发酵工程实验

发酵工程试验发酵工程试验10/32试验一酸奶的制作及乳酸菌的活菌计数〔5〕试验目的：1、学习并把握酸奶制作的根本原理及方法。2、了解市售酸奶的生产工艺。3、把握乳酸菌活菌计数方法及操作。试验原理：乳酸菌在生长生殖，发酵分解乳糖产生乳酸等pH四周发生凝集。乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长生殖较好，试验室条件下利用混菌培育的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。试验内容：〔一〕酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水〔80℃左右〕中，充分搅拌均匀，配成调制乳；24-8％的蔗糖。390℃5mi；443-45℃灭过菌的参与乳酸2%-5%。5不能在发酵罐容器中先发酵然后再进展分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培育基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培育，在小容器中发酵制成酸奶。640-43℃，一般发酵3-6h。发酵终点确实定有两种方法：1〕65-70T°。2〕倾斜观看，瓶内酸奶流淌性差，而且瓶中部有微小颗粒消灭。7、冷却：发酵完毕，将酸奶从发酵室取出，用冷风菌停顿生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。9、感官指标组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。气味：具有芳香纯洁的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。〔二〕乳酸菌活菌检测115～121℃20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。1090ml4-6250ml180rpm30min10－11ml9.0ml10－210－81③、倒培育平板，从上述已稀释了152℃水浴锅中的呈溶解状15浸到培育皿，及菌悬液充分混合均匀〔倒入培育基后，马上用手转动培育皿，转动几下，让其混合均匀，然后等其凝固再移入培育箱中培育，留意最终一步倒平皿必需在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移液管。④、培育条件：37℃48～72h。11/克，假设有200200/克。试验器材及试剂：菌种：市售酸奶 试剂：白糖 奶粉 培育基各成分器材：培育箱、电炉、铝锅5L，培育皿，酸奶发酵瓶〔自带〕试验结果：1、具体描述自己制作的酸奶结果：奶更稠密，酸奶的香味及酸味明显，制作成功2、均值。落，因此无法统计酸奶中的菌含量答：制备乳酸菌时，瓶子未使乳酸菌完全处于无答：制备乳酸菌时，瓶子未使乳酸菌完全处于无菌也可以生长，酸奶制备成功。但在平板接种时，由于污染杂菌，乳酸菌并未长出。乳酸菌计数失败。思考题：乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输、保藏带来很大的本钱，请问可承受什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率？答：在基因水平上对乳酸菌进展基因重组，从而获得耐高温乳酸菌。在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基因上，对乳酸菌的基因进展修饰使其表达，以此来获得耐高温菌株。试验二枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定〔5〕试验目的：1、学习了解固态发酵原理；2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的把握技术；3、把握枯草芽孢杆菌活菌计数方法及操作。试验原理：作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的争论及开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。作为益生菌的一种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的争论和应用始终都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。目前芽孢杆菌多承受液体深层发酵技术，再经喷雾枯燥进展生产，对设备要求高，生产工艺简洁；而于液体发酵。所以近年来各生产厂家都在乐观探究芽孢杆菌的固体发酵技术，以求简化生产工艺，提高产量，降低生产本钱。固态发酵定义：指没有或几乎没有自由水存在下，在有确定湿度的水不溶性固态基质中，培育一种或多种微生物的生物反响过程，是以气相为连续相的生物反响过程。枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，试验室条件下利用稀释涂布培育的方法，让菌在有氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。试验内容：1、液体种子培育基配制：1%，pH7.0。2、液体种子培育：每300mL三角瓶装量50mL液体种子培育基，115℃30min。降温后从斜面接一环37℃20024。3、固体发酵培育基：麸皮60%，稻草粉10%，玉5%，250.050.5%，1:1.1。4、三角瓶固体发酵培育：每250mL三角瓶装量20-30〔湿重，固体发酵培育基原料试剂混合料，加水，料水比为1:1.1，搅121℃30min，降温后接种量为2%(V/M：V—液体菌种体积数，M—固体发酵培育8048h。〔二〕枯草芽孢菌活菌检测0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，12%，pH7.0。115℃20min52℃保温备用。1090ml250ml180rpm9.0ml10－210－8152℃水浴锅中15中，全部浸到培育皿，待培育基凝固；从上述已稀10.2ml10min，然后再移入培育箱中培育。④、培育条件：37℃24～48h；⑤、培育完毕后，取出进展计数。〔三芽孢率测定:承受芽孢革兰氏染色后显微镜下观看试验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌 试剂：培育基成分 器材：培育箱、灭菌锅，培育皿试验结果：1、具体描述枯草芽孢杆菌固态培育物〔外观、气味、培育物状态等：无光泽，边缘不整齐，形成的菌落为圆形。培育基中的枯草芽孢杆菌有腥臭味，长势良好，观看培育基，无明显染菌现象。2、记录活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。答：数量稀释倍数密度〔/g〕第一个平板1125×1075.6×109其次个平板655×1073.25×109第三个平板225×1071.1×109平均值平均值3.32×1093、同时用图片记录试验过程中各现象及结果，并对图进展注释。菌落成白色，菌落外表有褶皱思考题：在枯草芽孢杆菌固态生产过程中，为了防止霉菌及酵母的污染，可如何进展操作？答：参与抗真菌抑制剂试验三、 试验类型：综合性试验目的：了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其把握条件生疏酒精生产的工艺流程、把握酒精发酵的操作方法把握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法把握在试验室中模拟酒精发酵的工艺流程试验原理玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进展〔液化、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的承受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进展酒精发酵。在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的根底，可通过测定发酵过程中产生CO2的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵力气。试验内容1、原料的粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎，玉米淀粉含量为7075%。2、蒸煮糊化 称取确定量的粉碎后淀粉质原料，按确定的料水100200m调制淀粉乳90100℃条件下恒温水浴加热淀粉乳受热后在确定温度范围，淀粉粒开头破坏，晶体构造消逝，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。3、糖化经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。酶参考用量：淀粉乳 33%，60℃，ph4.5，酶240U/g绝干淀粉，糖化时间16h。糊化醪液调整pH4.5，往其中参与确定量的淀粉酶〔120U/g、糖化酶〔120U/g，60℃拌，直至粘度下降到确定程度，淀粉完全糖化4、发酵〔1〕干酵母活化 将干酵母按1:20的比37℃20min。目的：恢复酵母细胞的正常功能。〔2〕400ml大可乐瓶中，加一样体积的水稀释，参与活化好的酵母5ml，混匀，2836h5、二氧化碳生成的检验〔1〕观看三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；〔2〕滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中，观看，如气体渐渐消逝，则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定 〔1〕接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1;试验完毕，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2； 〔3〕二氧化碳生成量=W1-W27、酒精生成的检验翻开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；5ml102ml；1%K2Cr2O710-20发酵工程试验发酵工程试验答:1答:1二氧化碳生成的检验培育约48h15/32H+K2SO4+Cr2〔SO4〕3试验器材及试剂：菌种：活性干酵母 试剂：培育基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶溶液：10%H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：试管、培育箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机试验结果：1、具体记录试验过程中各参数及数据。淀粉淀粉100g淀粉酶10gCaCl20.17g糖化酶2.5g对试验结果的推断及分析。发酵工程试验发酵工程试验19/32稀，靠瓶壁边缘有一连串微小气泡2取发酵液5ml,加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，颜色由黄色变为黄绿色，稍加热后现象产生更快，更明显。3操作不同的试验，推断哪株酵母发酵酒精力气最强？答：按试验步骤配制等量的三组醪液，参与等量糖化酶进展糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，向三组糖化后的淀粉上清中参与等量3酵母种液，一样条件下培育一段时间，分别测定三组试验产生的CO2CO2酵酒精力气越强。试验四黑曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反响〔5〕试验目的：1、了解黑曲霉固体发酵产酶状况2、把握微生物固体发酵操作技术3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法试验原理：纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。试验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。试验内容1、黑曲霉菌种活化PDA200g去皮切碎，加水1000ml20g20g分装试管，每试管约5-10ml〔视试管大小而定，15磅蒸气〔121℃〕灭菌20冷却后贮存备用。在无菌超净台上接种保藏的黑曲霉于PDA面，28℃5-7215g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5%(NH4)2SO415ml〔加水量4060，拌匀，装瓶；3、灭菌：121℃灭菌30min，冷却至室温。4、黑曲霉孢子悬浮液制备已培育好的黑曲霉孢子斜面一支，参与约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。53096h，12h6、提取粗酶液50ml30min-1h；过滤得粗酶液。7、酶活性测定1%CMC配方：1g1.8g琼脂，100ml，琼脂完全溶解后，参与0.03g15ml。打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔四周的培养基微融，然后平放冷却。加样：往孔内参与粗酶液适量〔约同时需设比照。培育〔反响30℃20观看结果：可直接观看透亮圈有无、测定透亮圈直径。试验器材及试剂：菌种：黑曲霉试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠〔CMC〕器材：培育箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶试验结果：1、认真观看固体培育基发酵前后的状态，并描述；〔麸皮、稻草〕颖，粘度大成团状及菌体，培育基养分成分被利用，体积缩小2、小。现象：纸片四周消灭浅浅的水解圈，打孔培育基未消灭2.5cm3cm，直径比5:6思考题：纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？而现实存在什么问题？目前对纤维素降解有哪些争论进展？答：要想最大限度的利用纤维素，可从两个方面入手。一是通过生产高性能纤维素酶的方法，二是找到蕴含能量较高的纤维素。而现实中存在的问题是高性能纤维素酶的猎取，而可以通过诱变和筛选获得可产生纤维素酶的菌株。目前在纤维素的降解方面，微生物的争论较多，降解纤维素的真菌有很多，如木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属、枝顶孢霉属、毛壳霉属和脉孢霉属等。其中，很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌物质的接触面积，从而加快降解速率。如木霉属、青霉木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和争论较多的一个属。试验五甘露聚糖酶液体发酵及酶解反响〔6学时〕试验目的：1.了解并把握液体发酵产酶操作及酶反响条件的把握2.及固体发酵产酶进展比较分析试验原理1,4-β-D1,6-α-糖苷键及甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纤维素的其次大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖格外少见。β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。β-甘露聚糖酶可以制取有特别保健作用的甘露寡糖。在纸浆制造业，可用于代替碱法进展脱色、漂β-甘露聚糖酶及其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。甘露聚糖酶的工业化生产将在很多行业产生很大的经济和社会效益。因此，近年来甘露聚糖酶渐渐成为国内外关注和争论的热点之一。甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要确定的诱导物存在。本试验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。试验内容1.菌种活化LB10g/L，酵母5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml〔视试管大小而定，15磅蒸气〔121℃〕灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB，28℃22.配制产酶培育基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L10g/L，魔芋粉30g/L，3.10〔25ml养基/250ml三角瓶，121℃灭菌20分钟；4.菌悬液的制备已培育好的枯草杆菌斜面一支，参与约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。5.接种用移液管在无菌条件下吸取确定量的悬液，移入灭菌好的固体培育基中，于37度200rpm条件下培育72h。6.粗酶液提取：3000rpm7.酶解底物分析：预备两三角瓶，分别参与自来水，46

50ml8.往两三角瓶中各参与1g魔芋粉，然后其中一个参与粗酶液1ml1ml蒸馏水〔做空白比照5-10min1g5g9.30-60min，期间观看反响现象。试验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌 试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉器材：培育箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶试验结果：1、认真观看液体培育基发酵前后的状态，并描述；答：①发酵之前的液体培育基的状态：在配制产酶培育基时，魔芋粉难溶解，照旧是固体颗粒。等完全灭完菌后，放正在试验台上，等冷却后，状态比较像固体培育基，但魔芋粉照旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培育基中。体状2、认真观看底物水解前后的现象。答：比照组：魔芋粉结成团，答：比照组：魔芋粉结成团，透亮，具有弹性，黏度很大，无法搅拌，试验难以连续。试验组：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的思考题：以本人液体发酵产酶为例，请具体介绍甘露聚糖酶定量测定的原理及方法。答：原理：样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进展水解，用DNS试剂〔3,5-二硝基水杨酸〕分光光度法测定水解所产生的复原糖量。方法：别向2支试管中参与1.8mL底物溶液，置50℃5min200μL50℃水浴中准确保5min3.0mLDNS拌均匀。在另一支试管〔空白管〕中参与200μL稀释酶样，同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min，540nm空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。试验六从土壤中分别筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析试验目的：1、从土壤中分别产抗生素的放线菌。2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。3、把握微生物的根本操作。试验原理：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了争论某种微生物，就必需把它们从这些混杂的微生物群体中分别出来，从而获得某一菌株的纯培育。分别放线菌常用稀释倒平板法。依据放线菌的养分、酸碱度等条件要求，常选用合成培育基或有机氮培育基。假设培育基成分改变，或土壤预先处理〔120℃热处理1h，或参与某种抑制剂〔如加数滴10，都可以使细菌〔本试验参与重铬酸钾150㎎／从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培育基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，挑取纯菌落进展抗菌谱分析，指示菌为大肠杆菌〔G-〕和枯草芽孢杆菌G。试验内容1、高氏一号培育基的制备可溶性淀粉201g,氯化钠0.5K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g20g1000ml，pH7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边参与其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟〔试验中所用无菌器具均在此时灭菌。2、土壤取样及其悬液梯度稀释〔最好是有机质含量高的菜地〕，按对角穿插〔五点法〕取样。先除去表层约2cm的土壤，2～10cm处的土壤。盛51kg去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入试验。310g90mL角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或10-130s。9ml410-2、10-3、10-410-510-11ml10-23~4次，使及9ml水混匀，即为10-2液。依此类推，直到稀释至10