第四章目的基因的转化及其原理详解演示文稿

第四章目的基因的转化及其原理详解演示文稿当前第1页\共有51页\编于星期三\11点优选第四章目的基因的转化及其原理当前第2页\共有51页\编于星期三\11点一、植物基因工程载体命名规则及种类1、植物基因工程载体命名规则：(1)

pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌农杆菌的质粒类型（Agrobacteriumtumefaciens）pRiT37/pArT37发根农杆菌的质粒类型（Agrobacteriumrhizogenes）3当前第3页\共有51页\编于星期三\11点（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，如：leu（亮氨酸基因位点）

基因表现型用正体表示，如Leu（3）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后加该位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分别为突变型或缺陷型，表示为：leuA、leuB(4)抗性和敏感性分别用R或r，S或s表示

4当前第4页\共有51页\编于星期三\11点2、植物基因工程载体的种类及特性植物基因工程载体克隆载体中间载体中间克隆载体中间表达载体卸甲载体onc-onc+转化载体中间黏粒载体质粒/黏粒载体基因标记载体一元转化载体（顺式载体）双元转化载体（反式式载体）共整合载体SEV（拼接末端载体；split-endvector）5当前第5页\共有51页\编于星期三\11点二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能2、T-DNA的基因结构与功能3、Vir区操纵子的基因结构与功能

6当前第6页\共有51页\编于星期三\11点一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能1.Ti质粒的遗传特性及类型Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子。

根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)7当前第7页\共有51页\编于星期三\11点图3-1章鱼碱型Ti质粒基因图。章鱼碱基因T-DNA区结合转移区冠瘿碱代谢复制起始区毒力区生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成8当前第8页\共有51页\编于星期三\11点2.Ti质粒的功能区域Ti质粒可分为四个区：（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）：

T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulenceregion）该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。9当前第9页\共有51页\编于星期三\11点（3）Con区（regionsencodingconjugations）该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。10当前第10页\共有51页\编于星期三\11点3.Ti质粒的生物学功能Ti质粒的功能可归为以下7个方面:①参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。②诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。③赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。④赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。⑤为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。⑥决定寄主菌株的植物寄主范围。⑦有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”。11当前第11页\共有51页\编于星期三\11点表4-1Ti质粒放入部分基因及其功能基因缩写表型及功能在基因图上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌体API111-11310-12agr对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感138-141—arc分解精氨酸4-59-10agc分解农杆菌—54-57noc分解胭脂碱18-20—nos合成胭脂碱0-1—occ分解章鱼碱—39-41ocs合成章鱼碱—0-1ori复制起点33-3590-95roi（tmr）抑制长根206-207190-192shi（tms）抑制长芽202-203187-188traTi质粒转移121-12321-30inc质粒不相容性33-3590-9512当前第12页\共有51页\编于星期三\11点二、T-DNA的基因结构与功能

1.T-DNA的发现

Chilton等人于1982发现。(MD

CHILTON,DTEPFER,APETIT,DCHANTAL

,CDFRANCINE,TJACQUES.

Agrobacteriumrhizogenes

insertsT-DNAintothegenomesofthehostplantrootcells.Nature,1982(295):432-434）

研究证明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。13当前第13页\共有51页\编于星期三\11点GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT图3-2Ti质粒上几个重要区域及其序列LB：左边界序列；RB：右边界序列14当前第14页\共有51页\编于星期三\11点2.T-DNA的结构特点l

Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb；l

T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；l

在T-DNA的5´端和3´端都有真核表达信号。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。15当前第15页\共有51页\编于星期三\11点T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列（bordersequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。致瘤性：右边界作用大于左边界16当前第16页\共有51页\编于星期三\11点3.T-DNA上的编码基因及功能

T-DNA的转录有下述共同点：①T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录。②T-DNA上每个基因都有各自的启动子。③基因的转录由植物细胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，T-DNA的转录机理可能与真核生物相同。⑤植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。17当前第17页\共有51页\编于星期三\11点TLTRTCiaaHiaaMauxiptcytocsfrsmasags图4-3章鱼碱型Ti质粒的T-DNA编码基因结构iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸单加氧酶；aux：生长素；ipt:异戊烯基转移酶；cyt：细胞分裂素；frs：琥珀碱合成酶；mas：甘露碱合成酶；ags：农杆碱合成酶18当前第18页\共有51页\编于星期三\11点T-DNA区基因的功能

第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，如:frs、mas、ags第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分裂素基因cyt

19当前第19页\共有51页\编于星期三\11点三、Vir区操纵子的基因结构与功能1、Vir区操纵子的基因结构：农杆菌致瘤所必须的；Vir区仅位于T区DNA左侧；两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。HABGCDEFtzsABGCDE章鱼碱胭脂碱图4-5章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的Vir区编码基因结构20当前第20页\共有51页\编于星期三\11点表4-4章鱼碱型Ti质粒vir基因基本结构与功能遗传座位分子量（kb）基因数表达方式功能virA2.81组成型帮助接受植物信号分子启动毒性区表达virG1.01组成型转录活化virC1.52诱导型T-DNA加工virD4.54诱导型T-DNA加工virE2.22诱导型T-DNA加工virB9.511诱导型膜转运蛋白virF1.01诱导型T-DNA转运virH94.22诱导型细胞色素P-450单氧化酶21当前第21页\共有51页\编于星期三\11点三、农杆菌Ti质粒基因转化机理

已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞，并非整个Ti质粒都进入植物细胞。该基因转化过程是一个复杂的遗传工程。22当前第22页\共有51页\编于星期三\11点1、T-DNA的加工及转移

23当前第23页\共有51页\编于星期三\11点四、T链整合植物基因组的分子机理

1、整合位点及其特性T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何一条染色体插入位点常有以下特点：①T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；②T-DNA与植物DNA连接处富含A，T碱基对；③植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。24当前第24页\共有51页\编于星期三\11点2.T-DNA的整合机理

双链断裂修复模型（DSBRmodel）单链缺口修复模型（SSGRmodel）

25当前第25页\共有51页\编于星期三\11点Sci，IF：9.20526当前第26页\共有51页\编于星期三\11点27当前第27页\共有51页\编于星期三\11点Fig4-6IllegitimaterecombinationmodelsforT-DNAintegration.(a)Double-strandbreak-repair(DSBR)andsingle-strandgap-repair(SSGR)modelsequallyexplaintheintegrationeventsleadingtoT-DNAinsertion621-x34.AsoutlinedintheDiscussion,theDSBRmodelpredictsadouble-strandbreakinthetarget.UnwoundorexonucleaseprocessedendsoftheT-DNAandofthetargetannealbypartialhomologouspairing.Single-strandoverhangsareremovedbyendo-orexonucleasedigestion;theendsarerepairedandligated.TheSSGRmodelpredictsanickinthetargetthatisconvertedtoagapbya5'-3'exonuclease.TheT-strandinvadesthegapandasynapsisisformedbypartialpairingbetweenT-DNAendsandtarget.TheoverhangsoftheT-DNAareremovedandtheT-strandisligatedtothetarget.AnickintroducedintothesecondstrandofthetargetinitiatesrepairsynthesisofthesecondstrandoftheT-DNA.(b)ApplicationoftheSSGRmodelforT-DNAinsertion621-36.Asproposedinthemodelofinsertion621-x34,repairattheendsofinvadingT-strandmayoccurbeforeligation.AbsenceofaninternalCAGTT-DNAsequencefromtherightjunctionofinsert621-36suggeststhatcopyingofthetargetplantDNAledtoalterationoftherightT-DNAendduringintegration.Mismatchrepairmaysimilarlyexplaintheobserveddeletion.(c)AmodifiedversionofSSGRmodelexplainingpossibleinvolvementofVirD2proteininrecombinationeventsthatresultedinT-DNAinsertions621-37andN6H-cs4.T-DNAinvasiondepictedinthemodelinvolvesVirD2-mediatedrecognitionofanick(orgap)thatisfollowedbyligationofthe5'endoftheT-strandtothetargetDNA.The3'endoftheT-strandmovesalongthetarget,whiletheunwoundtargetDNAstrandisremovedbyexonucleolyticdigestion.Atthepositionwherethe3'endoftheT-strandisstabilizedbybase-pairing,theT-strandisligatedtothetarget.Atthesamepositionanickisintroducedinthesecondstrandofthetargetthatdefinestheleftbreak-pointoftargetdeletionandinitiatesthereplicationoftheT-strand.Symbolsusedforpresentationofputativerecombinationeventsareexplainedunderneaththemodels.28当前第28页\共有51页\编于星期三\11点3.T-DNA整合的遗传效应T-DNA插入的遗传特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。(2)另一个常见的结果是，在T-DNA／植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，这些“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（5～10b）同源，则可以在整合中起作用。29当前第29页\共有51页\编于星期三\11点五、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建

2、中间载体/表达载体的构建

3、植物基因转化载体系统的构建30当前第30页\共有51页\编于星期三\11点1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建

野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，基因工程中难以操作；②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，..难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；③T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）,因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体；⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。

31当前第31页\共有51页\编于星期三\11点为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为”中间载体”（intermediatevector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲载体（disarmedvector）。32当前第32页\共有51页\编于星期三\11点2、onc-卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的（non-oncogenic）Ti质粒载体。因为利用野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除T-DNA上的onc基因，即“解除”其“

武装”,构建成所谓“卸甲”或称“缴械”载体（disarmedvector）。在这种onc-载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在

pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过与

pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。33当前第33页\共有51页\编于星期三\11点onc+卸甲载体

对于研究外源基因在转基因植株中的表达，以及对于以改良农作物为目的的植物基因工程而言，onc-体系是最有用的。不过，人们可能还要设计一些特殊的实验来研究外源基因在冠瘿瘤组织中的表达问题。在这种情况下，使用onc+菌株载体则比较合适。由于冠瘿瘤组织具有不依赖于激素的表型特征，所以这种载体系统的优点在于它可以快速地增生冠瘿组织，比较快速而容易得到转化体。34当前第34页\共有51页\编于星期三\11点2、中间载体的构建（1）中间载体的基本结构与特点

为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中间载体（intermediatevector）是有效方法之一。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的T-DNA片段，而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质粒，这一点对于通过体外遗传操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体，即共整合系统中间载体和双元载体系统中间载体。35当前第35页\共有51页\编于星期三\11点共整合系统中间载体的特征①中间载体必须含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；②它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；③它必须

有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；④它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；⑤它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；⑥无Ti质粒的边界序列。36当前第36页\共有51页\编于星期三\11点双元载体系统的中间载体与共整合系统中间载体不同之处是:①无同源序列；②具有LB和RB;③无Co1E1复制点

37当前第37页\共有51页\编于星期三\11点（2）中间表达载体启动子及其它调控序列

转录的调控对真核生物基因表达起着关键性作用。就真核生物基因表达调控序列而言，大多数真核生物在转录起始点的5′端上游区第30至25bp处具有TATA盒，在70至80bp处还有CAAT盒。在大多数真核生物基因的3′端具有AATAA序列。这些5′和3′端的调控序列对真核生物的基因表达起着关键性作用。Ti质粒虽然来源于农杆菌，但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。38当前第38页\共有51页\编于星期三\11点39当前第39页\共有51页\编于星期三\11点3、植物基因转化载体系统的构建（1）一元载体系统（2）双元载体系统40当前第40页\共有51页\编于星期三\11点1．一元载体系统的构建这一类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共整合载体（co-intergratedvecter），又由于该载体的T-DNA区与Ti质粒Vir区连锁，因此又称之为顺式载体（cis-vector）。一元载体的特点是:①由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大；②共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；③必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；④构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体和拼接未端载体（split-endvector,SEV）。

41当前第41页\共有51页\编于星期三\11点（1）共整合载体的构建共整合载体的特点是：①中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；②中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322。共整合载体的构建过程

l）中间载体pLGV1103导入农杆菌:目前通常采用两种方法，即接合转移法（conjugativetransfer）和三亲杂交转移法。

2）中间载体与受体Ti质粒的同源重组。

3）共整合载体的选择。

42当前第42页\共有51页\编于星期三\11点共整合转化程序当前第43页\共有51页\编于星期三\11点（2）

SEV的构建SEV系统即T-DNA边界拼接系统，亦称拼接末端载体（sp1it-endvecter,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一种共整合载体，也因为它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。SEV与pGV3850的差异及构建过程如下述：1）SEV的受体Ti质粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-DNA的保留部分被称为“左边界内部同源区”（1eftinsidehomcology，LIH）。该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的抗性基因。2）SEV中间载体具有一个细菌的抗性基因，一个植物抗性基因及与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR。3）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源序列，即可发生同源重组，形成SEV的共整合载体。

44当前第44页\共有51页\编于星期三\11点（3）

SEV与pGV3850比较

两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，故同属于共整合的一元载体系统，但它们之间有着一定的差异：1）它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同。pGV3850的左右边界在一个受体Ti质粒上，而SEV来自二个质粒，即TR来自中间载体。2）同源序列不同。pGV3850重组的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合载体。由于pGV3850共整合载体，带有大肠杆菌pBR322序列，外源基因嵌合在该序列中，因而转化的植物中也带有重复的pBR322序列。此重复序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响，而SEV系统则排除了这种可能。45当前第45页\共有51页\编于星期三\11点2．双元载体系统

双元载体（binaryvecter）系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans