临床血液学检验技术-第四章-第七节-血红蛋白异常检验-课件

第一章造血及造血调控第一节造血器官与造血微环境临床血液学检验技术第四章红细胞检验技术第七节血红蛋白异常检验抗碱血红蛋白测定HbF酸洗脱法检测红细胞包涵体试验异丙醇沉淀试验血红蛋白电泳PCR技术检测血红蛋白基因第七节血红蛋白异常检验目录重点提示血红蛋白异常的检验项目各类血红蛋白检验的临床价值第七节血红蛋白异常检验一、抗碱血红蛋白测定/碱变性试验(alkalidenaturationtest)【实验原理】抗碱血红蛋白（HbF）又称胎儿血红蛋白，具有比血红蛋白A（HbA）更强的抗碱作用。将待检的血红蛋白溶液中加入NaOH溶液后，HbA即发生变性沉淀，HbF抗碱能力强，没有变性而存在于上清液中。离心后取上清液于540nm处测定吸光度，可计算抗碱血红蛋白的百分含量。此试验也称为碱变性试验。【参考区间】正常情况下出生3个月后HbF比例迅速下降，2岁以上至健康成人一般在1.0%～3.1%，新生儿可达55%～85%。第七节血红蛋白异常检验一、抗碱血红蛋白测定/碱变性试验(alkalidenaturationtest)第七节血红蛋白异常检验一、抗碱血红蛋白测定/碱变性试验(alkalidenaturationtest)【临床意义】

1.HbF绝对增多见于珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达30%～90%，中间型常为5%～30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100%。2.HbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤、再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、卟啉病等。3.HbF生理性增多常见于孕妇及新生儿。【应用评价】本试验重复性较好，除HbF外，HbBart’s和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。

第七节血红蛋白异常检验二、HbF酸洗脱法检测【实验原理】HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力也比HbA强。将待检血涂片浸入pH3.3酸性缓冲液中37℃孵育一定时间，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不被伊红着色。油镜下计数1000个红细胞，计算出着色红细胞（含HbF）百分率。【参考区间】健康成人血涂片中含HbF红细胞＜0.02（2%），新生儿可达55%～85%。（酸洗脱法）第七节血红蛋白异常检验酸洗脱法检测第七节血红蛋白异常检验二、HbF酸洗脱法检测

HbF酸洗脱实验结果二、HbF酸洗脱法检测【临床意义】珠蛋白生成障碍性贫血含HbF的着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染成红色，轻型患者可见少数红细胞染成红色。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。再生障碍性贫血和其他溶血性贫血可出现少量着色的红细胞。【应用评价】本试验简单易行，无需特殊试剂和仪器，适用于基层医院对HbF增高疾病的筛检，进一步确诊应进行血红蛋白电泳分析和基因检测。第七节血红蛋白异常检验三、红细胞包涵体试验【实验原理】将氧化还原染料煌焦油蓝溶液与新鲜血液置37℃孵育一定时间后，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体，呈蓝色球形小体，均匀分布在红细胞内。油镜下观察并计算500个红细胞中含包涵体的红细胞百分率。【参考区间】健康人含包涵体红细胞＜1%。（煌焦油蓝染色法）第七节血红蛋白异常检验红细胞包涵体阳性第七节血红蛋白异常检验三、红细胞包涵体试验三、红细胞包涵体试验【临床意义】1.HbH病患者孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。其阳性红细胞可达50%以上；轻型α珠蛋白生成障碍性贫血时，偶见HbH包涵体。2.红细胞包涵体还见于不稳定血红蛋白病。3.G-6-PD缺乏或细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。【应用评价】本试验为检测不稳定血红蛋白的定性试验，只作为不稳定血红蛋白病和HbH病的筛检试验。第七节血红蛋白异常检验四、异丙醇沉淀试验【实验原理】异丙醇为非极性溶剂，能降低血红蛋白分子内部氢键，使不稳定血红蛋白更快地裂解沉淀。在待检血红蛋白液中加入异丙醇于37℃作用一定时间，通过观察血红蛋白在异丙醇中的混浊或沉淀现象，对不稳定血红蛋白进行筛检。【参考区间】阴性：30分钟内不出现沉淀。脐血为阳性结果，新生儿出生1个月后逐渐转阴，6个月后为阴性。第七节血红蛋白异常检验阴性对照阳性对照患者结果四、异丙醇沉淀试验第七节血红蛋白异常检验四、异丙醇沉淀试验【临床意义】不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现混浊，20分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。【应用评价】本试验特异性较差，易出现假阳性，阳性结果只能说明存在不稳定血红蛋白，只作为不稳定血红蛋白的过筛试验。第七节血红蛋白异常检验（一）醋酸纤维素膜；（二）等电聚焦法；（三）尿素裂解试验和聚丙烯酰胺凝胶电泳；（四）毛细管电泳；（五）高效液相色谱法。

第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳五、血红蛋白电泳（一）醋酸纤维素膜电泳【实验原理】不同的血红蛋白其等电点不同，在一定pH的缓冲液中所带有的电荷不同。当缓冲液的pH大于该Hb的等电点时其带负电荷，电泳时向阳极泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动。经一定电压和时间的电泳，不同的血红蛋白因所带电荷不同、相对分子量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带。也可同时对电泳出的各区带进行扫描，对各种血红蛋白定量分析。根据pH值不同分为碱性电泳（pH8.6）和酸性电泳（pH6.5）。常规采用pH8.6TEB缓冲液进行血红蛋白电泳分析。pH6.5酸性电泳用于分离HbH与HbBart’s，因HbH等电点为5.6，在pH6.5TEB缓冲液中电泳时移向阳极，HbBart’s则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴极泳动。第七节血红蛋白异常检验第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳五、血红蛋白电泳【参考区间】

pH8.6TEB缓冲液醋酸纤维素膜电泳正常血红蛋白电泳区带：HbA＞95%、HbF＜2%、HbA2为1.0%～3.1%。该电泳缓冲液适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与HbBart’s无法分开和显示，应再选择其他缓冲液进行电泳分离。2.pH6.5磷酸盐缓冲液醋酸纤维素膜电泳主要用于HbH和HbBart’s的检出。HbH等电点为5.6，在pH6.5磷酸盐缓冲液中电泳时移向阳极，HbBart’s则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴极泳动。第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳【临床意义】通过与健康人血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带，如HbH、HbE、HbBart’s、HbS、HbD和HbC等，为相关血红蛋白病的诊断提供实验依据。2.HbA2增多，见于β珠蛋白生成障碍性贫血，是该病杂合子型的重要实验室诊断指标。HbA2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤、恶性贫血、不稳定血红蛋白病、巨幼细胞贫血等。HbE病时，HbE区带与HbA2区带位置重叠，HbA2区带处增宽，含量增高幅度在10%以上。第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳【应用评价】醋酸纤维素膜电泳法简单易行，便于推广，是诊断血红蛋白病的实验室检查基本方法，也是分离和研究异常血红蛋白的有效方法。存在少量血红蛋白变异体时，用琼脂糖凝胶电泳法进行血红蛋白分析较醋酸纤维素膜法更为敏感，但价格更为昂贵，方法也较后者复杂。某些异常血红蛋白采用该电泳技术尚不能分离，可进一步作等电聚焦电泳、琼脂糖凝胶电泳、高效液相层析等，以提高检出率，必要时可做基因分析，以利于确诊和分型。第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳（二）等电聚焦法【实验原理】在常规凝胶电泳中，分离通常是在恒定的缓冲体系中进行的。而在等电聚焦中，血红蛋白的分离是在连续的、稳定的和线性的pH梯度中进行的。不同的血红蛋白pI值不同，只能在其等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。【临床意义】可分离出一些在常规电泳中无法分离的血红蛋白，例如可将部分HbD和HbG变异体（如HbD-Punjab/LosAngeles和HbG-Philadelphia）与HbS分离。【应用评价】此方法的优点是分辨率高，对少量样本或干燥血液洗出液进行检测，可得到清晰的条带。该法的缺点是价格昂贵，不适用于HbA2的定量测定。第七节血红蛋白异常检验Hb的分离是在连续的、稳定的和线性的pH梯度中进行的不同的血红蛋白根据其pI值不同，只能在其等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。（二）等电聚焦法（isoelectricfocusing,IEF）第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳五、血红蛋白电泳（三）尿素裂解试验【实验原理】尿素可将血红蛋白分子的珠蛋白解离为多个肽链，通过醋酸纤维素膜电泳将多个肽链分离成肽链区带，根据肽链区带可对异常血红蛋白进行分析。【参考区间】健康成人HbA裂解为两条肽链，在pH8.5醋酸纤维素膜电泳时，向正极快速泳动的为β链，向负极泳动的为α链。【临床意义】如在β链、α链区带以外出现异常区带，提示有异常血红蛋白存在。【应用评价】本试验是检测异常血红蛋白的筛选试验，不能确定异常血红蛋白的种类。第七节血红蛋白异常检验

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳【实验原理】血红蛋白液中加入尿素或对氯汞苯甲酸后，Hb分子的空间结构被破坏，裂解为多条肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可将各条肽链分离成不同区带。与正常血红蛋白电泳进行比较，可检测各种血红蛋白的比例和珠蛋白氨基酸结构的异常。【参考区间】正常血红蛋白裂解后出现β、γ、δ和α四条肽链。如出现正常肽链区带之外的其他区带或正常肽链区带的改变，提示有血红蛋白的异常存在。【临床意义】对珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病的诊断和鉴别诊断有参考价值。【应用评价】该方法分辨率高，可检出醋酸纤维素膜电泳中与HbA不易区分的不稳定血红蛋白、潜在的异常血红蛋白、绝大多数α-珠蛋白生成障碍性贫血；明确区分βO和β+-珠蛋白生成障碍性贫血。本方法简便易行，可作定性和相对定量分析，无需特别的仪器和试剂。五、血红蛋白电泳第七节血红蛋白异常检验（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳五、血红蛋白电泳（五）毛细管电泳【实验原理】毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异为根据的液相微分离分析技术，包含电泳、色谱及其交叉内容。按分离模式可分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦、胶束电动毛细管色谱和毛细管电色谱等类型。毛细管电泳又可以按操作方式分为手动、半自动及全自动型毛细管电泳。第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳【临床意义】毛细管电泳技术可分离HbA2、HbS、HbF和HbA；也可将各类正常血红蛋白和一些常见的异常血红蛋白，包括HbS、D-Punjab、C-Arab、E-Arab、O-Arab和G-Philadelphia成功地分离。【应用评价】该类方法具有快速、高效、灵敏、自动化等优点，适合于微量标本的检测。其中以毛细管区带电泳应用最广，胶束电动毛细管色谱近年来发展较快，其他分离技术应用还较少。此方法不能将HbE和HbA2、HbF和HbA完全分离，在某些HbF增高的珠蛋白生成障碍性贫血突变类型筛查时有一定缺陷。

第七节血红蛋白异常检验以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异为根据的液相微分离分析技术。

（五）毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE）第七节血红蛋白异常检验五、血红蛋白电泳五、血红蛋白电泳（六）高效液相色谱法

（high-performanceliquidchromatography,HPLC）【实验原理】高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）是基于离子交换层析原理的分离分析法。以离子交换树脂作为固定相，根据各Hb的理化性质不同，利用携带负电荷的层析柱和珠蛋白成分的电荷差异，进行分离。正电荷越强的Hb，洗脱时间越长。根据Hb色谱图的出峰时间与面积可确定Hb亚型及其水平，进而初步判断珠蛋白生成障碍性贫血的类型。【参考区间】正常血红蛋白的出峰时间依次为HbF、HbA和HbA2。若存在HbBart’s或HbH则其出峰时间早于HbF，HbD、HbS或HbC则晚于HbA2。HbE、HbLepore等出峰时间可与HbA2融合。（高效液相色谱法）第七节血红蛋白异常检验健康成人HbHPLC(Bio-Rad)