基因与基因工程(xin)【】

1847年，被任命为神父；1849年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；1851年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；1854年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新篇章；1856年，开始长达8年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）1865年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了他的研究结果和理论解释；1866年，发表著名论文《植物杂交实验》，首次提出了遗传因子、显性性状和隐性性状等遗传学概念；1868年，当选奥古斯汀修道院院长，此后再也无力从事研究；1884年1月6日去世！当前第1页\共有62页\编于星期五\7点后人在分析孟德尔成功发现遗传第一定律和第二定律的原因时，一致认为选择豌豆为实验材料具有决定性的意义。那么豌豆具有什么样的生物学特性呢？（2）豌豆的生物学特性

当前第2页\共有62页\编于星期五\7点a.不同的豌豆品系之间，通常存在着差异明显、易于区别而又稳定遗传的相对性状特征；（开紫花的豌豆植株）b.豌豆花的结构比较特殊，具有雄配子的花药和具有雌配子的胚珠是由花瓣包裹着。因此它是一种严格的自花授粉植物；（豌豆花的结构）c.豌豆具有较大型的花器官（即生殖器官），便于去雄，进行人工授粉实验。（豌豆人工授粉）当前第3页\共有62页\编于星期五\7点（3）孟德尔的单因子豌豆杂交实验

－－遗传因子分离定律

1856年至1863年，孟德尔在奥古斯汀修道院的后花园进行了长达8年的豌豆杂交实验。他首先选择了七对区别分明而又能稳定遗传的性状作仔细的观察。这七对性状是：花着生的部位……腋生和顶生种子的形状……圆形和皱形种子内部颜色……黄色和绿色花朵的颜色……紫色和白色植株茎杆长度……长茎和短茎成熟豆荚外形……饱满和节缩未成熟豆荚颜色……绿色和黄色当前第4页\共有62页\编于星期五\7点Table1.AsummaryofthesevenpairsofcontrastingtraitsandresultsofMendel’ssevenmonohybridcrossesofthegardenpea(Pisumsativum)当前第5页\共有62页\编于星期五\7点

（4）孟德尔双因子豌豆杂交实验数据统计

世代种子表型种子数量比例亲代

绿圆×黄皱－－F1代

黄圆－－F2代

黄圆3159.84黄皱1013.16绿圆1083038绿皱321.0总数556当前第6页\共有62页\编于星期五\7点（5）遗传因子的自由组合定律：根据上述实验结果，孟德尔推想：由两对等位因子杂交产生的杂种F1代植株，在形成配子过程中，两对等位因子的分离是彼此独立互不相关的，而在形成合子的过程中，不同因子之间又是自由组合的。这就是所谓的遗传因子独立分配律，或叫自由组合律，亦即是孟德尔第二定律。孟德尔还进行了多因子豌豆杂交实验，其结果虽然比较复杂，但它同样遵循遗传因子的独立分离和自由组合的原则。

当前第7页\共有62页\编于星期五\7点

（6）孟德尔遗传因子被正式定名为基因

1909年，丹麦的一位生物学家约翰逊，根据希腊文“给予生命之义”创造了“基因”这个名词，用来代替孟德尔的“遗传因子”。但是需要指出，约翰逊当时所说的基因，并不代表遗传物质实体，只是一种与细胞的任何可见的形态结果均无关系的抽象单位，也就是遗传性状符号！当前第8页\共有62页\编于星期五\7点2、摩尔根的基因论

（1）摩尔根生平简介

1866年9月25日，ThomasHantMorgan出生于美国肯塔基州的列克星敦市的一个富裕家庭。1880年，14岁的少年摩尔根考入肯塔基州立学院预科班学习，两年后转入本科。1886年，以全班第一名成绩从肯塔基州立学院毕业，进入约翰.霍普金斯大学从事实验胚胎学研究；当前第9页\共有62页\编于星期五\7点1890年，在约翰.霍普金斯大学获理学博士学位；1891～1903年，在布林莫尔女子学院任教，同时在其它一些研究机构从事胚胎学方面的研究；1904～1928年，担任哥伦比亚大学动物学教授，进行遗传学与进化论领域的科学研究；1927～1931年，担任美国科学院院长；1928年退休，同年发表名著“基因论”；1928～1945年，任加州大学生物学主任；1930年，担任美国科学促进联合会主席；1933年，获诺贝尔生理学及医学奖；1945年12月4日，因动脉血管破裂在美国加州的帕萨迪纳市逝世。当前第10页\共有62页\编于星期五\7点（2）果蝇的生物学特性

a.繁殖能力强，产卵数量多；b.繁殖速度快，世代时间短（9天左右）；c.染色体数目少，仅4对，且形态各异，易于辨认；d.拥有大量的各种突变体；e.个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。

当前第11页\共有62页\编于星期五\7点（3）果蝇的染色体组

性染色体――指与生物个体的性别决定有直接关联的染色体。例如果蝇的X染色体和Y染色体。

常染色体――除了性染色体之外的，不直接参与生物个体性别决定的染色体叫常染色体。例如果蝇的第II对，第III对染色体，均为常染色体。果蝇有4对染色体，其中1对为性染色体，其余3对为常染色体。当前第12页\共有62页\编于星期五\7点

（4）果蝇眼色基因的性连锁遗传1910年，摩尔根及其助手从红严果蝇群体中发现了一只白眼的雄果蝇，他们将白眼雄果蝇同来自同一父母的姊妹红眼雌果蝇交配，结果产生的F1代果蝇，无论是雄的还是雌的，无一例外都是红眼的。这个结果说明：a.

果蝇红眼是显性性状，白眼是隐性性状；b.

亲代白眼雄果蝇是隐性纯合子；c.

亲代红眼雌果蝇是显性纯合子；摩尔根等人将上述所产生的F1代的红眼雄果蝇同红眼雌果蝇相互交配，产生的子二代（F2）果蝇中，红眼同白眼的比例恰好为3:1。但有趣的是，所有的白眼果蝇都是雄性的，没有一只是雌性。当前第13页\共有62页\编于星期五\7点这说明：白眼性状与性别有联系，摩尔根等人推测控制果蝇的白眼隐性基因是位于X染色体上。摩尔根等人的工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体联系起来了，从而建立了基因的遗传物质基础，建立了基因的染色体理论，使基因学说得到了普遍的承认。当前第14页\共有62页\编于星期五\7点（5）连锁与交换定律

基因的连锁与交换定律，是由美国著名的遗传学及胚胎学家摩尔根与他的学生所建立的。由于该定律极大地完善并丰富了孟德尔遗传学理论，因此后人将它与孟德尔第一遗传定律、第二遗传定律并列，称之为遗传学第三定律。当前第15页\共有62页\编于星期五\7点（6）摩尔根的学术贡献

摩尔根及其学术的工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体连系了起来，从而确证了基因的遗传物质基因，建立了基因的染色体理论，为基因工程的建立作了卓越的贡献。摩尔根生活低调，衣着朴素，热心科研，勤奋工作，知道38岁才与其女友结婚。为了不影响科研工作，摩尔根借故没有出席诺贝尔奖的颁奖典礼。他总结自己为什么会在科学研究中作出诸多发现的原因时说“一靠勤奋，二靠实验材料得当，三靠愿意放弃没有任何证据的假说，最后还得少开些遗传学大会”。当前第16页\共有62页\编于星期五\7点3.基因的载体是DNA

在孟德尔和摩尔根的基因论被科学工作者广泛接受之后，关于基因的载体（或说是化学本质）是DNA还是蛋白质，一直存在着两种不同的意见。

（1）1944年，O.Avery等人的肺炎链球菌毒性转化实验证明，基因的载体是DNA，而不是蛋白质。S型肺炎链球菌――具荚膜，光滑，有毒。R型肺炎链球菌――无荚膜，粗糙，无毒。当前第17页\共有62页\编于星期五\7点结论：使肺炎链球菌毒力性状发生转化的因子是DNA，而不是蛋白质。这有力地证明基因的遗传载体是DNA而不是蛋白质。当前第18页\共有62页\编于星期五\7点（2）1952年，A.DHersheyandM.Chase应用放射性同位素双标记技术，证明菌体的遗传物质（基因的载体）也是DNA而不是蛋白质。实验现象：用放射性同位素32P和35S分别标记噬菌体的内部DNA和外部蛋白质，然后感染寄主细胞。结果发现只有32P标记的DNA注入大肠杆菌细胞。结论：在噬菌体中，基因的载体也是DNA而不是蛋白质。当前第19页\共有62页\编于星期五\7点

DNA分子的半保留复制模型（3）1953年，J.Watson和F.Crick建立了DNA的双螺旋模型；1958年，M.Meselson和F.W.Stahl在此基础上发现了DNA分子半保留复制机理。从而解决了基因的自我复制和代代相传的问题。至此，基因的分子本质是DNA而不是蛋白质已是不争的事实！当前第20页\共有62页\编于星期五\7点4.基因的编码产物

基因是细胞中所有RNA及蛋白质分子的“蓝图”，有些基因编码的最终产物是RNA分子，例如rRNA基因、tRNA基因及其它小分子量的RNA基因等；而其它一些基因编码的最终产物是蛋白质，这些蛋白质是通过mRNA中介合成的。

当前第21页\共有62页\编于星期五\7点5.遗传密码的破译－－DNA的核苷酸顺序与蛋白质氨基酸顺序关系

Beadle、Tatum和Ingram等人的工作，虽然确立了基因（DNA）与蛋白质多肽链之间的关系，也就是说蛋白质是由基因编码的，但是，基因的DNA分子是由4种不同的核苷酸（A、T、G和C）排列组合而成的，而蛋白质分子中的多肽链则是由20种氨基酸排列组合而成。那么基因DNA分子中的核苷酸碱基顺序，同蛋白质多肽链中的氨基酸顺序之间存在着什么样的关系呢？遗传密码的破译正确地回答了这个问题。当前第22页\共有62页\编于星期五\7点（1）中心法则1958年，F.Crick提出了解释DNA，RNA及蛋白质三者关系的所谓中心法则：

DNARNA蛋白质根据中心法则DNA会自我复制，而RNA及蛋白质二者都不能够自我复制，因此生物体中能够永久保存代代相传下去的是DNA分子，或说是基因。当前第23页\共有62页\编于星期五\7点DNA在复制过程中双链解开，以单链形式作为合成自己互补链（cDNA）的模板，其碱基配对原则是：

腺嘌呤（A）－胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）－胞嘧啶（C）在DNA到RNA的转录过程中，单链的cDNA则是作为指导RNA合成的模板。RNA可分成tRNA、rRNA、其它小分子RNA和mRNA，其中只有mRNA可转译成蛋白质。转录过程中的碱基配对原则：

腺嘌呤（A）－尿嘧啶（U）鸟嘌呤（G）－胞嘧啶（C）当前第24页\共有62页\编于星期五\7点（2）遗传密码遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程，叫作基因的表达。它涉及遗传信息的转录和转译两个步骤。

转录――根据碱基互补原则，遗传信息从DNA的核苷酸序列形式转换成RNA核苷酸序列形式的过程叫作转录，也叫RNA合成。转译――遗传信息从mRNA的核苷酸序列形式，转变成蛋白质多肽链氨基酸序列形式的过程叫作转译，也叫蛋白质合成。当前第25页\共有62页\编于星期五\7点当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，转译与转录不同，它不是简单的核苷酸序列的转换过程，而是将mRNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链上氨基酸语言的负责过程，是涉及到两种不同语言信号之间的更换问题。因此，在从mRNA到蛋白质多肽链的转译过程中，必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才能够将RNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质多肽链分子上的氨基酸顺序联系。这种遗传密码在1966年已经完全破译。当前第26页\共有62页\编于星期五\7点（3）通用遗传密码表

第一位字母（5’-末端）第二位字母第三位字母（3’-末端）UUCAGUCAGPhePheLeuLeuSerSerSerSerTyrTyrStopStopCysCysStopTrpCLeuLeuLeuLeuProProProProHisHisGlnGlnArgArgArgArgUCAGAIleIleIleMetThrThrThrThrAsnAsnLysLysSerSerArgArgUCAGGValValValValAlaAlaAlaAlaAspAspGluGluGlyGlyGlyGlyUCAG注1.Met和Val的密码子AUG和GUG，也叫起始密码子，表中加方框表示。注2.UAA、UAG及UGA三个密码子为终止密码子，表中以“Stop”表示。当前第27页\共有62页\编于星期五\7点6.基因的结构

按照细胞中是否存在真正有形的细胞核结构，可把生物分成真核生物和原核生物两大类。例如大肠杆菌细胞中的染色体并没有被核膜包围，因此没有真正的有形的细胞核结构，属于原核生物。而诸如高等植物和动物，细胞中的染色体被核膜包围成一种有形的细胞核结构，属于真核生物。与此相应，也可把基因分成真核基因和原核基因两大类，两者在结构上是有差别的。

当前第28页\共有62页\编于星期五\7点（1）基因的基本组成部分

不管是真核基因还是原核基因，都具有如下4个基本的组成部分：a.编码区――包括起始密码子，终止密码子和氨基酸密码子；b.非编码区――5’-末端非转译区，3’-末端非转译区，真核基因的间隔区；c.启动区――RNA聚合酶结合部位，由此启动基因的转录作用；d.终止区――具有终止转录作用的功能。当前第29页\共有62页\编于星期五\7点（2）原核蛋白质编码基因的结构

基因转录区启动子终止子转录ATGTAA5’-UTR3’-UTR转录终止位点RNA起点核糖体结合位点当前第30页\共有62页\编于星期五\7点（3）真核蛋白质编码基因的结构

基因转录区启动子终止子转录ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点初级RNA转录本剪辑ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点核糖体结合位点mRNA基因转录区启动子终止子转录ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点初级RNA转录本剪辑ATGTAA5’-UTR3’-UTRRNA起点mRNA外显子内含子当前第31页\共有62页\编于星期五\7点二.基因工程原理1.基因工程诞生的基础

（1）基因工程诞生的理论基础a.在上世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。

b.在上一世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解决了基因的自我复制和遗传传递的问题。

c.在上世纪50年代末期和60年代初期，科学工作者相继提出了“中心法则”、“操纵子学说”，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息流向和表达的问题。

当前第32页\共有62页\编于星期五\7点小结：基因工程诞生的理论基础是（a）基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，

从而解决了遗传物质的基础问题。（b）DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机理，

从而解决了基因的自我复制和遗传传递问题。（c）“中心法则”、“操纵子学说”和遗传密码的破译，

从而解决了遗传信息的流向和表达问题。当前第33页\共有62页\编于星期五\7点（2）基因工程诞生的技术基础：（a）DNA分子体外切割与连接技术的建立；

（b）DNA分子核苷酸序列测定方法的发明；（c）大肠杆菌遗传转化技术的建立；（d）琼脂糖凝胶电泳技术的建立与应用；

（e）核酸杂交技术的建立，(DNA片段的分离和酶切图谱的构建等)(Southern和Northern杂交术)。当前第34页\共有62页\编于星期五\7点2.基因工程（Geneengineering或geneticengineering）

定义：在体外试管中应用DNA重组技术将外源核酸分子（基因）插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质重组体，并使之转移到原本没有这类分子（基因）的受体细胞内，而能持续稳定地繁殖与表达。这样的过程叫做基因工程，有时也叫做遗传工程。当前第35页\共有62页\编于星期五\7点

（1）基因克隆与DNA克隆a.在DNA克隆中插入载体的DNA片段，绝大多数是不含有基因编码序列的，或者说是不含有完整的基因编码序列的。b.拿人的基因组DNA为例，全长达3×109bP

，但其中基因的编码序列不到2%。因此绝大多数DNA片段是不含有基因编码序列的。b.基因克隆实质上是指应用类似于DNA克隆的技术，分离纯化含目的基因的DNA片段的实验操作过程。当前第36页\共有62页\编于星期五\7点

（2）“克隆”一词的概念

在中文中“克隆”一词兼具名词、动词和形容词三种不同词义。“克隆”作名词使用时，是指从一个共同的祖先无性繁殖而来的一群遗传同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊的生命群体；“克隆”作为动词使用时，则是指从同一祖先经过无性繁殖产生这类遗传上同一的DNA分子、细胞或个体的过程；在中文中“克隆”还可作为形容词使用。例如克隆羊（Clonedsheep）。当前第37页\共有62页\编于星期五\7点（3）名词“克隆”的三种层次：个体水平┈具有相同基因型的同一物种的两个或多个个体。例如从同一个受精卵分裂而来的同卵双生子（monozygotictwins），便是属于同一克隆；细胞水平┈从同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的细胞群体。（在细胞学、胚胎学中使用）；分子水平┈在分子生物学中特指带有一段插入DNA的载体分子/寄主细胞单位。例如大肠杆菌寄主细胞中的重组质粒载体，叫做克隆。当前第38页\共有62页\编于星期五\7点（4）基因克隆步骤：

从所选用的实验材料中分离、纯化基因组DNA，经适当限制酶消化切割，产生出DNA限制片段群体

↓（限制片断切割）在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重组DNA分子（重组体）混合物

↓（体外重组）将此重组DNA分子混合物转化到适当的受体细胞，进行复制与繁殖

↓（遗传转化）从大量的转化细胞群体（即DNA文库），筛选出获得重组DNA分子（含目的基因）的转化子克隆

↓（转化子克隆的筛选）从这些转化子克隆中，提取己经得到扩增的目的基因，供进一步研究用

↓（目的基因分离）将目的基因亚克隆在表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的产品（目的基因的表达）。当前第39页\共有62页\编于星期五\7点3.核酸内切限制酶-DNA分子的“剪刀”（1）定义：核酸内切限制酶（Restrictionendonuclease），又叫做限制酶（Restrictionenzyme），是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA分子的核酸内切酶。因此有人形像地将核酸内切限制酶形象地比作DNA分子的剪刀。自然界中存在着大量的核酸内切限制酶，迄今已经从各种不同的微生物中分离纯化出三千多种的核酸内切限制酶。它们总共能够识别200种左右的不同的特异性识别序列。 当前第40页\共有62页\编于星期五\7点（2）几种常用限制酶的识别序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’HindIII5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’当前第41页\共有62页\编于星期五\7点（3）DNA分子的体外切割

a.体外切割――在体外的反应体系中，在一定温度下保温（一般是37℃），核酸内切限制酶便可以对双链DNA分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶切消化作用。b.粘性末端――DNA分子在限制酶作用下形成的，具有互补碱基的单链末端结构，它们之间可以通过互补碱基间的配对作用而重新连接起来。

当前第42页\共有62页\编于星期五\7点c.EcRI酶切（识别位点为GAATTC）后，

形成5，-P的单链粘性末端5’-GAGATCTTGAATTC

ATAAGTC-3’3’-CTCTAGAACTTAAG

TATTCAG-5’5’-GAGATCTTG-3，

3’-CTCTAGAACTTAA-P-5，＋

5，-P-AATTCATAAGTC-3’3，-GTATTCAG-5，当前第43页\共有62页\编于星期五\7点d.PstⅠ的识别位点及切割形成的

3，-OH单链粘性末端↓5‘-GGCCTTCTGCAGAATCGG-3'3'-CCGGAAGACGTCTTAGCC-5‘

↑

↓

5'-GGCCTTCTGC-A-0H-3'3‘-CCGGAAG

＋

GAATCGG-3'

3'-0H-ACGT

CTTAGCC-5‘

当前第44页\共有62页\编于星期五\7点（4）同裂酶、同尾酶和异裂酶a.同裂酶（Isoschizomers)具有同样的识别位点，产生同样的粘性末端，但是从不同的细分离出来的，因而具有不同名称的一类核酸内切限制酶。例如HpaⅡ和MspⅠ就是一对具有同样识别序列：的同裂同裂酶形成同样的粘性末端，重组后识别序列不变！b.同尾酶（Isocaudamers）一组来源不同、识别序列各异，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。例如BanHⅠ、BaglⅡ和Sau3A，即是组同尾酶，当前第45页\共有62页\编于星期五\7点

（5）DNA连接酶（1）连接酶――能够利用ATP分子中γ-磷酸集团的能量，通过催化两条并排的DNA链的5’-P-集团和3’-OH集团之间形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的核酸酶。（2）连接条件：

a.

被连接的两条DNA片段，一条链的3’-末端具有一个游离的-OH集团；另一条的5’-末端存在一个磷酸集团（P）。b.

在-OH和-P集团之间形成磷酸二酯键是一种需要能量的过程（ATP）。c.最佳连接温度：4～16℃。当前第46页\共有62页\编于星期五\7点4.基因克隆的载体（1）基因克隆载体的类型：

（a）质粒载体；（b）柯斯质粒载体；（c）λ噬菌体载体；（d）单链噬菌体载体；（e）噬菌粒载体；（f）酵母人工染色体载体（g）YAC后载体当前第47页\共有62页\编于星期五\7点（2）质粒载体

（a）质粒（Plasmid）的定义

一般指一类独立于细菌染色体DNA（染色体外）的自主复制的共价、闭合、环形双链的DNA分子。（b）质粒的一般特性

共价、闭合、环形双链的DNA分子（covalentlyclosedcirculerDNA,cccDNA）除了酵母杀伤质粒RNA外，所有的质粒都是DNA。

质粒DNA的复制必须依赖于寄主细胞提供核酸酶及其他蛋白质分子。当前第48页\共有62页\编于星期五\7点

（3）质粒DNA的分子构型a.sc构型……即cccDNA所呈现的超螺旋构型，走在凝胶的最前面；b.OC构型……即开环DNA（OCDNA）的构型，其中一条DNA链保持完整的环形结构，另一条链则出现一至数个缺口，走在凝胶的最后面；c.L构型……发生双链断裂形成的线性DNA的构型。通称L型，走在凝胶的中间部位。当前第49页\共有62页\编于星期五\7点（4）质粒载体必须具备的条件a.一般具有l个复制区或复制因子；b.具有l到2个抗生素抗性基因（供选择重组子）；c.具有若干种核酸内切限制酶的单个切点

（供外源DNA片段的插入）；d.较小的分子量和较高的拷贝数（质粒载体的克隆能力约5-6kb）。当前第50页\