基因工程和人类基因组

期末成绩：设计完成一篇大学生科技创新基金项目各班学委收齐，于11月11日前交给基础医学院241房间辛毅老师当前第1页\共有67页\编于星期五\7点基因工程的基本操作程序：制备目的基因；选择适当载体；构建重组载体；转化受体细胞；筛选转化细胞。

当前第2页\共有67页\编于星期五\7点基因的本质是DNA遗传与基因当前第3页\共有67页\编于星期五\7点染色体结构当前第4页\共有67页\编于星期五\7点研究基因的本质（一）

有荚膜——致死无荚膜——存活肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）感染实验一FredrikGriffith,1928当前第5页\共有67页\编于星期五\7点研究基因的本质（一）肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）感染实验二FredrikGriffith,1928当前第6页\共有67页\编于星期五\7点基因的结构、功能和调控1、DNA结构：华生(Watson)和克里克(Crick)DNA双螺旋模型（1953）DNA半保留复制（1953）获1962年诺贝尔奖

当前第7页\共有67页\编于星期五\7点基因工程的基本过程切——从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶将目的基因切开；接——用DNA连接酶将目的基因片段接到载体分子上，形成重组分子；转——借助于细胞转化手段将重组DNA分子导入受体细胞中；检——筛选和鉴定转化细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞株。当前第8页\共有67页\编于星期五\7点

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线当前第9页\共有67页\编于星期五\7点制备目的基因的从cDNA文库或基因组文库中分离；PCR（PolymeraseChainReaction）法；mRNA差异显示分离目的基因；化学合成法；当前第10页\共有67页\编于星期五\7点PCR反应PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。当前第11页\共有67页\编于星期五\7点PCR反应示意图当前第12页\共有67页\编于星期五\7点引物引物*引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。3’5’5’5’PCR技术基因组当前第13页\共有67页\编于星期五\7点3’3’3’变性、退火延伸变性、退火、延伸3’PCR原理图当前第14页\共有67页\编于星期五\7点假单胞菌NADH脱氢酶基因

721ACTTCATGCGGGGGCGCAGATACCGGTTGAGGCCGTCGACGATGACGGTCATGCCGGTTT781TCAAGGCGCCATGAATGGCCAGCTGGTGCATGCGATAGAGCGAGGCATAGAACAGCTTGG841CCAGGCGCCCCTCGATGAACAGGCTGCGTGCCGAGGCGCCGCGCATCAGGCTGCCCACGG901CATCGAAGTGCGCCAGCGAGATCAGCGAGCCGCGATCGCGGAAGACGAAATCCTTGAGGG961GCTTGCCGTCCATTGCCGCGCGCAGGTTGTGGTACAACAGGCTGGCTTGCTGATGCGCGG1021CCTGGGCGCCAGGCGGTACGCGCTTGTCGTCGGGTTGCGGGCAGGAGGCGCAGTCGCCCA1081AAGCGAAGATGCGATCGTCGTCGATGCTCTGCAGGGTCTGATGCACCTTGAGCTGATGAT1141TGCGCTCGGTGGAAAGCCCCAGTTCGGACAGAAATGCCGGCGCGCGTATGCCGGCGGCCC1201AGACGTTGAGGTCGGTGGCAATGCGCGTCTCGTCGGCGGTGACGAAACCGTGCTCGTCGG1261CGCAGGTCACGCGGGTGTCGACATGGATCTGCACGCCCAGGCGTTCCAGCTCCTGGTGCA1321CGGCGCGGCTGATGCGCTCGGGCAGCGCCGGCAGGATGCGCGGTGCTGCCTCGATGAGGT1381GGATCTCCAGCTTGCCGCTGTCCATGGCGGTGAACCCGTAGCTGTGCAGCATCTTGGAGG1441CGCCGATCAGTTCGGCGGCCAGCTCGACGCCGGTGGCACCGGCACCGACGAGCCCCACGC1501TCAGGTTGGGATGGGTGCGCCGCTCGGGATCGCTGTACCGCAGGAAGGTGTTGAGCATGT1561CCTGGCGGAAGCTTTCGGCCTGTTGCGGGCTGTCGATGAAGTGGCTGTGCTTGGCCACGC1621CCGGGGTGCCGAAGTCGTTGGAGACGCTGCCCAGCGACATCACCAGGTAATCGTACTCCA1681GCGTGCGCGCCGGCAGGATCACGACGCCGTCGTCGTCGATGATCGGCGCCAGCGTGATGG1741TGCGGTTGTCGCGGTCGAGGTTGCTGAGCGTGCCGCGTTGAAAGCGGTAGCCGTGCGCCT1801TGGAATGCCCCTGGTAGGACACTTCATCGAGGCTGGAATCGAGCACGCCCGTGGCCACTT1861CATGCAGCAGGGGCTTCCAGATGTGCGTGGCGTTGCGGTCGACCAGAACGATCTCGGCGC1921GTTGGCGCTTGCCGAGCTTGCGCCCCAGGCGGGTGACCAGTTCGAGGCCACCTGCGCCTC1981CCCCGACCACCACGATGCGCGGTGTAGACATGATGGACTCCCGAAGAACGAAACATGGAA2041AAAGGGTGTCGCCAGGGTCGGGCATCGCAGCGAAACGCCAAGGTACGAGGCGCCTGGGAA2101GGCGTGTCGTGACGCGGGGGCGCTGGCGCCTGGTGTCGGCGACGTCTGCGTATAGAATAA当前第15页\共有67页\编于星期五\7点PCR扩增一个约1.3kb的基因1904bp1584bp1375bp947bp831bpM1当前第16页\共有67页\编于星期五\7点载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的DNA片段与其连接，而进行复制。

常用载体：质粒、病毒；基因工程载体当前第17页\共有67页\编于星期五\7点理想载体的基本条件：可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA当前第18页\共有67页\编于星期五\7点

存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子;

具有自我复制功能;

带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物;

经改造后具有多克隆位点;质粒当前第19页\共有67页\编于星期五\7点当前第20页\共有67页\编于星期五\7点

不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段基因重组当前第21页\共有67页\编于星期五\7点当前第22页\共有67页\编于星期五\7点限制性核酸内切酶识别特定碱基序列当前第23页\共有67页\编于星期五\7点磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接当前第24页\共有67页\编于星期五\7点重组质粒的酶切分析4268bp3530bp1584bp1375bp947bpM123

当前第25页\共有67页\编于星期五\7点

通过物理，化学或生物的方法将重组DNA转入受体细胞。重组DNA导入受体细胞当前第26页\共有67页\编于星期五\7点受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组载体转入细菌重组载体CaCl2处理当前第27页\共有67页\编于星期五\7点ß-半乳糖苷酶法筛选转化子当前第28页\共有67页\编于星期五\7点白色菌落提示有外源基因插入当前第29页\共有67页\编于星期五\7点抗Amp质粒宿主细菌含Amp培养基当前第30页\共有67页\编于星期五\7点含重组质粒大肠杆菌的蛋白质SDS电泳图谱

87654321M——94kDa——67kDa——43kDa——30kDa——20kDa当前第31页\共有67页\编于星期五\7点基因工程菌的构建与生产当前第32页\共有67页\编于星期五\7点分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白目的蛋白的分离纯化当前第33页\共有67页\编于星期五\7点基因载体目的基因

质粒噬菌体病毒PCRcDNA人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶

重组体

转化转染体外包装带重组体的宿主细胞

表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达当前第34页\共有67页\编于星期五\7点1、基础理论研究：基因的结构与功能。基因的人工定点突变。人类基因组计划基因工程的应用当前第35页\共有67页\编于星期五\7点疾病的诊断：疾病的预防：基因工程疫苗。疾病的治疗：基因工程药物、基因治疗。2、医学领域中的应用：当前第36页\共有67页\编于星期五\7点基因工程方法生产蛋白质药物当前第37页\共有67页\编于星期五\7点3、植物基因工程技术及应用植物基因工程的受体是植物细胞，主要在作物抗病虫害、抗逆性、提高品质、提高产量、医药等方面应用。至1998年4月，世界各国批准进行的大田实验已达4387项。当前第38页\共有67页\编于星期五\7点植物基因工程的优点可以赋予植物一些通过其它途径几乎不可能获得的新性状。可以更有目的的改良植物性状。可以缩短培育新品系的周期。增产：使作物产量提高5%～15%；

不用或少用农药：当前第39页\共有67页\编于星期五\7点转基因植物研究进展自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以及杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。当前第40页\共有67页\编于星期五\7点我国的转基因植物1996年我国投入研究和开发的转基因植物仅为47种、涉及各类基因103个。目前，我国正在研究和开发的各种生物物种已超过100种，涉及动物、植物、微生物基因达200多个，若干作物品种已具备了产业化条件。就整体研究水平而言，我国在发展中国家处于领先地位，一些领域已经进入国际先进行列。我国是世界上继美国之后第二个拥有转基因抗虫棉自主知识产权的国家。2004年我国的生物技术棉花种植面积已达到370万公顷。由于节水、抗虫、节约劳动力的投入，每年为农民增收50亿元人民币。我国的彩棉产量已占到世界彩棉生产总量的1/3，成为全球最大的彩棉生产国；当前第41页\共有67页\编于星期五\7点2全球转基因作物播种面积增长12%当前第42页\共有67页\编于星期五\7点耐贮藏西红柿通过反义RNA技术，阻断果实成熟时乙烯的生成，延长果实的贮藏期。当前第43页\共有67页\编于星期五\7点动物基因工程培养出了包括猪、牛、羊、马、鸡、鱼等多种转基因动物，涉及的基因有生长激素基因、抗冻基因、抗病毒基因等。当前第44页\共有67页\编于星期五\7点转当前第45页\共有67页\编于星期五\7点生物反应器利用乳腺生物反应器生产贵重药物：红细胞生成素（肿瘤化疗的辅助药物）；铁蛋白（促进铁的吸收）；抗胰蛋白酶（治疗囊性纤维化及肺气肿）；凝血因子VIII及IX（治疗血友病）；人血清白蛋白（治疗烧伤）；2005年，年产值达350亿美元。当前第46页\共有67页\编于星期五\7点利用细胞培养和转基因牛生产医用蛋白的成本及产量比较

细胞培养转基因牛培养液成本/元.L-1320~4002~4培养液中的蛋白质含量/mg.L-110~501000~10000每克终产品的成本/元.g–16400~400000.15~4.00当前第47页\共有67页\编于星期五\7点人类科学史上的三大计划之一人类基因组计划（HGP）当前第48页\共有67页\编于星期五\7点

1986年3月美国生物学家、诺贝尔奖得主Dulbecco首先提出——肿瘤研究的一个转折点：人类基因组的全序列分析

1990年，美国国会正式批准，1990年10月1日开始实施，计划耗资30亿，历时15年。HGP产生的背景当前第49页\共有67页\编于星期五\7点Celera遗传公司的竞争1998年5月一批科学家在美国罗克威尔组建Celera遗传公司，计划投入3亿美元，到2001年绘制出完整的人体基因图谱，与国际人类基因组计划展开竞争。当前第50页\共有67页\编于星期五\7点

基因组与基因基因组：维持基本生理功能的一整套基因，即配子所含的基因总和，人23条染色体上的所有基因。当前第51页\共有67页\编于星期五\7点HGP的任务与进展

15年内，完成23对染色体上30亿个核苷酸的测序并识别其中的基因。当前第52页\共有67页\编于星期五\7点2001年2月12日，由美国、日本、德国、法国、英国和中国组成的研究机构及美国塞莱拉公司联合宣布对人类基因组的初步分析结果：人类基因组有31.6亿个核苷酸，3~3.5万个基因；基因在染色体上不是均匀分布的，有些区域有很多的基因，有些区域（约1/4）则象“荒漠”；这意味着原来被认为的“垃圾DNA”的功能应该被重新认识；不同种族有99.99%的相同基因，并不比同一种族不同个体之间的差异大。当前第53页\共有67页\编于星期五\7点人与黑猩猩DNA序列差异为1.44%2004年5月27日,英国《自然》杂志发表了我国科学家参与完成的人与黑猩猩比较基因组学研究取得的重大成果。科学家发现,人与黑猩猩DNA序列差异为1.44%。当前第54页\共有67页\编于星期五\7点人与黑猩猩染色体比较当前第55页\共有67页\编于星期五\7点《Nature》公布精度大于99%人类基因组完成图国际人类基因组计划合作组织2004年10月21日在英国《自然》杂志上宣布，一张精度大于99%、误差小于十万分之一的人类基因组完成图已成功绘就。经过多国科学家近3年的精心“修纂”，原本（2001年）遗漏了15万个细节的“人类生命天书”几近完美地完成。完成图显示，庞大的人类基因组似乎只包含2万至2.5万个基因，大大少于此前估计。当前第56页\共有67页\编于星期五\7点几种生物的基因数目比较当前第57页\共有67页\编于星期五\7点染色体测序的策略当前第58页\共有67页\编于星期五\7点沃森：“能看到自己的基因组图谱，我感到非常兴奋。”2007年5月在休斯敦的贝勒大学举行的庆祝仪式上，79岁的沃森获得了一张储存着自己全部基因组序列的DVD光盘。沃森成为世界第一份完全破译的“个人版”基因组图谱的拥有者。由于采用了新的测序技术，不但只用了不到2年的时间，而且仅花费了约100万美元。当前第59页\共有67页\编于星期五\7点美国Celera公司创始人

温特尔的基因图谱成功绘出2007年9月克雷格•温特尔的详细基因组序列被公布，这是世界上第一个个体的二倍体基因组序列。发现温特尔的两组染色体序列存在0.5%的较大差异。他的APOE序列和SORL1基因均表明他存在较高的罹患早老性痴呆病和心血管病的风险；

当前第60页\共有67页\编于星期五\7点人类X染色体(1)研究人员在2005年3月17日在《nature》杂志上公布了X染色体上99.9％基因的测序。它包含有多达1098个基因，其中只有54个在Y染色体上有相应功能的等位基因。Y染色体上仅有大约78个基因。当前第61页\共有67页\编于星期五\7点人类X染色体“线粒体DNA”是只通过母系一脉传递的遗传基因，男性也能从母亲那里继承“线粒体DNA”，却无法将它遗传给自己的后代。也就是说，如果一个女性生下的全都是儿子，她的“线粒体DNA”遗传链将因此终止。英国牛津大学人类遗传学教授西基斯称，“线粒体DNA”一般很难发生改变，平均要过2万年“线粒体DNA”才会发生微小的变异。英国牛津大学人类遗传学家通过10多年的DNA研究发现，每个线粒体DNA相同的人都是