动物组织培养演示文稿

动物组织培养演示文稿当前第1页\共有207页\编于星期五\18点第二章动物组织培养当前第2页\共有207页\编于星期五\18点第一节概述

一、动物细胞培养的发展历史二、动物细胞与组织培养的基本概念

三、动物细胞体外培养的特点

四、动物细胞体外培养的一般条件(掌握）

五、体外培养细胞生物学特性(掌握）当前第3页\共有207页\编于星期五\18点一、动物细胞培养的发展历史1885年，WilhelmRoux（劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了“组织培养”一词。1907年，美国胚胎学家RossHarrison（哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。1912年,法国学者AlexisCarrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。1923年，他设计了卡氏培养瓶。当前第4页\共有207页\编于星期五\18点1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。1925年，Maximow采用双盖片法。1934年，Gey和Lewis用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究。1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。当前第5页\共有207页\编于星期五\18点1952年．Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细胞系。1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。1962年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。当前第6页\共有207页\编于星期五\18点二、动物组织培养的基本概念1、动物组织培养从动物体内提出组织，于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。是动物细胞工程的基础。

当前第7页\共有207页\编于星期五\18点分类：器官培养

组织培养

细胞培养当前第8页\共有207页\编于星期五\18点2、原代培养(PrimaryCulture)：亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。3．继代培养（SecondaryCulture）：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4、细胞系(cellline)：由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。5、细胞株(cellstrain)：细胞系经过克隆或其他方法得到的单一类型的细胞群体。当前第9页\共有207页\编于星期五\18点有限细胞系(infinitedcellline)：不能连续培养的细胞株。无限细胞系(finitedcellline)：能够连续培养的细胞株，也称无限系。无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞。当前第10页\共有207页\编于星期五\18点

细胞株、细胞系的命名：以组织来源定名，如BHK(幼地鼠肾细胞)以人名定名，如HeLa细胞以时间地点来定名，如S7811细胞系以临床疾病类型定名，如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞))当前第11页\共有207页\编于星期五\18点三、动物细胞体外培养的特点动物细胞生长缓慢，培养时间长。更易受微生物污染（包括细菌、真菌、病毒、支原体），需要防治污染问题。对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括pH值、温度等。对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。当前第12页\共有207页\编于星期五\18点四、动物细胞体外培养的一般条件1.环境无毒和无菌

2.适宜的温度：人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。3.气体环境和氢离子浓度：需要一定量的O2和CO2（95％空气+5%CO2。

4.渗透压：260－320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养物质：六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等。当前第13页\共有207页\编于星期五\18点1.环境无毒和无菌培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。当前第14页\共有207页\编于星期五\18点2.适宜的温度人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低。当前第15页\共有207页\编于星期五\18点3.气体环境和氢离子浓度气体：需要O2、CO2（95%空气、5%CO2）气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有O2和CO2。氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%CO2混合气体环境中.CO2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.当前第16页\共有207页\编于星期五\18点大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长，，每种细胞都有其最适pH值.当pH低于6或高于7.6时细胞生长会受到影响，甚至死亡。红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。当前第17页\共有207页\编于星期五\18点4.渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260-320mOsm/kg的范围都适宜。每千克水中所含的毫渗透粒子数(mOsm/kgH2O)（"毫渗摩尔每千克"）当前第18页\共有207页\编于星期五\18点5.营养物质在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。当前第19页\共有207页\编于星期五\18点五、体外培养细胞的生物学特性（一）培养细胞的生长特点（二）培养细胞的生长方式及类型（三）培养细胞的生长与增殖过程

当前第20页\共有207页\编于星期五\18点（一）培养细胞的生长特点贴附和伸展接触抑制密度抑制当前第21页\共有207页\编于星期五\18点1、贴附并伸展是多数体外培养细胞的基本生长特点。贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。当前第22页\共有207页\编于星期五\18点细胞贴附和伸展过程：当前第23页\共有207页\编于星期五\18点细胞贴壁过程当前第24页\共有207页\编于星期五\18点影响细胞贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因素（如促附着因子）；机械、物理因素（如低温或培养液的流动过快)；其它一些因素的影响（例如：离子的作用)。当前第25页\共有207页\编于星期五\18点2、接触抑制（Contactinhibition）细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，它们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。

当前第26页\共有207页\编于星期五\18点当前第27页\共有207页\编于星期五\18点当前第28页\共有207页\编于星期五\18点3、密度抑制（Densityinhibition）3T3细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每6cm培养皿约106个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。上述这种生长特性即为密度依赖性调节（或密度抑制）。转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的终末细胞密度。当前第29页\共有207页\编于星期五\18点1、贴壁依赖型细胞2、非贴壁依赖型细胞成纤维细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞（二）培养细胞的生长方式及类型于悬浮状态下即可生长贴附于支持物表面才能生长的细胞当前第30页\共有207页\编于星期五\18点（1）成纤维细胞型：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名.除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。

1、贴壁依赖型细胞当前第31页\共有207页\编于星期五\18点人的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞人骨髓间充质细胞（MSC）当前第32页\共有207页\编于星期五\18点当前第33页\共有207页\编于星期五\18点大鼠血管平滑肌细胞成纤维细胞型当前第34页\共有207页\编于星期五\18点（2）上皮细胞型此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁圆形核，细胞彼此紧密相连成单层细胞，呈现“铺路石状”。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。内胚层和外胚层细胞体外培养时都可能呈现上皮型。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞等。Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。当前第35页\共有207页\编于星期五\18点单层扁平上皮细胞人口腔皮样癌细胞人宫颈癌上皮细胞（Hela）当前第36页\共有207页\编于星期五\18点成骨肉瘤细胞(多角形)上皮细胞型当前第37页\共有207页\编于星期五\18点奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型)当前第38页\共有207页\编于星期五\18点体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且，这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。当前第39页\共有207页\编于星期五\18点

（3）游走型细胞不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。当前第40页\共有207页\编于星期五\18点单核巨噬细胞（未刺激状态）游走细胞型当前第41页\共有207页\编于星期五\18点单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足当前第42页\共有207页\编于星期五\18点（4）多形型细胞形态上不规则的细胞，不常见，一般分胞体和胞突两部分，胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。当前第43页\共有207页\编于星期五\18点神经细胞（DAB显色）多形型细胞

神经细胞当前第44页\共有207页\编于星期五\18点大鼠海马神经细胞当前第45页\共有207页\编于星期五\18点2非贴附型细胞=悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。当前第46页\共有207页\编于星期五\18点优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞。缺点：不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养。当前第47页\共有207页\编于星期五\18点实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。如，Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞，但在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形，当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。当前第48页\共有207页\编于星期五\18点（三）体外培养细胞的生长与增殖过程

1、单个细胞的生长过程：

与体内细胞周期相似，经历G1、S、G2、M期。

细胞的分裂周期长细胞分裂时间为12~48h，细胞的分裂周期=间期+

分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）当前第49页\共有207页\编于星期五\18点当前第50页\共有207页\编于星期五\18点体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段:

原代培养期传代期衰退期2、细胞系的生长过程

当前第51页\共有207页\编于星期五\18点(1)原代培养（初代培养）为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般持续1~4周。特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工具。当前第52页\共有207页\编于星期五\18点(2)传代期当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。特点:在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，一般情况下，可传代10～50代。细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，被称为二倍体核型。当前第53页\共有207页\编于星期五\18点(3)衰退期此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所谓“危机期”(crisis)，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。当前第54页\共有207页\编于星期五\18点当前第55页\共有207页\编于星期五\18点潜伏期3培养细胞一代生长过程指数生长期

停止期当前第56页\共有207页\编于星期五\18点（1）潜伏期当前第57页\共有207页\编于星期五\18点（2）指数生长期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。持续3~5天。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。当前第58页\共有207页\编于星期五\18点（3）平台期又称生长停滞期。此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和密度达到饱和，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，细胞数量持平。细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。当前第59页\共有207页\编于星期五\18点当前第60页\共有207页\编于星期五\18点第二节动物组织培养技术一、动物组织（细胞）培养的实验条件1、实验室设计2、常用设施及设备3、培养器具4、金属器材5、辅助器材当前第61页\共有207页\编于星期五\18点1、实验室设计准备间

缓冲间

培养室

当前第62页\共有207页\编于星期五\18点动物细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。工作环境清洁、空气清新，干燥、无烟尘。实验室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。当前第63页\共有207页\编于星期五\18点（1）准备间主要作用

消毒和培养物质的准备以及供应物品的保藏等。准备间内应有的设备

水槽和盛物台、酸缸、水盆和桶、电炉和锅、物品准备台和水纯化装置、高压蒸汽消毒器、电热干燥消毒箱、储柜或储架。当前第64页\共有207页\编于星期五\18点（2）缓冲室主要作用

减少外界污染源带入培养室应有消毒水、无菌衣和紫外灯或臭氧机当前第65页\共有207页\编于星期五\18点（3）培养室（无菌室、操作室）要求

①和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上

②设置1—2台超净工作台

③室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥

④侧部可设传递窗，用于物品传递

⑤照明用荧光灯为好，消毒用紫外线灯

⑥在室内工作时，动作应轻微设备

超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、真空泵或气泵、冰箱、杂物柜、小型低速离心机当前第66页\共有207页\编于星期五\18点2、常用设施及设备

超净工作台CO2培养箱纯化水装置天平和真空泵当前第67页\共有207页\编于星期五\18点超净工作台当前第68页\共有207页\编于星期五\18点超净工作台的原理：鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，通过工作台面，形成无菌环境。当前第69页\共有207页\编于星期五\18点CO2培养箱当前第70页\共有207页\编于星期五\18点纯化水装置当前第71页\共有207页\编于星期五\18点天平和真空泵当前第72页\共有207页\编于星期五\18点3、培养器皿当前第73页\共有207页\编于星期五\18点4、金属器材当前第74页\共有207页\编于星期五\18点5、辅助器材加样器支架离心管冷冻管当前第75页\共有207页\编于星期五\18点二、培养前准备防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！当前第76页\共有207页\编于星期五\18点（一）培养用品清洗当前第77页\共有207页\编于星期五\18点1、玻璃器皿的清洗玻璃器皿清洗后不仅要求透明、无污迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅残留百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此清洗质量的好坏直接影响到细胞培养成功与否，必须严格按照清洗的程序进行，以保证达到清洗的目的。一般玻璃器皿清洗的程序包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。

当前第78页\共有207页\编于星期五\18点（1）浸泡

初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或溶解。新的玻璃器皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。用过的玻璃器皿往往粘有大量蛋白质，干燥后不易刷洗掉，故用后立即浸入清水中刷洗。当前第79页\共有207页\编于星期五\18点（2）刷洗将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂（不用含沙粒的洗衣粉）水中，用软毛刷反复刷洗，注意不留死角，洗后晾干备浸酸。（3）浸酸刷洗不掉的微量杂质经过浓硫酸和重铬酸钾清洁液的强氧化作用后，可被除掉，而且对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成。浸泡时，器皿要充满清洁液，勿留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。当前第80页\共有207页\编于星期五\18点（4）冲洗

刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。冲洗宜用洗涤装置，亦可用手工操作，每瓶都得用水灌满，倒掉，重复十五次以上，最后再用蒸馏水漂洗2～3次，晾干备用。当前第81页\共有207页\编于星期五\18点2、橡胶制品的清洗新购置的橡胶制品带有大量滑石粉应先用自来水冲洗干净后，再作常规清洗处理。常规处理方法是：每次使用后的橡胶制品都要置入水中浸泡，以便集中处理和避免附着物干涸，然后用2%NaOH液煮沸10～20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水各冲洗2～3次，晾干备用。用过的胶塞的清洗方法基本同清洗玻璃器皿，但胶塞刷洗的重点部位是胶塞使用面，逐个刷洗。当前第82页\共有207页\编于星期五\18点3、塑料制品的清洗塑料制品的特点是：质地软、不耐热。目前常用的塑料制品是经过消毒灭菌密封包装的商品，用时打开包装即可，是一次性使用物品。必要时，用后经过清洗和无菌处理后，也可反复使用2～3次，但不宜过多。清洗程序为使用后应即刻浸入水中严防附着物干涸，不宜用毛刷刷洗，以防划痕出现，如残留有附着物可用脱脂棉轻轻擦拭，用流水冲洗干净，晾干，再用2%NaOH液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，然后用5%盐酸溶液浸泡30分钟，随后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水漂洗5～6次，晾干后备用。当前第83页\共有207页\编于星期五\18点4、金属器具的清洗组织细胞培养所用金属器具主要是一些手术刀、剪、镊子、针等，这些器具使用后应立即用酒精擦洗干净，晾干后备用。当前第84页\共有207页\编于星期五\18点（二）培养用品包装包装的目的是防止器皿器具消毒灭菌后再次遭受污染，所以这些培养用品在消毒处理前要经严格的包装。清洗后的器皿可先放入鼓风干燥箱中烘干（塑料和橡胶制品不能放入干燥箱），或置于通风无尘处自然晾干，然后包装起来，再做消毒处理。包装后的器皿应便于消毒和储存。包装材料常用牛皮纸、棉布和棉线等，包装后的培养用品装入铝饭盒或不锈钢饭盒及金属制的消毒筒内。当前第85页\共有207页\编于星期五\18点（三）器皿器具及环境的消毒对组织细胞培养实验最危险的是发生包括细菌、真菌和病毒等微生物的污染，它们都能直接影响实验结果。组织细胞培养的每个环节都应采取严格的消毒措施，以防止发生污染。消毒灭菌方法因物品材质及环境的不同而异。消毒方法分为三类：即物理消毒法、化学消毒法和抗生素抑菌法。当前第86页\共有207页\编于星期五\18点1、物理消毒法（1）高温湿热消毒：即高压蒸汽消毒，实验室一般采用高压灭菌锅消毒，是最有效的方法之一。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。适合于玻璃器皿、金属器具、橡胶制品、布质类以及耐热的无机离子平衡液等的消毒。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。当前第87页\共有207页\编于星期五\18点（2）干热消毒：实验室一般采用干燥箱进行，由于干热传导慢，因此需要升温到160℃保持90～120分钟，才能杀死细菌芽孢，达到消毒目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿。消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。当前第88页\共有207页\编于星期五\18点（3）过滤消毒：血清、合成培养液、酶液等含有蛋白质，具有生物活性，不能采用高温、高压消毒的方法进行灭菌，因此须采用过滤除菌。实验室一般主要采用Zeiss滤器。Zeiss滤器为不锈钢结构，中间可夹一层滤膜，由纤维素制成的微孔滤膜，质地均匀，有0.60um、0.45um和0.22um等几种规格，常用孔径0.22um滤膜过滤一般培养用液而除菌。注意：过滤器必须经过湿热消毒，操作过程中，必须将过滤器放在超净工作台上进行，以免发生污染。当前第89页\共有207页\编于星期五\18点过滤器当前第90页\共有207页\编于星期五\18点（4）紫外线消毒：紫外线消毒法很方便，效果好，是实验室常用的消毒法，适用于消毒空气、操作台表面和一些不能使用其它方法进行消毒的培养器具（如少量的塑料培养皿、培养板等）。培养室的紫外线灯应距地面2.5米，使得每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，才能发生有效的消毒作用。消毒时物品要相互分开，避免遮挡紫外线的照射。注意：由于紫外线照射时会产生臭氧以及对细胞、培养液、包括人体都有一定的损伤作用，因此不要一边照射一边操作，以免受伤。照射30分钟，可达灭菌效果。当前第91页\共有207页\编于星期五\18点（5）熏蒸消毒：当遇到细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可以用高锰酸钾5—7.5克，加甲醛（40%）10—15毫升，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时。当前第92页\共有207页\编于星期五\18点（6）煮沸消毒：它的优点是简便迅速，缺点是湿度大，消毒后物品不适于长时间保存，这种方法适宜于临时需要消毒的耐热物品，如金属器具和注射器等在水中煮沸20～30分钟，趁热倒去水分即可使用。但金属器具煮沸后宜马上使用，以防器具生锈。当前第93页\共有207页\编于星期五\18点2、化学消毒法化学消毒剂，包括新洁尔灭、来苏儿、过氧乙酸和酒精等。主要适用于无法用其它方法消毒的物品，如操作者的皮肤、操作台面及无菌室内的桌椅、墙壁和空气等（可于紫外线配合消毒，互相取长补短）。实验室最常用的化学消毒剂是0.2%新洁尔灭和70%的酒精，这些消毒剂对皮肤和细胞毒性小，尤其对那些瓶皿开口部位的消毒，效果很好。过氧乙酸是新近推出的一种消毒剂，消毒能力极强，在0.5%浓度，10分钟即可将芽孢杀灭，可以用作各种物品的表面消毒，使用时需用水稀释后用喷洒和擦拭的方法消毒。当前第94页\共有207页\编于星期五\18点3、抗生素消毒法抗生素消毒作用主要是抑制液体内的细菌繁殖，因此适用于细胞培养用液的消毒，延长培养用液的有效期。抗生素种类很多，实验室常用的是青、链霉素混合液也称“双抗”液，其抑菌效果很好。当前第95页\共有207页\编于星期五\18点（四）细胞培养液细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。细胞培养基组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及激素等。当前第96页\共有207页\编于星期五\18点1、培养基的组成成分氨基酸：十二种氨基酸必需，谷氨酰铵，谷氨酸等盐类：钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等葡萄糖：供能缓冲系统：CO2缓冲系统或HEPES生长因子：PDGF，EGF，FGF等其它成分：维生素，矿物质，有机补充物，激素等当前第97页\共有207页\编于星期五\18点2、培养基的种类（1）天然培养基

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基；血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质。

血浆：支持培养组织块及供给细胞生长的营养物质，现在不常用。

组织浸出液：可用鸡胚胎浸出液，含大分子核蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长。

水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末，一般可配制成0.5%溶液。当前第98页\共有207页\编于星期五\18点血清血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物。血清种类:主要是牛血清、人血清、马血清等。牛血清分为小牛、新生牛和胎牛血清。

胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；

新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；

小牛血清取自出生10－30天的小牛。当前第99页\共有207页\编于星期五\18点血清主要作用提供基本营养物质：氨基酸、维生素、核酸衍生物等。提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等。生长因子如bFGF、EGF等。提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等。提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如硒等。当前第100页\共有207页\编于星期五\18点细胞培养中使用血清的缺点血清含一些对细胞产生毒性的物质，如补体、抗体素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响。血清的使用使得实验和生产的标准化困难。大规模生产中，血清来源困难，价格昂贵。当前第101页\共有207页\编于星期五\18点血清质量的鉴定理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。有三种方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。当前第102页\共有207页\编于星期五\18点血清判断好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠；发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。要进一步了解血清的质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞生长状况。当前第103页\共有207页\编于星期五\18点血清的使用和储存使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃、30分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。储存条件：血清一般储存于-20℃，同时应避免反复冻融。使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5－20％，最常用是10％。采购血清时，最好先从供应商处索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量。当前第104页\共有207页\编于星期五\18点（2）人工合成培养基人工合成培养基：化学成分明确的培养基，便于重复和标准化管理和控制。基本成分无机盐CaCl2

MgSO4

NaClNaHCO3

NaH2

PO4

氨基酸

维生素脂溶性维生素(A、D、E、K)水溶性维生素包括叶酸、B12等。碳水化合物主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。酚红当前第105页\共有207页\编于星期五\18点三种常用培养基配方当前第106页\共有207页\编于星期五\18点3、其它常用液（1）平衡盐溶液（2）消化液（3）pH调整液（4）抗生素溶液（5）谷氨酰胺补充液当前第107页\共有207页\编于星期五\18点（1）平衡盐溶液功效：①维持渗透压②提供缓冲系统③提供水分和无机盐当前第108页\共有207页\编于星期五\18点主要是由无机盐、葡萄糖组成。维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供营养。用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Hank's平衡液仅含有0.35g/LNaHCO3，不能用于5%CO2的环境，若放入CO2培养箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。平衡盐溶液当前第109页\共有207页\编于星期五\18点（2）消化液胰酶溶液：胰消化酪蛋白的能力常见有1：125和1：250。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右，充分溶解，过滤除菌，分装4度保存。附：Ca2+、Mg2+是细胞膜的重要组成成分，它们有促使细胞凝聚作用。当前第110页\共有207页\编于星期五\18点消化液EDTA溶液：EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。当前第111页\共有207页\编于星期五\18点消化液胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为或200000U/L,作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。当前第112页\共有207页\编于星期五\18点（3）pH调整液NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。当前第113页\共有207页\编于星期五\18点pH调整液HEPES溶液：

是一种弱酸，中文全称是4-羟乙基哌嗪乙磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。当前第114页\共有207页\编于星期五\18点（4）抗生素溶液

常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml，链霉素终浓度0.01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。当前第115页\共有207页\编于星期五\18点（5）谷氨酰胺补充溶液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。配制时应加温30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。当前第116页\共有207页\编于星期五\18点注意每一个细胞系都要进行大量，费力，费时的工作后，才能找到适当的培养液配方，对正常细胞，转化细胞，原代培养，建株培养，悬液培养等所选用的培养液、培养方法可能不同。在开始培养细胞前，应查找有关文献。当前第117页\共有207页\编于星期五\18点组织获得组织消化

接种

培养

传代冻存复苏等三、动物细胞体外培养的一般过程当前第118页\共有207页\编于星期五\18点1）制定实验计划和操作程序。2）超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。3）个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。当前第119页\共有207页\编于星期五\18点4）实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。5）分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用。

6）不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。当前第120页\共有207页\编于星期五\18点（一）取材1)理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养。2）幼体较成体、分化程度低的较分化程度高的、肿瘤组织较正常组织容易培养。

3）组织取材应先切成1cm3的小块，可置于培养液中4度保存，不易超过24小时。4）取材时避免污染及化学物质的损伤。当前第121页\共有207页\编于星期五\18点1、皮肤取材（如大面积烧伤病人）1）皮肤细胞培养的来源2）方法类似断层皮片手术的操作，面积为2－3mm2

3）不用碘酒消毒，但要严格灭菌消毒，必要时使用抗菌素。当前第122页\共有207页\编于星期五\18点2、取鼠胚1）用引颈法杀死动物2）浸入75％酒精中5分钟消毒3）开腹取材当前第123页\共有207页\编于星期五\18点3、血细胞取材1）静脉取血2）指尖或耳垂取血3）用肝素抗凝8~10u/mL4）抽血严格无菌，尽量新鲜使用。

当前第124页\共有207页\编于星期五\18点4、取鸡胚1）选新鲜受精鸡蛋，38度孵育9－12天，每天翻动鸡蛋两次。2）无菌条件下，将鸡蛋置于一个小烧杯中，令气室端向上，用碘酒消毒蛋壳，再用酒精消毒。3）用弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开卵膜，暴露出鸡胚。4）用弯头钝镊子伸入鸡胚头体之间下方，取出鸡胚。当前第125页\共有207页\编于星期五\18点从鸡蛋中取出鸡胚当前第126页\共有207页\编于星期五\18点（二）组织细胞的分离消化1、切割分离组织法用剪刀剪至1mm3左右大小的块。当前第127页\共有207页\编于星期五\18点原代外植块培养流程

当前第128页\共有207页\编于星期五\18点2、机械解离分离法某些软组织如脑、胚胎和一些肿瘤等。

当前第129页\共有207页\编于星期五\18点3、消化分解法胰蛋白酶法

适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等。钙离子、镁离子、血清等都对其有抑制作用。当前第130页\共有207页\编于星期五\18点EDTA法二乙烯四乙酸二钠，非酶性消化物用于消化分离传代细胞，能螯合钙离子，镁离子。

EDTA工作液用不含钙离子和镁离子的PBS配制成0.02%的浓度，通常和0.25％的胰蛋白酶1：1合用。

当前第131页\共有207页\编于星期五\18点4、离心法材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可以采用离心法分离细胞。一般多用500－1000rpm，5－10分钟。当前第132页\共有207页\编于星期五\18点（三）培养细胞的纯化1、自然纯化：靠自然的增殖能力，留下优势细胞，去除其他，达到纯化目的，如恶性肿瘤细胞。2、人工纯化：利用人工手段达到纯化目的。酶消化法：上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞会先被消化。机械划除法：用机械外力划除混杂分区呈片的不需要细胞。

反复贴壁法：根据不同细胞贴壁的速度不同。克隆法：培养基限定法，流式细胞分离法等。当前第133页\共有207页\编于星期五\18点组织取材组织细胞的分离培养机械法

消化法

当前第134页\共有207页\编于星期五\18点四、动物细胞培养的基本方法（一）悬滴培养法（二）培养瓶培养法（三）旋转管（瓶）培养法（四）灌注小室培养法（五）培养板培养法当前第135页\共有207页\编于星期五\18点（一）悬滴培养法

1、单盖玻片悬滴培养法①将培养液滴于盖玻片上并铺展开②将待培养的组织块铺展于培养液中央③将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封④贴壁24小时内，细胞就能从组织块四周游走适用于组织量少的原代培养当前第136页\共有207页\编于星期五\18点单玻片的再培养1）用消毒剃须刀刮去盖玻片四周的石蜡2）用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿内。3）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。4）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。当前第137页\共有207页\编于星期五\18点2、双盖玻片悬滴培养法方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，将两张盖玻片贴牢在一起。培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。当前第138页\共有207页\编于星期五\18点1、培养瓶原代培养器材：培养瓶

材料：组织块或单层细胞

（二）培养瓶培养法1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶。Earle设计了T-培养瓶。采用的材料透明，对细胞无毒。当前第139页\共有207页\编于星期五\18点基本步骤：无菌取出目的组织用刀无菌切割成1～2mm小块

以Hanks液漂洗干净,低速离心，弃上清移入培养瓶，加入适当培养基浸润培养瓶翻转1800，置15～30分钟，使其贴壁培养瓶翻回，置于37℃培养（1）组织块培养

当前第140页\共有207页\编于星期五\18点a：取材修剪冲洗 b：剪切成1mm3左右的小块c：移入培养瓶 d：分布组织小块间距5mme：翻转培养瓶并加培养液37℃静止1-2hf：翻正培养瓶进行培养 g：原代细胞生长当前第141页\共有207页\编于星期五\18点无菌取出目的组织用利刀无菌切割成细块胰蛋白酶液消化

Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清吸管吹打分散细胞移入培养瓶薄层培养（2）组织消化培养

加入30-50倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液37℃消化30-60min，每5-10min摇动一次当前第142页\共有207页\编于星期五\18点相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用当前第143页\共有207页\编于星期五\18点2、培养瓶传代培养吸出培养瓶内旧培养液加入胰蛋白酶和EDTA混和液

(以能覆盖整个瓶底为准）吸出消化液，加入培养液终止消化吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数

重新接种于新的培养瓶内培养（1）贴壁生长细胞传代

当前第144页\共有207页\编于星期五\18点贴壁生长细胞传代当前第145页\共有207页\编于星期五\18点（2）悬浮生长细胞传代离心法传代直接传代法

离心法传代：离心（1000转/分-800g）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。当前第146页\共有207页\编于星期五\18点（三）旋转管（瓶）培养法器材：旋转管，旋转瓶将培养物接种于一管状培养器皿（或转瓶）中，再将其固定在一可以旋转的装置上旋转培养的一种方法。当前第147页\共有207页\编于星期五\18点盖尔（Gey，1933年）、刘易斯（Lewis，1934年）建立了旋转管培养法。特点：培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。缺点：不易在显微镜下观察。当前第148页\共有207页\编于星期五\18点（四）灌注小室培养法

基于悬滴培养建立的方法，可用来连续观察细胞的动态变化。

研究各种因素影响作用及活细胞反应。1912年由Burrows首创。当前第149页\共有207页\编于星期五\18点（五）培养板培养法

培养板培养法又称微量培养法。一般是一次性使用。当前第150页\共有207页\编于星期五\18点五、动物细胞大规模培养技术大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益。常用的方法有：悬浮培养技术微载体培养技术多孔微载体培养技术微囊化培养技术中空纤维培养系统当前第151页\共有207页\编于星期五\18点1、微载体培养技术1967年，VanWezel开发了微载体系统培养贴壁细胞，以直径60-250um微珠作为微载体。原理：将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。扩大了细胞的附着面，提高了细

胞的生长效率和产量。当前第152页\共有207页\编于星期五\18点理想的微载体应该具备以下几个特征：（1）良好的生物相容性、无毒害；（2）良好的黏附性，一般带正电荷；（3）比表面积大，颗粒均一；（4）良好的传质性能；（5）机械稳定性好；（6）好的热稳定性。当前第153页\共有207页\编于星期五\18点微载体是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各种合成的聚合物组成的。目前商品化的有CytodexⅠ、Ⅱ、Ⅲ，biocarrier，gelibead，和DEAE－cellose等。当前第154页\共有207页\编于星期五\18点2、多孔微载体培养技术优点：易固定化；比表面大、细胞在载体内生长，免受机械损伤；可以提高通气量，强化传质。适用于贴壁细胞培养、悬浮细胞固定化连续灌流培养和大规模高密度培养系统。当前第155页\共有207页\编于星期五\18点以高温烧结法制备多孔陶瓷载体为例（P109）当前第156页\共有207页\编于星期五\18点微载体系统培养细胞具体步骤（P110）选择合适的微载体类型浸泡水化及消毒接种培养观察和细胞计数消化分离细胞传代培养当前第157页\共有207页\编于星期五\18点当前第158页\共有207页\编于星期五\18点当前第159页\共有207页\编于星期五\18点当前第160页\共有207页\编于星期五\18点当前第161页\共有207页\编于星期五\18点当前第162页\共有207页\编于星期五\18点微囊法主要适用于单克隆抗体、干扰素等的制备。其原理是将细胞悬浮于藻酸钠溶液中，当溶液通过一个可形成小滴的装置，滴入二氯化钙溶液，能形成凝聚小球。小球先后用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液洗时，表面可形成一层半透膜。细胞可在半透膜内生存，代谢过程中的废物可通过半透膜不断排出，而分泌的抗体则积累在半透膜形成的囊内。小球离心破碎后，可得到大量纯度很高的单克隆抗体。3、微囊化培养技术当前第163页\共有207页\编于星期五\18点一个培养筒内由数千根中空纤维所组成，然后封存在特制的圆筒中组成的培养系统。每根纤维管内成为“内室”，可灌流无血清培养液供细胞生长；管与管之间称为“外室”。接种的细胞就贴在管壁上，并吸取“内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。4、中空纤维培养系统当前第164页\共有207页\编于星期五\18点当前第165页\共有207页\编于星期五\18点当前第166页\共有207页\编于星期五\18点RichardKncazek1972年发明。最初使用醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成海绵状多孔结构。模拟细胞在体内生长的三维状态。目前材料有：硅胶、聚丙烯等。优点是：

占地空间少；

细胞产量高，细胞密度可达109数量级；

生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

当前第167页\共有207页\编于星期五\18点※

动物细胞生物反应器

1、生物反应器的特点分析

反应器主要结构形式：搅拌式气升式固定床式技术要求：能提供均匀温和的混合状态，剪切力小，传质效果好；反应器空间利用率高，选用合适载体系统和材料；能保证严格无菌；能控温、酸碱、溶氧和CO2浓度等；能方便快捷实现培养液连续添加，样品采集和观察。当前第168页\共有207页\编于星期五\18点2、动物细胞培养常用的生物反应器柱状中空纤维反应器板框式中空纤维反应器中心灌流式反应器灌流微载体生物反应器旋转壁式反应器当前第169页\共有207页\编于星期五\18点贴壁培养细胞转瓶机细胞转瓶培养器当前第170页\共有207页\编于星期五\18点当前第171页\共有207页\编于星期五\18点当前第172页\共有207页\编于星期五\18点当前第173页\共有207页\编于星期五\18点3、动物细胞生物反应器大规模培养产品病毒疫苗：乙肝、脊椎灰质炎和狂犬疫苗等非抗体免疫调节剂：干扰素、白细胞介质、B细胞生长因子、巨噬细胞激活因子、T细胞替代因子等多态生长因子：神经、成纤维、表皮、血清生长因子等酶类：组织血纤维酶原激活剂激素：红细胞、促黄体生成素、促滤胞素肿瘤特异性抗原：癌胚抗原单克隆抗体病毒杀虫剂：杆状病毒当前第174页\共有207页\编于星期五\18点当前第175页\共有207页\编于星期五\18点体内和体外环境不同，培养细胞的生物特性不同。在培养细胞期间，要对细胞进行常规性检测（细胞形态、细胞生长状况、营养液、微生物污染）和生物学鉴定。第三节培养细胞的检测和特性鉴定当前第176页\共有207页\编于星期五\18点1、细胞形态生长状态良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看清细胞的细微结构。细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成类纤维细胞等。只有状态良好的细胞才宜利用进行实验。在很多情况下，细胞虽机能状态不良，但仍可生长，如支原体轻度污染时即如此。因此生长与否尚不能作为判定细胞好坏的唯一标准，必须做全面分析。一、培养细胞的常规检查当前第177页\共有207页\编于星期五\18点2、细胞生长状况很多情况下，开始从组织最先“长”出的为游走细胞，它们单独活动，形态不规则，用缩时逐格显微电泳法可揭示出它们极活跃的变形、游走和吞噬活动。在游走细胞之后，接着出现的是成纤维细胞或上皮细胞。说细胞“生长”不如说移动更为恰当，因这时尚很少见细胞分裂，仅有细胞运动而已。只有当细胞分裂出现后，细胞数量逐渐增多，形成较大的生长晕或连接成片时，才真正进入了生长状态。当前第178页\共有207页\编于星期五\18点3、培养液在正常情况下，培养液呈桃红色。用一般温箱培养时，随细胞生长时间的延长，CO2积累增多，在超越缓冲范围后，营养液酸化变黄，如不及时调节pH，对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。培养液中加Hepes或用５％CO2温箱培养可使pH维持稳定。用磷酸盐缓冲系统时，可因瓶口漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶和瓶塞洗刷不洁残留碱性物，使之变碱发红。更换营养液时间，可依营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时２－３天换一次，生长缓慢时，３－４天亦可。当前第179页\共有207页\编于星期五\18点4、污染检测在长时间多量培养工作中，即使用品消毒操作严密，亦难避免偶尔发生污染。污染途径---空气、器材、操作、血清、组织样品污染对培养细胞的影响及检测

体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。当前第180页\共有207页\编于星期五\18点1）细菌的污染及检测多数培养细胞在遭到细菌的污染后，培养液短期内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。培养检测：可以取少量培养液涂布在无菌琼脂培养基上，过夜查看。防止：通常在严格的实验操作之外，培养基中加入青霉素、链霉素能够有效的防止细菌污染。当前第181页\共有207页\编于星期五\18点2）真菌的污染检测真菌的污染物通常是培养基表面漂浮的白色及黄色、黑色的小点。在显微镜下可见丝状细胞的交叉。防止：酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要时加入抗真菌剂。当前第182页\共有207页\编于星期五\18点3）支原体的污染和防止支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立生活的微生物，无细胞壁，直径最小可以达到0.2μm，在0.22μm的滤膜过滤仍然有1%左右的支原体可以通过。支原体污染后的培养细胞中没有明显可见的特征，所以很难发现。当前第183页\共有207页\编于星期五\18点相差显微镜检测：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；荧光染色法：用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。电镜检查：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。DNA分子杂交检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较复杂。当前第184页\共有207页\编于星期五\18点当前第185页\共有207页\编于星期五\18点4）病毒的污染及检测滤器对病毒没有任何阻挡作用，通常不容易被污染，因为病毒不能在细胞外复制，而且它们通常具有宿主细胞的感染限制。通常其检测方式是抗体检测及PCR检测。当前第186页\共有207页\编于星期五\18点当前第187页\共有207页\编于星期五\18点二、培养细胞的生物学鉴定1、细胞形态观察内容：细胞形态、核质比例、染色质、核仁大小及多少、微丝微管排列状态等方法：倒置相差显微镜、电镜当前第188页\共有207页\编于星期五\18点2、细胞生长情况1）细胞计数法血细胞计数器：人工计数细胞Counter计数仪当前第189页\共有207页\编于星期五\18点用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液.取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。镜下观察计数：计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。当前第190页\共有207页\编于星期五\18点2）四唑盐（MTT）比色法四唑盐是一种能接受氢原子的染料，化学名3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。细胞存活率＝试验组光吸收值/对照组光吸收值×100％MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。当前第191页\共有207页\编于星期五\18点操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）。（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔），继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，