发育生物学发育生物学研究技术

发育生物学研究技术当前第1页\共有48页\编于星期五\18点常用发育生物学研究技术简介显微镜技术(成像imaging);组织切片技术(经典解剖形态学morphology);生化分子生物学;原位杂交技术(insituhybridization);显微注射;报告基因技术;细胞标记技术;当前第2页\共有48页\编于星期五\18点显微镜技术目的：观察胚胎个体分类：

光学(optical)显微镜:体视显微镜:组织分离用

荧光显微镜：当前第3页\共有48页\编于星期五\18点显微镜技术激光共聚焦显微镜(laserconfocal)：荧光标记，对胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性或定量研究；图像采集的效果很好；细胞或组织的三维重塑(reconstructing)当前第4页\共有48页\编于星期五\18点组织切片技术目的：观察胚胎的内部组织学结构分类：石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样品中核酸的保存较好，但切片的质量差。当前第5页\共有48页\编于星期五\18点分子生物学技术目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育时期或特定组织中的表达分类：Polymerasechainreaction(PCR):DNAamplificationReal-timequantitativePCR:RNA定量RT-PCR/Northernblotting:mRNA

expressionWesternblotting:protein

expression

免疫共沉淀

(Co-IP):protein-proteininteraction当前第6页\共有48页\编于星期五\18点NorthernBlottingAnalysis当前第7页\共有48页\编于星期五\18点SouthernBlottingAnalysis当前第8页\共有48页\编于星期五\18点Real-timePCR仪当前第9页\共有48页\编于星期五\18点原位杂交技术目的：检测某一特定基因mRNA在某胚胎和组织中的分布情况分类：放射性标记探针：放射自显影非放射性标记探针：地高辛(DIG)-免疫组化

荧光素-荧光免疫组化(FISH)当前第10页\共有48页\编于星期五\18点原位探测基因表达

GeneexpressingguidingdevelopmentWhenandwhereparticulargenesareactiveIntactembryosorsectionsofembryosInsituhybrid:probes-radioactiveisotope,fluorescencetagoranenzymeDectection:autoradiography,fluorescencemicroscope,enzyme-substratereaction当前第11页\共有48页\编于星期五\18点原位探测基因表达当前第12页\共有48页\编于星期五\18点原位探测基因表达DistributionofmRNAforthegrowthfactorVg-1intheamphibianegg.Insituhybridizationwitharadioactiveprobe.(yellowsignals)当前第13页\共有48页\编于星期五\18点原位探测基因表达当前第14页\共有48页\编于星期五\18点利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱mRNA的检测当前第15页\共有48页\编于星期五\18点FISH探测基因表达当前第16页\共有48页\编于星期五\18点报道基因(reportergene)技术目的：用于启动子/增强子的分析研究。采用一些产物易于检测的基因(报道基因)与待研究的表达调控序列串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产物的表达来研究目的片断的转录调节活性。常用报道基因分类：

绿色荧光蛋白(GFP):分布用荧光显微镜观察

lacZ基因:编码β-半乳糖苷酶,用特异底物显色研究其产物分布

荧光素酶(luciferase):常用体外基因表达活性分析，近年开始体内研究当前第17页\共有48页\编于星期五\18点启动子活性检测法表达载体的构建：当前第18页\共有48页\编于星期五\18点利用大分子间的相互作用克隆新的基因鉴定可与蛋白质结合的DNA序列分离靶蛋白质，（可采用gel-shiftassay)克隆靶蛋白的表达基因。利用DNA与蛋白质间的相互作用当前第19页\共有48页\编于星期五\18点分离时空特异性表达基因的方法利用蛋白质之间的相互作用酵母双杂交法当前第20页\共有48页\编于星期五\18点显微注射及细胞标记技术目的：将外源DNA、RNA或标记物等导入早期胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用于转基因分析。细胞标记物分类：早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片细胞内-荧光标记葡聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光显微镜或组织化学方法进行定位。

示踪基因：GFP和LacZ基因当前第21页\共有48页\编于星期五\18点染料细胞标记当前第22页\共有48页\编于星期五\18点荧光细胞标记当前第23页\共有48页\编于星期五\18点细胞移植当前第24页\共有48页\编于星期五\18点DNA/蛋白芯片目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的基因或蛋白。DNAchipProteinchip

microRNAchip分类：当前第25页\共有48页\编于星期五\18点当前第26页\共有48页\编于星期五\18点应用DNAmicroarrays研究基因表达Highoutputscreeninggenesexpresseddifferentlyindifferenttissuesoratdifferentstagesindevelopment当前第27页\共有48页\编于星期五\18点基因组时代：人类基因组计划控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法当前第28页\共有48页\编于星期五\18点后基因组时代＝功能基因组时代空间结构？胞内分布及靶位？影响器官？基因类型？底物？影响途径？当前第29页\共有48页\编于星期五\18点发育遗传学技术

发育生物学基本任务之一：研究基因在胚胎发育中的作用正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。

1.大规模诱变筛选;2.插入诱变筛选;

3.突变基因的克隆;从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因当前第30页\共有48页\编于星期五\18点从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因自然群体中的突变体；化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚硝基脲(N-nitroso-N-ethylureaethylnitrosourea,ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座子利用等；X－射线或r－射线照射获得突变体的方法当前第31页\共有48页\编于星期五\18点自发突变

(spontaneousmutation)Recessivemutation(纯合体状态)/Dominant(杂合体状态)

/semi-dominant当前第32页\共有48页\编于星期五\18点自发突变

(spontaneousemutation)semi-dominantmutation(半显性突变)当前第33页\共有48页\编于星期五\18点斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996)从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因化学诱变法当前第34页\共有48页\编于星期五\18点大规模诱变筛选通过射线或化学诱变剂处理父本个体，在其生殖系细胞中产生随机突变，然后与wild-type母本个体杂交，F1个体中可能携带有基因突变。F1与野生型，F2(50%杂合突变体)群体内杂交，F3(25%)可出现纯合突变个体，发育异常当前第35页\共有48页\编于星期五\18点DNA插入诱变法当前第36页\共有48页\编于星期五\18点反转录病毒插入引起的突变的鉴定DNA插入诱变法当前第37页\共有48页\编于星期五\18点大规模诱变筛选突变后的表型改变：

致死性

功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效突变(nullmutation)

功能获得：如某些受体突变后活化当前第38页\共有48页\编于星期五\18点插入诱变筛选利用转座子(transposon)或病毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因子，可以随即插入基因组中，并可以在基因组中移动，包括特殊序列和转座酶，后代生殖细胞中，转座酶就会诱导P-因子在基因中随即转座造成基因突变。当前第39页\共有48页\编于星期五\18点突变基因的克隆突变体获得后，克隆引起该突变的基因

插入突变：利用P-因子序列作为探针，从突变体文库中筛选出含P-因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断的基因。

化学诱变或射线突变：定位克隆(positionalcloning)—根据目的基因在染色体上的位置进行基因分离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核苷酸多态性(SNPs)。当前第40页\共有48页\编于星期五\18点Positionalcloning:1)确定突变基因的染色体定位2)获取该片断的基因组序列：数据库3)生物信息学确定该片段可能含有的基因，结合其可能的功能和该突变体的表型，确定候选基因4)实验验证：功能异常，野生型rescue,RNAi当前第41页\共有48页\编于星期五\18点发育遗传学技术反向遗传学技术：通过功能丧失(lossoffunction)或功能获得(gainoffunction)实验，研究胚胎个体所产生的表型而分析目的基因的功能。

基因修饰

1.基因敲除;2.条件基因敲除;

3.转基因;当前第42页\共有48页\编于星期五\18点Constructingknockoutmice获得携带有特定基因突变个体的技术，研究基因在发育中功能的重要方法。1)构建用于基因重组的突变基因结构2)重组基因导入胚胎干细胞(ES)3)注射ES入胚胎中以获得杂合性小鼠4)小鼠杂交获得纯合体小鼠并进行表型分析。当前第43页\共有48页\编于星期五\18点Conditionalknockout仅使靶基因在特定的组织或发育时期失活。Cre-lox

系统

1)Cre编码一种重组酶，可识别并结合位点并切除位于两个LoxP位点之间的序列。2)两个品系：靶基因两侧都加入LoxP位点;转入由组织特异性启动子控制的cre基因3)小鼠杂交，cre基因会在特异性组织中表达，切除靶基因，使之失活。当前第44页\共有48页\编于星期五\18点Transgenictechnique1)将外源基因注射到受精卵的细胞核中，缺点是无法控制外源基因的插入情况，只能通过后代检查DNA。2)将外源基因转化到ES中，同geneknockout3)小鼠杂交。当前第45页\共有48页\编于星期五\18点发育遗传学技术反向遗传学技术：

通过抑制性因子抑制目的基因的功能1.RNA干扰;2.吗啉代寡聚核苷酸(MO):

利用反义寡聚核苷酸抑制特定mRNA(5’-UTR)的翻译而阻断目的基因功能的方法。主要应用在斑马鱼和爪蟾研究中，但现在也用于miRNA研究中。

当前第46页\共有48页\编于星期五\18点RNAi技术1)双链RNA抑制含其同源序列基因的表达，抑制基因表达的新方法2)线虫中：直接导入dsRNA;脊椎动物中siRNA(21-23nt)当前第47页\共有48页\编于星期五\18点发育遗传学技术反向遗传学技术：