第33页\共有81页\编于星期五\17点依赖模板的RNA合成DNA-dependentRNApolymerases当前第34页\共有81页\编于星期五\17点3.2

细胞内的RNA组分一个典型的细菌细胞含有

0.05–0.10pg的RNA，约占其总质量的6%。一个哺乳动物细胞，比细菌大得多，含有20–30pgRNA，但是只占细胞总质量的1%。当前第35页\共有81页\编于星期五\17点细胞内的RNA组分核小RNA核仁小RNA微小RNA短干扰RNA构成转录组所有生物仅真核生物当前第36页\共有81页\编于星期五\17点核小RNA(SnRNA)：发现于真核生物细胞核中，与前体mRNA剪接成成熟mRNA的过程相关。核仁小RNA（snoRNA）：发现于真核细胞核的核仁区，在rRNA分子的加工过程中起到核心作用（比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基）。微小RNA（miRNA）和短干扰RNA（siRNA）：是调控个别基因表达的小RNA。当前第37页\共有81页\编于星期五\17点3.3ProcessingofprecursorRNA末端修饰剪接剪切化学修饰pre-rRNApre-tRNARNAediting新的化学基团当前第38页\共有81页\编于星期五\17点3.4Thetranscriptome转录组虽然不到细胞总RNA的4%，却是细胞中最重要的组分，因为它包含了基因组表达的下一个阶段中所要使用的编码RNA。转录组从不从头合成（denovo），一个细胞通过细胞分裂诞生时就接收了其上一代的部分转录组，并维持一生。各蛋白质编码基因的转录过程并不是导致转录组的合成，而是通过替换被降解的mRNA来维持转录组，并通过开闭不同的基因的表达来改变转录组的组成。当前第39页\共有81页\编于星期五\17点3.5

转录组研究的方法A.通过序列分析研究转录组研究转录组最直接的方法是将其中的mRNA转变为cDNA，并对所有cDNA克隆进行测序，再与基因组序列进行比较分析。还可以借助第二、三代测序技术直接对RNA进行测序。当前第40页\共有81页\编于星期五\17点3.5

转录组研究的方法A.通过序列分析研究转录组基因表达系列分析（Serialanalysisofgeneexpresion,SAGE）SAGE技术不是研究完整的cDNA，它产生长度12bp的短序列，每一条都代表了转录组中存在的一种mRNA。技术基础：412=16,777,216bp，真核mRNA平均1500bp，412相当于11,000个转录物，这比最复杂的转录组中存在转录物数目还多，因此12bp序列能够代表某一种mRNA。当前第41页\共有81页\编于星期五\17点BsmF1是一种不常见的限制性内切酶，它不在其识别序列内部，而是在识别位点下游10-14个nt处切割。SAGE纤维素微粒4bp频繁切割洗脱去除连接一个含有BsmF1识别序列的寡聚核苷酸当前第42页\共有81页\编于星期五\17点切下来的片段被收集起来，头尾相连以产生一个串联体，进行测序分析。串联体中的各个标签序列信息被读取并与基因组中的基因序列比对，从而可以分析哪些基因被转录，表达水平如何。SAGE当前第43页\共有81页\编于星期五\17点3.5

转录组研究的方法B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组探针：原位合成并固化的寡聚核苷酸PCR产物cDNA优点：可用于快速评估两个或多个转录组间的差异。109拷贝，过量构成转录组的mRNA总体被反转录成一个cDNA的混合物，然后被标记，用于和芯片或微阵列杂交。当前第44页\共有81页\编于星期五\17点3.5

转录组研究的方法B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组与基因中不同位置匹配的寡聚核苷酸链（包含20种左右）探针标记效率杂交效率玻璃片，尼龙膜玻璃片，硅片当前第45页\共有81页\编于星期五\17点用不同的荧光来标记cDNA样品，微阵列与两个样品同时杂交，可以减少由于试验误差引起的差异。当前第46页\共有81页\编于星期五\17点4.ProteinsandtheProteome基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。这些蛋白质是通过翻译那些组成转录组的mRNA分子而合成的。Molcellproteomics:8.8Proteomics:4.4当前第47页\共有81页\编于星期五\17点4.1Proteinstructure蛋白质和DNA分子一样，是一个线性的无分支的多聚体。蛋白质中的单体亚单位称为氨基酸。氨基酸形成的多聚体或多肽在长度上很少超过2000个单位。氨基酸的一般结构当前第48页\共有81页\编于星期五\17点A.Thefourlevelsofproteinstructure4.1Proteinstructurea.primarystructure氨基酸通过肽键连接成一条多肽链。NCCN当前第49页\共有81页\编于星期五\17点A.Thefourlevelsofproteinstructure4.1Proteinstructureb.secondarystructure指多肽采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。螺旋；片层当前第50页\共有81页\编于星期五\17点A.Thefourlevelsofproteinstructure4.1Proteinstructureb.tertiarystructure是将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。它被各种化学力所稳定：氨基酸残基间的氢键；带电荷的氨基酸R基团间的静电相互作用；疏水相互作用；半胱氨酸残基间的二硫键当前第51页\共有81页\编于星期五\17点当前第52页\共有81页\编于星期五\17点A.Thefourlevelsofproteinstructure4.1Proteinstructured.quaternarystructure两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。不是所有蛋白质都有四级结构；稳定力包括：二硫键（稳定）；

氢键，

疏水作用（松散）Nature,27NOV,2008当前第53页\共有81页\编于星期五\17点B.蛋白质的多样性取决于氨基酸的多样性4.1Proteinstructure组成蛋白质的氨基酸在化学性质上有多样性，因此蛋白质的功能也是多种多样的。氨基酸的多样性源于R基团。当前第54页\共有81页\编于星期五\17点氨基酸的R基团非极性（疏水）极性（亲水）带负电荷p19带正电荷当前第55页\共有81页\编于星期五\17点当前第56页\共有81页\编于星期五\17点4.2Theproteome蛋白质组包括了在特定时间存在于细胞中的所有蛋白质。一个典型的哺乳动物细胞，如肝细胞中，含有10000～20000种不同的蛋白质，共有约

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个蛋白质分子，重约0.5ng，占细胞总重量的18-20%。各种蛋白质的拷贝数差别很大，最少的每个细胞中不足20000个，最多的可达1亿个。每个细胞中拷贝数大于50000的蛋白质被认为含量较丰富，通常哺乳动物细胞中约有2000种蛋白质属于此类，它们大多属于管家蛋白。当前第57页\共有81页\编于星期五\17点4.2TheproteomeA.ThelinkbetweenthetranscriptomeandtheproteomeGeneticcode当前第58页\共有81页\编于星期五\17点四个标点密码子当前第59页\共有81页\编于星期五\17点4.2TheproteomeB.Thegeneticcodeisnotuniversal标准遗传密码的偏差示例色氨酸精氨酸线粒体基因组当前第60页\共有81页\编于星期五\17点4.2TheproteomeB.蛋白质组和细胞生化功能之间的联系基因组编码的生物学信息最终由蛋白质表现。蛋白质能够执行各种生物学功能：生物催化作用（酶）；结构（细胞骨架由蛋白质决定）；运动（收缩蛋白）；运输（血红蛋白运输血液中的氧）；调节细胞进程（信号蛋白、活化调节因子）；保护细胞个体（抗体）；储藏功能（麦醇溶蛋白）。当前第61页\共有81页\编于星期五\17点4.3

蛋白质组研究的方法A.蛋白谱（表达蛋白质组学）用来研究一个蛋白质组组成的特定技术。蛋白谱基于两项技术：蛋白电泳和质谱a.双向电泳：分子量等电点：蛋白质的净电荷为零时溶液的PH值。等电聚焦等电点当前第62页\共有81页\编于星期五\17点双向凝胶电泳结果寻找差异表达点当前第63页\共有81页\编于星期五\17点b.MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)4.3

蛋白质组研究的方法A.蛋白谱用于鉴定蛋白组中的蛋白质，最多可以分析出50个氨基酸长度的多肽，因此一个蛋白质可以通过胰酶将其消化后进行测定。一旦多肽片段被离子化，多肽的质量/电荷比就可以通过它在质谱仪中从电离源到检测器的“飞行时间”来确定。通过质荷比能够确认多肽片段的分子质量。计算机中含有一个由所研究的物种基因组编码的每一个蛋白质经胰酶消化后各个片段的预计相对分子质量的数据库，计算机通过比较数据库与检测到的多肽片段的分子质量来确认最可能的初始蛋白质。当前第64页\共有81页\编于星期五\17点质量/电荷比多肽通过来自激光的脉冲能量被电离化柱腔当前第65页\共有81页\编于星期五\17点质量/电荷比波谱数据计算机通过比较数据库与检测到的多肽质量来确认最可能的初始蛋白质。当前第66页\共有81页\编于星期五\17点4.3

蛋白质组研究的方法B.蛋白质印迹法（Western杂交）Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目标蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目标蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。当前第67页\共有81页\编于星期五\17点4.3

蛋白质组研究的方法B.蛋白质印迹法（Western杂交）然后加入特异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，或用同位素或生物素标记）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。当前第68页\共有81页\编于星期五\17点Westernblotting电泳印迹当前第69页\共有81页\编于星期五\17点4.3

蛋白质组研究的方法C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质通过鉴定有相互作用的成对或成组的蛋白质能够获得基因组活性相关的重要数据。构建蛋白质相互作用图谱被视为是连接蛋白质组学与细胞生物化学过程的一个重要步骤。当前第70页\共有81页\编于星期五\17点4.3

蛋白质组研究的方法C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质a.噬菌体展示该技术采用了一种基于噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。待测基因被插入载体后，它