高级生物化学教材

高级生物化学

第一章绪论

一、发展中的生物化学

生物化学是在生物学发展的基础上融合了化学、物理学、生理学等学科的理论

和方法形成的科学，是研究动物、植物、人体、微生物等生命物体的化学组成和生

命过程中的化学变化的一门学科，所以人们认为生物化学是生命的化学。

生命是发展的。生命起源、生物进化、人类起源等等均已说明生命是发展的，

因此人们对生命化学的认识也是在发展之中的，生物化学的发展可以追寻到18世

纪卜.平叶(在约是乾隆年间)，要从拉瓦锡研究燃烧和呼吸说起。

法国著名的化学家拉瓦锡(Altoine—LaureutLavoisier,1743——1794),他曾经

钻研燃烧现象。并进而研究乎吸作用。在他29岁时开始燃烧的科学试验，发现

磷燃烧后成为磷酸，硫燃烧后成为硫酸；磷酸和硫酸分别比磷和硫重，这表明燃烧

并不是失去了“燃素”，而是跟氧结合的过程。他又利用天平和量热器，测量了豚

鼠等动物在一定时间内的呼吸，定量测定了CO?和释放的热量，从而证实动物的

呼吸作用就好象物体的燃烧一样，只不过动物体的燃烧是缓慢和不发光的燃烧。他

的研究成果彻底地推翻了“燃索说”，为生命过程中的氧化奠定了基础。

瑞典化学家舍勒(CarlWilhelmScheele,1742--1786)从14岁开始就随一位

药剂师作了8年学徒，在此期间，他废这寝忘食的学习化学，并利用业余时间进行

化学实验。在1770年他28岁时从酒石里分离出酒石酸，以后他又分析了膀胱结石

获得了尿酸，分析研究了柠檬酸、苹果酸、没食子酸或称为五倍子酸，分析研究了

廿油。舍勒在无机化学方面也有很多贡献，曾经拒绝了柏林大学和英国要他担任化

学教授职务的邀请，一生乐于他的化学实验。

这是18世纪的成果，是由化学家通过科学实验，发现了生物体的呼吸作用，

发现了生物体的中间代谢产物。所以拉瓦锡和舍勒是两位生物化学的先驱，是生物

化学的奠基人。

进入19世纪后，在物理学、化学、生物学方面有了极大的进展，如1804年道

尔顿的原子论，1869年门捷列夫的元素周期律，1895年伦琴发现了X一射线，1835

年贝采利乌斯说明了催化作用，1859年达尔文发表了《物种起源》，1865年孟德尔

的碗豆杂交试验和遗传定律，1848年亥姆霍兹(Helmholtz)找到了肌肉中热能来

源，贝尔纳(Bernard)发现了肝脏生糖功能等等。如此多的发现和进展极大的促

进了生物化学的发展，而且也是现代生物化学发展的前提。此外，生产的发展，工

业的发达和社会的进步也极大地推动了生物化学的发展。

德国化学家李比希(Liebig)是农业化学的奠基人，也是生理化学和碳水化合

物化学的创始人之",他于1826年在德国吉森(Giessen)大学建立了李比希实验

室，并首创了在大学进行化学实验的教学。1842年撰写的《有机化学在生理学和

病理学上的应用》专著，首次提出了“新陈代谢”这个学术名词。他研究了许多有

机化合物，并对脂肪、血液、胆汁和肌肉提取物进行了研究。他有很多杰出的学生，

有位叫施洛斯比尔格尔(JulinsSchlossberger),是笫•位担任生理化学教授职务的

人,他于1840—1859年间在德国蒂宾根(Tubingen)大学教授有机化学和生理化

学。施洛斯比尔格尔逝世后，蒂宾根大学生理化学的盛名延续了一个世纪。历任的

生理化学教授都是当时第•流的生理化学专家，具有医学和有机化学的基础，如霍

佩一赛勒(Hoppe—Seyler)、Gustav、HanThierfelder(研究脂肪氧化)和

Franz-Knoop(研究脂肪氧化，尿中排出马尿酸)等。

霍佩一赛勒(1825—1859)是德国医生，因将生理化学(即生物化学)建立成

一门独立的科学而著名。1877年他首次提出了“生物化学”这个名词，创办和编辑

了第•种《生理化学杂志》，出版了《生理化学及病理化学分析手册》，首次获得了

纯的卵磷脂，并曾获得晶体状的血红素。首创“蛋白质”一词，又研究过代谢、叶

绿素及血液。他研究病理液体和脓细胞，从而导致他的一位学生FriedrichMiescher

(1844—1895)从脓细胞核中分离出了脱氧核糖核蛋白，另•位学生Albrecht

Kossel(1853—1927)因对蛋白质、细胞及细胞核化学的研究而获得191()年诺贝

尔生理学或医学奖。霍佩一赛勒建立了著名的斯特拉斯堡研究所，并在此担任过生

理化学教授，在科学研究和培养学生方面都做出了巨大的贡献。总之，自

1840—1900年间，德国的生理化学跟其他领域的科学一样，处于开拓和领先地位。

并对美国的生理化学的发展起了非常重要的推动作用。例如，池廷登(RusselHenry

Chittendlen)是美国留德学生，回到美国纽黑文的耶鲁大学教授生理化学，是全美

第一位任生理化学教授职务的留德归美学生。他在生理化学方面任教达30年，居

美国生理化学的领导地位。他与他的德国老师寇南(WillyKUhne)合作对胃液和

肠液消化过程的产物进行了化学研究，发现了不少新东西。也进行了蛋白质的分解

试验。再如，艾贝尔(JohnJacobAbel,1857—1938)曾在德国留学7年，获斯

特拉斯堡大学医学博士，返美后在密西根大学和约翰斯•霍普金斯大学任教，他分

离了肾.匕腺索。1962年制成了胰岛素晶体。1932年领导内分泌研究室。

总的说来，美国生理化学初始阶段受德国的影响较深。

20世纪后，生物化学有了很大的发展。德国、美国、英国、法国都有了生物

化学的学术中心。就生物化学来说，20世纪前半叶，在蛋白质、酶、维生素和物

质代谢及生物氧化方面都有了很大的发展。

霍普金斯(SirFrederickGowlandHopkins,1861—1947)是英国剑桥大学

生物化学教授，因发现维生素而与荷兰的艾克曼(C.Eijkman,1858—1930)共获

1929年的诺贝尔生理学或医学奖。霍普金斯创建「剑桥大学普通生物化学学派和

中心，从事教学和研究的人员都是生物化学方面的精英，为生物化学的发展做出了

较大的贡献。

20世纪初直至二战前夕，德国在生物化学方面仍占领先地位，如埃米尔•费

歇尔(EmilFischer,1852—1919),普鲁士化学家，研究糖和嚓吟类物质，获1902

年诺贝尔化学奖。汉斯•费歇尔(HansFischer,1881—1945),德国生物化学家，

因对血红素和叶绿素的研究而获诺言贝尔化学奖。迈尔霍夫(Ott。Meyerhof,

1884-1951),德国生物化学家，因研究肌肉代谢的糖原一乳酸循环与英国的

A.V.Hill共获1922年的诺贝尔生理学或医学奖。威尔施泰特(Richard

Willstatter,1872—1942),德国化学家，研究叶绿素及其植物色素结构而获得

1915年诺贝尔化学奖。温道斯(AdolfWindaus,1876—1959),德国有机化学家，

因研究维生素等有重要生物学作用的物质而获得1928年的诺贝尔化学奖。瓦尔堡

(OttoWarburg,1883—1970),德国生物化学家，因对细胞呼吸的研究而获1931

年诺贝尔生理学或医学奖。

在留德学生的推动下，20世纪前半叶，美国的生物化学方面也的很大发展。

如耶鲁大学池廷登的后继者门德尔(LafayetteBenedictMendel,1872—1935),

美国生物化学家，发现了维生素和蛋白质的营养价值，建立了现代营养学概念。

20-30年代营养和维生素的研究在美国比较突出。再如哈佛医学院的福林(011。

Folin),于1909年任生物化学教授，1915时福林教授将哈佛大学生物化学系办成

了有影响的学术中心，重点放在分析方法和临床应用研究上。福林建立了尿中肌酸

和肌酸酊的测定方法，氨基酸测定方法，尿氮测定方法。福林和吴宪(我国生物化

学家)于1919-1922年设计了血液分析的颜色测定方法。

大约从20世纪中叶起，生物化学得到了突飞猛进地发展，并且生物化学的领

域也向深度和广度发展，其原因是：①物理学家、化学家以及遗传学家等参加到生

命化学的领域中来了。②研究人员迁居和交往频繁。③研究方法有了突破和改进。

④信息交流量增大。

从研究方法的改进上来说，相继出现了色谱技术、电泳技术、超速离心技术、

荧光分析技术、同位素示踪技术以及电子显微镜的应用等。可以说生物化学的分离、

纯化和鉴定的方法向微量、快速、精确、简便和自动化的方向发展。

从不同学科专家的参与上来看，英国物理学家肯德鲁(JohnCowderyKendrcw)

测定了肌红蛋白的结构。英国物理学家佩鲁茨(MaxFerdinandPerutz)用X—射

线衍射技术分析了血红蛋白的结构，二人共获1962年的诺贝尔化学家。美国化学

家鲍林(LinusPauling)因确定了氢键在蛋白质结构中及大分子间相互作用的重

要性，并认为某些蛋白质具有类似螺旋的结构，研究了镰刀型贫血病，提出了“分

子病”的名称，获得了诺贝尔化学奖和和平奖。桑格(FrederickSanger)英国生

物化学家，经过10年的研究，于1955年确定了牛胰岛素的结构，获得了1958年

的诺贝尔化学奖。1980年他又设计出了一种测定DNA核甘酸排列顺序的方法，而

与吉尔伯特(WalterGilbert),伯格(PallBerg)共获1980诺贝尔化学奖。麦

克林托克(BcirbaraMeClintock)美国遗传学家，从事玉蜀黍遗传研究40年，发

现了可移动的遗传成分，因而获得了1983年的诺贝尔生理学或医学奖。

生物化学领域中，在20世纪获得诺贝尔奖的成果还有：克雷布斯(SirHans

AdolfKrebs,英籍德裔生物化学家，犹太人，1933年被迫迁居英国)1937年发现

三段酸循环。李普曼(FritzAlbertLipmann,美籍德裔生物化学家)1947年成

功的分离出了CoA,1953年确定了其分子结构。克雷布斯和李普曼二人共获1958

年诺贝尔生理学或医学奖。奥乔亚(SeveroOchoa,美籍西班牙生物化学家)发现

细菌内的多核甘酸磷酸化酶，并合成了核糖核酸。科恩伯格(ArthurKorberg,美

国医师、生物化学家)发现DNA在细胞内及试管内的复制方式。奥乔亚和科恩伯格

二人共获1959年诺贝尔生理学或医学奖。威尔金斯（MauriceWilkins,新西兰出

生的英国物理学家）完成了对DNA的X—射线衍射分析，沃森（JamesDeweyWatson）

和克里克（FrancisHarryComptonCrick）提出了DNA的双螺旋结构，三人共获

1962年的诺贝尔生理学或医学奖。尼伦伯格（MarshallWarrenNirenberg,美国

生物化学家）破译遗传密码，霍利（RobertWilliamHolly）阐明酵母丙氨酸tRNA

的核甘酸的排列顺序，并证明所有tRNA的结构类似，科拉纳（HarGobindKhorana,

美籍印度裔生物化学家）首次人工复制出酵母基因，三人共获1969年诺贝尔生理

学或医学奖。莫诺（JdcquesMomod,法国生物化学家、遗传学家）和雅各布（Francois

Jacob,法国生物学家）发现了操纵子而获得1965年诺贝尔生理学或医学奖，等等。

我国生物化学的主要先驱是吴宪，他曾留学美国哈佛大学，回国后于

1924-1942年担任私立北京协和医学院生物化学教授，兼生物化学系主任教授。

我国在生物化学研究中最突出的成就是1965年人工合成了牛胰岛素，1983年人工

合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸。此外我国在酶的作用机理、血红蛋白变异、生物

膜结构与功能等方面都做出了国际水平的研究成果。

生物化学在蛋白质、核酸、酶及代谢等方面已有理论方面的成就，理论成果必

将导致应用，所以生物化学的发展推动了生物技术的进步，从80年代开始，生物

工程和生物高技术得到了迅速发展。生物工程有遗传工程或基因工程，蛋白质合成

的分子生物学，或称蛋白质工程、酶工程，还有组织培养、细胞培养，以及其他体

外技术，以求生产出对人类有用的产物。有工业微生物学，利用合适原料经过发酵，

生产酶类或人类食品和动物饲料。生物工程的远景包括应用于人类健康、动物疾病

治疗与预防、污水和废物处理、以及生物电子学等等。由于生物工程对人类社会目

前效益的广阔的前景，世界各国，特别是欧洲、澳洲、日本等国家比较重视，发展

较快。我国也已重视生物工程的理论研究和应用研究，特别重视生产方面的开发研

究。

生物化学虽然有近二百年的历史，但是还在发展之中。目前看得到的一些未知

领域正受到日益的重视，例如：地球卜.的生命是怎样起源的？地球以外的天体上有

没有生命？遗传物质是怎样进化的？—个受精卵中的遗传物质怎样发生成个体？

怎能样发生为各种器官和组织的？细胞器的进化途经还有争论，癌的问题、病毒问

题、人体自身免疫问题、大脑的记忆、推理的分子生物学、生物行为有什么规律，

其分子的基础又是什么？还有环境生态等问题。总之，生物化学是在发展之中。

生物化学方面的主要期刊

中文:

中国科学科学通报

生物化学与生物物理学进展生物化学与生物物理学学报

生命的化学生物化学与分广生物学学报

微生物学报遗传学报

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日文：

科学自然

生化学蛋白质、核酸、酵素

英文：

Nature(London)Science(Washington)

AnalyticalBicx:hemistry(NewYork)BidchemicalJournal(London)

ArchivesofBiochemistryandBiophysics(NewYork)

BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications(Newyork)

BiochimicaetBiophysicaActa(Amsterdam)

Biochemistry(USA)BioorganicChemistry(London)

Biopolymers(NewYork)

BiotechnologyandBioengineering(NewYork)

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CurrentAdvancesinGeneticsandMolecularBiology(U.K.)

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InternationalJournalofBiochemistry(Oxford)

InternationalJournalofPeptideandProteinResearch(Copenhagen)

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Metabolism,ClinicalandExperimental(USA)

MolecularandCellularBiochemistry(Hague)

MolecularandCellularGenetics(Berlin)MolecularPharmacology(NewYork)

MethodsofBiochemicalAnalysis(NewYbrk)

NucleicAcidsResearch(USA)PlantPhysiology(USA)

Peptides(USA)PreparativeBiOchemistry(USA)

ProceedingoftheNationalAcademyofSciences(Washington)

ProceedingsoftheRoyalSocietyofLondon,SeriesB(London)

Protoplasma(Vienna)Steroids(SanFradsisco)

TBS(USA)Virology(NewYork)

德文：

DieNaturwissenschaften(Berlin)BiochemischeZerischrift(Berlin)

ZeritschriftfurNaturforschung

法文：

ComptesRendusHebdomadairesdesSeancesde

LAcademiedesSciences(Paris)

第二章蛋白质生物化学

蛋白质生物化学研究的是蛋白质的结构、性质、和功能及结构与功能的关系。

生物体最重要的组成物质是蛋白质和核酸。核酸是遗传大分子，负责遗传信息的储

存与传递。蛋白质是功能大分子，是生物体的结构、性质与功能的具体体现者。例

如：遗传信息的复制、传递和表达要依靠各种蛋白质才能完成；细胞的骨架是由许

多种蛋白质构成的三维网状结构，而细胞的各种生命活动都是在细胞骨架上进行

的；生命的运动依赖于各种运动蛋白；氧的运输要靠血红蛋白来完成；动物体对疾

病的抵抗力是山免疫球蛋白执行的；细胞能够认识“自己”与“非己”，是靠糖蛋

白的特殊功能；机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成，酶是蛋白质，激素中

有相当一部分是肽类。可见蛋白质在生命活动中无所不在，无时无刻不在发挥着重

要功能。近年来发现的羊的瘙痒病(Scrapie)的病因是一种最简单的具有感染性的

蛋白因子(Prion)引起的，它是比类病毒还小的微生物，未检查出其含有核酸物

质，而只是一种蛋白质颗粒。这是值得人们思考的问题。

要研究蛋白质的功能，首先必须深入了解它们的结构，特别是空间结构(三维

结构)，因为结构决定功能，生命物质的功能和它的结构二者是统一的，有什么样

的结构必有什么样的功能，反之亦然。例如，酶蛋白的催化功能只有在彻底弄清酶

的活性中心与底物如何结合，并如何反应，才真正了解那种酹的作用机理。再如，

在彻底弄清楚血红蛋白的分子构象及与氧分子结合后的构象的变化之后，才能完整

地阐述动物机体中氧和二氧化碳的运载过程。因此，我们本章中首先介绍蛋白质结

构原理的最新进展，然后再介绍几类蛋白质的结构与功能的关系及其它的有关问

题。

蛋白质的结构很早就受到科学家的关注，但在50年代以前一直未能得到满意

的结果。直到1952年丹麦生物化学家林德斯洛姆一兰(Linderslrom—lang)第一

次提出蛋白质结构的三级结构的概念，才使蛋白质结构的研究走上了正确的道路。

Linderstrom—lang的三级结构概念是：•级结构是指多肽链中饲基酸的顺序，而不

涉及其空间排列状态;二级结构是指室肽链骨架(上链)的局部空间结构，不涉及

侧链构象，也不考虑叮其它肽链片段之间的关系及整个肽链的空间排列状况;三级

结构是指整个肽链的折迭情况，或者说是指肽链中全部原子在空间的排列状态。这

一概念♦提出来，立即得到了科学家的认同。1958年，英国晶体学家在研究蛋白

质晶体时发现，有些蛋白质是由几条相同或不同的肽链组成，每条肽链都有完整的

三级结构，称之为亚基，几个亚基排列成空间几何状态，并靠肝共价键I结合在一

起。他将这种结构称为四级结构。现在蛋白质的•、二、三、四级结构的概念已由

国际生化协会(IUB)的生化命名委员会采纳并作出正式定义。到目前为止已有2000

多种蛋白质的•级结构被搞清楚。据1990年4月的统计，有488种蛋白质的三级

结构利用X—射线衍射技术在不同分辨率水平上得到了阐明。蛋白质三维结构的研

究资料大大丰富了人们对蛋白质空间结构规律的认识，同时，蛋白质四级结构水平

的概念也已不能满足人们的要求。因此，近年来蛋白质化学家又在四级结构水平的

基础上增加了两种新的结构水平，即超二级结构和结构域。超.•级结构是1973年

罗斯曼（Rossman）提出的，是指蛋白质结构中存在的各种二级结构组合物，是构

成微结构的构件。结构域的概念是由免疫化学家波特（Porter）提出的，是指蛋

白质分了中那些明整分开的球状部分。例如，动物的免疫球蛋白（IgG）含有12

个结构域。现已证明许多蛋白质含有明显的结构域。这两种新的蛋白质结构概念目

前已被生物化学家及分子生物学家所公认。所以，我们所提到的蛋白质结构应包括

六级水平的结构。即：

•级结构f：级结构一超:级结构f结构域一二级结构四级结构

蛋白质三维结构的深入研究，不仅从分子水平上深入揭示了生命的奥秘，而且

可用于生产实践。例如，80年代兴起的蛋白质工程技术，就是利用现代生物技术

改造蛋白质的分子结构，提高其生物活性，使其更加符合人类的需要。所以，将蛋

白质生物化学的理论知识应用于生产实践，必将对人类做出更大的贡献。

第一节蛋白质的一级结构

一、蛋白质一级结构的内容

蛋白质是不分枝的生物大分子，山20种氨基酸组成（从各种生物体中发现的

氨基酸有180种，参与蛋白质组成的基本氨基酸有20种，称为蛋白氨基酸，其它

的称为非蛋白氨基酸），氨基酸在多肽链中有一定的排列顺序，蛋白质的一级结构

就是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质一级结构也称为蛋白质的共价结

控。当然，蛋白质一级结构中还应包括二硫键的定位。蛋白质一级结构包括以下几

个内容：

1.蛋白质分子中多肽链的数目；

2.每一条多肽链末端氨基酸的种类；

3.每一条多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序；

4.链内二硫键的位置和数目；

5.链间二硫键的位置和数目。

研究蛋白质一•级结构就是要研究这些内容。

蛋白质一级结构的表示方法一般是从左到右表示多肽链从氨基端到小基端。氨

基酸的种类和排列顺序通常用三字母表示，即氨基酸英文名称的前三个字母。但为

了更加方便，国际生化委员会推荐了•套单字母表示法。

二、蛋白质一级结构的测定

1955年，英国生物化学家桑格（Sange家首先完成了胰岛素•级结构的分析，

为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。但这项工作花费了他整整十年的时间。随后，

唉德曼（Edman）液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱一质谱

（GC-MS）等方法相继出现，使蛋白质一级结构的分析速度大大加快。现在分析一

个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天的时间就可完成。蛋白质•级结构分析

的综述和专著文献很多，在此我们只作简要的概述。

蛋白质一级结构分析的基本步骤如下；

1.蛋白质样品的纯化;

2.测定N—末端和C—末端氨基酸:

3.至少以两种方式裂解肽链成肽段；

4.肽段的分离纯化「一

5.肽段的顺序分析;

6.肽段重迭重组以确定肽链的全部氨基酸顺序;

7.二二硫键的定位.

（一）、蛋白质的纯化（均一）

在测定蛋白质的一级结构之前，首先必须保证被测蛋白质样品的纯度，只有均

一的蛋白质样品，才能保证顺序测定结果准确可靠；其次要了解它的分子量和亚基

数。如果某些蛋白质分子是山两个以上的肽链组成的，第一步必须将多肽链分开。

蛋白质多肽链之间有徘共价键和共价键（二硫键）作用力。如果只有非共价键，可

用咽或盐酸皿等变性剂将其分开。如果肽链之间有二硫键，则需要用拆开二硫键的

方展进行处理。拆开二硫键的化学方法主要有以下两种：

1.过里酸氧化法

用过甲酸（过氧化氢+甲酸）可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在0℃

下进行2小时左右，就能使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半

胱氨酸称为磺基丙氨酸。反应如下：

CH2—S—S—CH2HCOOOH、0℃、2h)2CHO—SOxH

—Niitnco——Niiinco—

—MICIICO—

如果蛋白质分子中同时存在半胱氨酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外，

甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加了分析的复杂性。

2.

利用航基乙醉亦可使蛋白质中二硫键断裂。高浓度的筑基乙醇在pH8—9、室

温下作用数小时后，可二硫键定量的还原为一SH。在此反应系统中还需加入8M

腺或6M盐酸胭使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构象，从而有利于筑基乙

醉作用于二硫键。此反应是可逆的，因此要使反应完全，疏基乙醇的浓度必需保持

在0.1—0.5M。反应如下：

fHzTT—%CH2SH小9、、空温、数小时、?中一SHCH2&-SYH,

—NHCHCO--NHCHCO—clwH8M服或盐酸二——NH（JHCO—&20HHOck

被还原生成的一SH不稳定，极易被重新氧化生成-S-S-,故需要稳定。稳

定一SH的方法通常是用碘乙酸（ICH2COO）使一SH段甲基化（一SHCH2coe））

或者用氟乙烯（CH2=CH—CN）使一SH鼠乙基化（一SHCH2CH2CN）。

蛋白质多肽链被拆开后，要将它们分离纯化。常用的分离纯化方法通常有凝胶

过滤法、离子交换层析法、电泳法等。分离纯化后的每条肽链再进行末端分析。

（二卜末端分析

分析肽链末端氨基酸的方法很多，常用的有以卜几种。

1.N—末端氨基酸分析

①.硝基氟源法（DNP或FDNB或DNFB）此方法是1945年由Sanger提

出的，其反应过程如下：

16MHe1

DNP—1基酸氨基酸混合物

DNP—氨基酸可用有机溶剂抽提后，通过层析法来鉴定它是何种氨基酸。

Sanger用此法成功地测定出胰岛素的N—末端氨基酸分别为甘氨酸和苯丙氨酸。

②「甲二氨基蔡磺酰氯法（NDS—C1）此方法是1956年山哈特利（Hartley）

等人提出的。二甲基氨基蔡磺酰氯又称丹磺酰氯,简称DNS-C1。其反应过程如

丹磺酰氯丹磺酰一肽

CH3—N—CH3

6MHe'+氨基酸混合物

SO2一—COOH

丹磺院一氨底酸

丹横酰一氨基酸具有强烈的黄色荧光,可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析法进行鉴

定。此法的优点是灵敏度高（比DNP法高100倍），且丹磺酰一氨基酸的稳定性好。

2.C一末端氨基酸分析

①，解法这是分析C-末端氨基酸的最常用方法。将多肽溶于无水肿中，

100℃下进行反应,可使C—末端氨基酸以游离状态释放出来，而其它氨基酸都与

腐反应生成氨基酰腓化合物，此类化合物可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍

生物而沉淀。游离的C—末端氨基酸可采用DNS—C1或DNP等方法进行鉴定。

②■肽酶水解法竣肽酶可以专一地水解读基末端氨基酸。根据酶解的专一

性不同，可分为装肽酶AB、C和Y（A和B来自胰脏，C来自柑桔叶，Y来自面包

酵母）。应用竣肽酶水解J末端氨基酸时，首先要进行动力学实验，以便选择合

适的酶浓度和反应时间，以保证释放出的氨基酸主要是J末端氨基酸。

（三）、氨基酸组成分析

在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先要了解它是由哪些氨基酸组成

的，每种氨基酸有多少。分析组成的方法有层析法和离子交换层析法两种。层析法

是将多肽链用酸完全水解成游离氨基酸，然后进行D\S（Dansyl）标记，聚酰胺薄

膜层析。这是一种超微量的分析方法，但用于定量分析尚不够准确。离子交换层析

是一种精确的氨基酸组分分析的定量方法，它是将多肽链完全水解后，通过离子

交换法使各种氨基酸相互分开，再分别进行定量测定。氨基酸自动分析仪就是在此

基础上发展起来的。

（四）、多肽链的降解

多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂的，因此直接分析多肽链的氨基酸顺序还

是很困难的，多采用将多肽链进•步降解成肽链片段,先分析各片段的氨基酸顺序，

再重迭重组确定肽链的全部氨基酸排列顺序。肽链的裂解是蛋白质一级结构研究中

的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，反应产率高。目前主要有化学法和酶解

法两种方法。多肽链的降解至少要用两种对肽链有不同裂解点的方法，降解生成两

套以上不同的肽段。否则，将给下•步的重迭重组造成极大的困难。

1.化学法

最常用的化学法是浪化氢法，此法能选择性地断裂甲硫氨酸的竣基端月搬O浪

化氢化学降解法的优点是：①般蛋白质中含甲硫氨酸较少，因此裂解点少，可获

得较大的肽链片段；②产率在80%以上；③作用条件温和，在室温下作用几到十几

个小时即可。

近年来有•种羟胺法开始受到人们的重视。羟胺能专•地裂解天冬酰胺和甘氨

酸之间的肽键（Asn-Gly）o在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键

（Asn-Pro）o现已有人将这种方法用在某些蛋白质一级结构的分析上。

2.酶解法

酶解法比化学法有更多的优越性，使用也更广泛。因其具有较高的专•性，而

且水解产率较高，所以可选择各种不同专一性的酶进行专一地裂解。常用的酶及其

专一性如下：

氨基酸顺序分析常用蛋白酶及其专一性

酶名称水解的肽键

胰蛋白酶Lys（赖氨酸）、Arg（精氨酸）痰基端肽键

胰凝乳蛋白酶Trp（色氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）期基端肽键

弹性蛋白酶Leu（亮氨酸）、lie（异亮氨酸）、Ala（丙氨酸）及基端肽键

胃蛋白酶Tyr（酪氨酸）、Trp（色氨酸）、Phe（苯丙氨酸）氨基端肽键

Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）、Gly（甘氨酸）、Leu（亮氨酸）

木瓜蛋白酶

等叛基端肽键

Phe（苯丙氨酸,）、Leu（亮氨酸）、Ue（异亮氨酸）、Tyr（酪氨

嗜热菌蛋白酶酸）、Trp（色氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Vai（缀氨酸）的氨基

端肽键

枯草杆菌蛋白酶疏水侧链氨基酸残基之间的肽键

在酶法裂解肽链时，可适当的选取用一些化学药品来修饰某些氨基酸，以控制

酶的专一性，使所得的肽链片段更大一些。例如，用顺「烯二酸酎或甲基顺丁烯二

酸酊修饰赖氨酸，则胰蛋白酶仅使精氨酸的竣基端肽键断裂，若用1,2或1,3-二

耀基化合物修饰精氨酸，则胰蛋白酶仅能裂解赖氨酸峻基端肽键。当然，修饰后的

氨基酸还可以解封闭，解封闭后，前仍能选择性的作用于这些氨基酸的肽键。目前

倾向于采用这种裂解方式。

（五）、肽段的分离

肽段的分离方法主要是凝胶过滤法，但单靠凝胶过滤法分离的肽段一般纯度不

够，常需辅以离子交换层析法进行纯化。将裂解后的肽段分离纯化后就逐一地进行

分析。

（六）、肽段的顺序分析

肽段的氨基酸顺序分析有化学法和筋解法两种。

1.化学法一Edman降解法

这是目前用于顺序分析最主要的方法,它的原理是从N—端开始，逐步降解，

降解一个，分析一•个。先将肽段与I异硫氟酸苯酯（PTH试剂）|在DH8—9的条件下

作用,肽段的游离l-NH?末端I连接到异硫到酸茶酯的k原川二，生成茉异硫中氨酰

肽，简称玩二欣。在强酸（三氟乙酸）作用下，可使靠近PTC基的I氨基酸环化I,

肽键断裂形成苯氨基曝啤咻酮衍生物（APZO和个失去•末端经基酸的肽链，此肽链

不被破坏，因而乂出现一个新的N—末端氨基酸。重:复上述步骤，继续与PTH试剂

作用，继续分析。小氨基嘎啤啾酮衍生物用有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生

物很不稳定，在水中可转变为稳定的乙内酰苯硫胭氨基酸（PTH—氨刀酸）此化合

物比较稳定，便于分析鉴定。反应过程如卜.:

RiR?

N=C=S+FbN—k—CO—NH」H—CO—肽

异硫在酸茶酯（PTH）肽段

假联反应IpH8—9

R）R2

Nil—1-CO—CH——CO-肽

苯异硫甲氨酰肽（PTC—肽）

次化好裂CFJCOOH（无水）

R2

NH—C—S+3—XH—CO—肽

HN"C=0

嘎哇咻酮苯胺（ATZ）肽段（少一个氨基酸）

笨乙内酰破腺氨基酸（PTH—Uk酸）

这些步骤通常称为Edman逐步降解法。Edman逐步降解法的优点是样品用量少，

灵敏度高。PTH—氨基酸可用各种层析法进行鉴定,如纸层析、薄层层析等。虽然

此方法具有很多优点，但由于操作繁琐,工作量大，所以，有人根据Edman降解法

的原理作了一系列的改进。例如，1967年形成的液相顺序自动分析仪和1970年形

成的固相顺序分析仪都是在Edman降解法的基础上进•步改进而成的。再如，1976

年有人将Edman降解法的异硫氟酸苯酯试剂改为甲氨偶氮苯一异硫氟酸盐（简称

DAB1TC）,这是种有色试剂，产物DABTH—氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时不需要

染色，用肉眼即可分辩。此方法灵敏度高，是目前种很可取的方法。

2.酶解法

蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶，例如氨肽酶和狡肽酶，它们分

别从肽链的N端和C端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别

定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。但这种方法实际上有许多困难，局限

性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。

另外，质谱法和气谱一质谱（GC—MS）联用法也已用于肽链的氨基酸顺序分析。

这是种不同于Edman降解法和酶解法的物理化学方法，具有定的发展前途，但

口前应用还不十分普遍，其原理我们不再介绍。

（七）、肽度的重达重组

一但获得用两种不同方法断裂的肽段的全部氨基酸顺序后，就可用重迭重组的

方法确定出整条肽链的氨基酸排列顺序。肽段的重迭重组方法我们可通过下面的例

子来说明。实际工作中所得到的肽段远比下面的例子中的肽段大的多，但原理是一

样的。

例如，有一个肽链，通过末端分析已知N一末端为丙氨酸，C一末端为缀氨酸，

通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，得一套肽段（A）；再

以胰蛋白酶水解，则得到另一套肽段（B）。肽段的顺序分析结果如下：

A：丙一苯丙+甘一赖一天冬酰胺一酪+精一色+组一缴

B：丙一苯丙—甘—赖+天冬酰胺一酪—精+色一组一缀

推理如下：

A—1丙一苯丙

1丙一苯丙一甘一赖

A—2甘一赖一天冬酰胺一酪

B—2天冬酰胺一酪一精

A—3精一色

B—3色一组一级

A—4组一缀

此十肽氨基酸顺序为：丙一苯丙一甘一赖一天冬酰胺一酪一精一色一组一缴

（八）、二硫键的定位

蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中含二硫键的肽段，然后将

二硫键拆开，分别测定两个肽段的顺序，将这两个肽段的顺序与测出的一级结构比

较，就能找出二硫键的位置。含二硫键肽段的检出方法如下：

1.凝胶过滤或离子交换层析

用凝胶过滤或离子交换层析法分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出

含二硫键的肽段。

2.对角线电泳或层析

1966年布朗（Brown）和哈特莱（Hartlay）用对角线电泳进行二硫键的定位。

此方法是将水解后的肽段混合物先进行第一向电泳，样品点在中间，电泳完毕后，

将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸汽处理2小时，使二硫键

断裂。此时含二硫键肽段的静电荷发生了改变。然后，将纸条缝在另•张纸上，进

行第二向电泳，电泳条件均与第响相同，因此，电泳后各个不含二硫键的肽斑均

坐落在纸的对角线上。而那些含二硫键的肽段山于被氧化，电荷发生了改变，在第

二向电泳中，其迁移速度不同于在第一向电泳中的速度，所以就此肽斑就偏离对角

线。肽斑可用苗三酮显色。对角线法速度快，操作简便，并适用于小分了•样品，是

直接分离含二硫键肽段的好方法。

二硫键断裂产生的肽段

蛋白质一级结构的分析正向着自动化、

快速化和微量化的方向发展，关键的问题

仍然是进一步寻找蛋白质裂解和肽段分离

的方法。近年来又有许多新的方法和思路第

出现，如X-射线衍射法测定蛋白质一级

结构；分离出相应蛋白质的mRNA,测定出向

mRNA的核甘酸排列顺序，再由mRNA的核

甘酸排列顺序通过密码子排出蛋白质的一

级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋

白质一级结构研究工作的发展，使人们掌第一向

握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。对角线电泳图解

三、研究蛋白质一级结构的意义

研究蛋白质一级结构对我们了解蛋白质结构与功能的关系、生物进化、预测蛋

白质构象等生物学问题都具有重要的意义。在此我们做以简要概述。

（一）、蛋白质一级结构与分子进化

自然界中的蛋白质有种之多。不同的生物体各有自己的•套蛋白质，

但是自然界中还存在着许多同源蛋白质。所谓同源蛋白质是指不同种属的生物体中

执行同一功能的蛋白质,如动物伟的血H圭门都具直芨.输氮的功能,细胞色索.C

都具有传递电子的功能。从不同生物体的同源蛋白质一级结构的比较研究中发现,

它们之画.在氨基酸排列酶序上有诳妥聂回上由此反映出了物种的进化"也证实工达

果元全相

同源蛋白质•级结构的比较研究工作开展最多的是细胞色素C。细胞色素C是

从微生物到植物、动物以及人体都具有的一种最古老的蛋白质，是传递电子的载体。

脊椎动物的细胞色素c由104个氨基酸残基组成，昆虫类的细胞色素C由108个氨

基酸残基组成，植物的细胞色素C则有112个氨基酸残基，所有生物的细胞色素C

都含有一个辅基一血红素。比较不同生物的细胞色素C的一级结构发现有35个氨

基酸残基是完全不变的，这35个氨基酸残基正是完成细胞色素C的生物学功能必

不可少的。这就是说，虽然生物不断进化，但只要细胞色素C仍然担负着传递电子

的作用，那么，为了完成这一功能所必须的氨基酸就始终不会改变。

比较目前研究过的近百种生物的细胞色素C的氨基酸顺序，我们可以看出差异

的大少与亲缘关系密切相关。如卜,表：

各种有机体细胞色素C中氨基酸顺序的差异

氨基酸顺序氨基酸顺序

相互比较生物种类相互比较的生物种类

中差异的数目中差异的数目

人—黑猩猩0哺乳动物内部平均5.1

人一恒河猴1猪一牛一羊0

人一其它哺乳动物平均约10马一牛3

人一禽类平均约13哺乳动物一禽类平均9.9

人一昆虫平均约30哺乳动物—爬虫类平均14.3

人一植物平均约40陆生脊椎动物一鱼类平均18.5

人—微生物平均约50脊椎动物-无脊椎动物平均26.0

同遮蛋白蜘壬虫氨基斑囱顺底的独属差是部分系生物进也过程史基因突

变的结暴如果恭B因变曼致蛋Q质二级结构改变丕影响珈心独1白＞就

分子进化研究是随着蛋白质一级结构的研究发展起来的一个课题。我们知道生

物均山古生物进化而来，也就是说任何生物都有其祖先，那么，蛋白质是否也有祖

先蛋白的问题呢？从对几种不同蛋白质一级结构相似性的分析，可以说祖先蛋白的

概念是成立的。例如，丝氨酸蛋白水解酶与胰蛋白酶、糜蛋白酶A、弹性蛋白酶以

及凝血酶原的氨基酸顺序极其相似，虽然它们的祖先蛋白质的结构还不清楚，但是

人们认为这些蛋白质是来自于一个共同的祖先。再如，动物的肌红蛋白与血红蛋白

的a、B链的一级结构和三级结构是非常相似的，甚至植物的豆血红蛋白的结构也

与它们很相似，这是因为它们有共同的祖先。它们是由同一祖先（珠蛋白）的基因

发生变异形成的。又如，含有51个氨基酸残基的胰岛素是由84个氨基酸残基的的

胰岛素原经酶作用切去C链后生成。而神经生长因子（NGF）是由118个氨基酸残

基组成的，它与胰岛素的一级结构极其相似，因此可以认为胰岛索与神经生长因子

均由祖先蛋白胰岛素原进化而来。这种从一个共同祖先蛋白质发展出另一种新蛋白

质的现象称为分叉进化。分叉进化形成的两种不同蛋白质都保留着过去历史的痕

迹，反映在氨基酸顺序上就有相同之处。因此，蛋白质一级结构的研究是推动分子

进化研究的一个重要方面。

（二）、一级结构与功能的关系

蛋白质的氨基酸顺序与生物功能具的密切的关系，特别是蛋白质与其它生物大

分子物质之间的相互作用及其作用方式都是由氨基酸顺序决定的。例如：

1.细胞膜上的血型糖蛋白的一级结构就

与膜结构彳j•着重:要关系。血型糖蛋白的分子量

为31000,含糖量为60%,由131个氨基酸残基

组成，它的分子中含有16条寡聚糖链。血型糖

蛋白分子一部分位于细胞外面，为N—末端部

分，含有脚划礼是亲水的月醇；中间咤一部

分跨过细胞膜」一这.部今绥出1疏正氨基酸I组成

的；还有一部分位于细胞的内部，也是露的

肽段。这三部分氨基酸顺序不同，分别与它们

的功能有关。细胞外的部分含有1寡聚糖链与

细胞的1B有制...血型糖.蛋白的跨膜部分.由疏

灰氨基酸组成，.故与生物膜的廊菽局能以琉

水作用力结合在一起。细胞内的部分山于是亲

水的故能溶王细胞质史〜

2.蛋白质与核酸的院苗也与蛋白质的须基血型糖蛋白的跨膜结构示意图

酸顺序有密切的关系。例如，真核细胞染色体

圾与组蛋jaa结合作用娱蛋包照正史氨

基酸残基上的正电荷与.DNA.分子由磷酸基1上的L

负电荷之.间的谶电引.力.•小生组蛋白含有.129.4

氨基嬲基」氨基酸生宜必灌正

电荷（如Lys、Arg等），而不含负电荷氨基酸。小牛组蛋白与DNA结合状态示意图

因此*…这部分肽段能与…PNA.双螺旋空带血电荷.

3.有些激素是简单的多肽，它们各自具有特殊的功能，大多数的结构也已研

究清楚，我们可以通过比较来了解肽链一级结构与功能的关系。例如，牛的催产素

和抗利尿素的结构相似，都是环八肽，但有两个氨基酸不同。结构如下厂

S---------------------------------------------------------S

甘一植一晡一’胱一天冬酰胺一谷氨酰胺一茎因一酪一5胱

（牛抗利尿素）

S---------------------------------------------------------S

甘一亮一脚一3胱一天冬酰胺一谷氨酰胺一升亮一酪一」胱

（牛催产素）

由于结构相似，两者在生理功能上也有相似之处，但活性差别很大。催产素主

要是促进子宫收缩的催产作用，但同时也具有微弱的抗利尿活性；抗利尿素的主:要

作用是抗利尿和增血压，但也具有微弱的催产活性。这说明由于结构相似也引起功

能上互有另一种激素的微弱活性；同时也说明只要结构有差异，那怕是相差一两个

氨基酸，其生物学活性就有较大的差别。

4.蛋白质一•级结构改变，往往会导致功能的改变。例如，正常人血红蛋白B

链从N一端开始第6位氨基酸是谷氨酸当此氨基核被缀氨酸取代时,将导致镰刀

型贫血病。谷氨酸的侧链是带有负电荷的亲水竣基,而缀氨酸的侧链是不带电荷的

疏水基团。当谷氨酸被缴氨酸取代后使Hb的表面电荷性质发生了改变，于是等电

点改变，溶解度降低和不正常聚合增加，以致红细胞收缩变形而成为镰刀状，且输

氧能力下降，细胞脆弱，容易溶血，严重的可导致死亡。就正是我们所说的分子病

中的•种，是由于基因突变引起的，具有遗传性。

5.在动物体内的某些生化过程中，蛋白质分子的肽链必须先按特定的方式断

裂，然后才呈现生物活性。蛋白质分子的这一特性具有重要的生物学意义。这是蛋

白质分子结构与功能具有高度统一性的表现。例如，在酶的调控中，早就发现，许

多酶有一个无活性的前体，经专--的酶（或其它物质）作用切去一段肽链后，才成

为有活性的酶（如胃肠道中的几种蛋白酶及血液中的凝血酶等）。再如，血液凝固

过程中，纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程。纤维蛋白原是无活性的前体,呈细长

的纤维状，由6条肽链组成，2条A。链，2条BB链，2条Y链，所以可表示为（A

aBPY）2O血液凝固过程中，在凝血酶的作用下，分别从Aa链和BB链的N—端

水解下来4个肽段，即2个A肽和2个B肽。A肽为19肽，B肽为21肽。从一级

结构上讲，它们都含有较多的酸性氨基酸。当切除A、B肽后，使蛋白质分子的负

电荷减少，促进了纤维蛋白分子的聚合，进而在凝血因子的作用下，形成网状结构

的纤维蛋白，使血液凝固。其过程如下：

（2A+2B（血液纤维蛋白肽）

（AaB留方凝血酶A

纤维蛋白原1B也自发聚合5GB糠位网

纤维蛋白单体纤维蛋白多聚体纤维蛋白

近年来发现许多肽类激素也都存在着前体。例如，胰岛素的前体一胰岛素原是

由84个氨基酸残基组成的一条长链，即在胰岛素和A、B两链之间连接着一段由

30多个氨基酸组成的C链。经专一的筋水解切除C链后，才形成通过二硫键使A、

B两链相连的活性胰岛素。

蛋白质在初合成或分泌运输阶段或贮存阶段是无活性的前体，在到达其发挥作

用的部位或在需要其发挥作用时，才转变成有生理功能的蛋白质，这是生物体内-

种十分巧妙的调控过程。

从上面几个问题人们可以清楚地看到，蛋白质一级结构的研究对阐明生命现象

的本质是非常重要的。

（三）、从蛋白质一级结构预测其二、三级结构

研究蛋白质一级结构的一个重要目的是利用氨基酸顺序的资料预测蛋白质的

二级以至三级结构，甚至还可以预测蛋白质的某些功能。因为蛋白质•级结构包含

着蛋白质分子的所有结构信息，我们可以利用这些信息预测出蛋白质的空间结构。

许多科学家在这方面已做了不少工作。例如，1975年利维特（Levitt）和沃谢尔

（Warshel）从胰蛋白质抑制剂的氨基酸顺序之间的热力学相互作用数据（最小能

量和热能化）模拟「该蛋白质的折迭结构，其结果与X—射线衍射的结果有相当好

的一致性。1979年仇（Chou）和费思曼（Fasman）根据蛋白质中氨基酸残玷形成

Q-螺旋、折迭或B-转角的倾向，预测了山一级结构折迭成二级结构、超二

级结构构象，也得到了很好的结果。1982年索尔（Sauer）等人曾经指出：“顺序

的同源性反应出结构的同源性。”这是很有意义的概念。现在，人们已经能够利用

微电脑来研究蛋白质的分子构象。英国成立了生物化学微电脑组织，我们可以相信，

随着电子计算机在生物化学中的广泛应用，今后这方面的进展将会更加神速。

第二节蛋白质的二级结构

蛋臼质二级结构是指多肽链主链上局部原子的空间排列状态。二级结构是靠肽

链中〉N—H与＞C=O之间所形成的痣键而得到稳定的。所以二级结构只涉及肽

链主链的局部原子及其链内的氢键，而不涉及侧链构象和与其它肽段之间的关系。

一、肽键

在蛋白质分子中氨基酸靠肽键连接成多肽。肽键的结构如下:

波林（Pauling）和莫曼奈（Momany）分别

于1951年和1975年测定了肽的键长和键角。发H、、/C。

现肽键（即C-N）的长度为0.133nm（1.33X）。N——C'

而正常的C—N键长为0.149nm（1.49么），C=N

键长为O.I27nm（1.27X）。可见，肽键的长度介于

单健和双键之间。并且C=0比正常的醛或酮