第四章中药制剂的含量测定演示文稿

第四章中药制剂的含量测定演示文稿当前第1页\共有119页\编于星期三\11点优选第四章中药制剂的含量测定当前第2页\共有119页\编于星期三\11点用适当的化学方法或仪器分析方法对制剂中有效成分或有效部位进行的定量分析。以其测定结果是否符合药品标准的规定来判断药品的优劣，是控制和评价药品质量的重要方法。中药制剂含量测定的定义当前第3页\共有119页\编于星期三\11点中药制剂含量测定的特点含量测定内容中药制剂化学药品对象不同供试品溶液制备待测成分确定组成及成分复杂方法繁琐，大多需要净化分离先根据中医药理论选择药味，再综合选择待测成分成分单一方法简单成分明确，一般选择主要成分中药制剂与化学药品含量测定区别当前第4页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

作用：将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。

当前第5页\共有119页\编于星期三\11点步骤：样品的粉碎样品的提取样品的分离净化第一节含量测定样品的处理

当前第6页\共有119页\编于星期三\11点目的：1.保证所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度。2.加速被测定组分的提取完全。样品的粉碎第一节含量测定样品的处理

当前第7页\共有119页\编于星期三\11点注意：1.避免过细2.避免样品受污染3.避免粉尘飞散及挥发性成分的损失4.避免丢弃不易通过筛孔的部分颗粒设备：粉碎机、研钵、高速匀浆机、玻璃匀浆器细粉：全部通过5号筛（80目），并含能过6号筛（100目）不少于95％的粉末样品的粉碎第一节含量测定样品的处理

当前第8页\共有119页\编于星期三\11点冷浸法回流提取法连续回流提取法超声法超临界流体提取法

关键——提取完全样品的提取第一节含量测定样品的处理

当前第9页\共有119页\编于星期三\11点称取一定量样品置于带塞容器内，摇匀后放置，浸泡提取，溶剂用量为样品重量的10～50倍，并称重。浸泡时间12～24小时，浸泡期间应注意经常振摇。取浸泡后的溶液测定有效成分。

冷浸法样品的提取第一节含量测定样品的处理

当前第10页\共有119页\编于星期三\11点浸泡提取法中供试品的制备方式1.部分测定法（等量法）：即将浸泡后的溶液，用适宜滤器滤过，精密量取一定体积，进行测定注：此法不适宜挥发性较大的提取溶剂冷浸法样品的提取第一节含量测定样品的处理

当前第11页\共有119页\编于星期三\11点2.全部测定法（即总量测定法）：将浸泡后的溶液滤过，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，进行测定注意：转移完全冷浸法样品的提取第一节含量测定样品的处理

灵宝护心丹（牛黄、麝香等）中胆酸的含量测定

取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚（60-90℃）4ml，浸泡1小时，滤过，滤渣及滤纸挥去溶剂，放回锥形瓶中，精密加入冰醋酸无水乙醇溶液（1→10）15ml，摇匀，密塞，称定重量，浸泡12小时，再称定重量，用冰醋酸无水乙醇溶液（1→10）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。当前第12页\共有119页\编于星期三\11点特点优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少缺点：费时（12-24h）、费溶剂（10-50倍）冷浸法样品的提取第一节含量测定样品的处理

当前第13页\共有119页\编于星期三\11点将冷浸法中的带塞容器换成回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取，其余操作方法同冷浸法。万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定在HCl-70%乙醇溶液，加热回流1h回流提取法样品的提取第一节含量测定样品的处理

当前第14页\共有119页\编于星期三\11点回流提取法样品的提取第一节含量测定样品的处理

1、提取效率高于冷浸法；

2、每次提取时间为0.5～2小时，直至提取

完全为止。

1、提取杂质较多；

2、不适于对热不稳定或具有挥发性的成分。优点缺点当前第15页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品置索氏提取器中，利用遇热可以挥发的溶剂进行反复提取（相当于总是在使用新鲜溶剂提取），一般提取数小时方可完全。保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定+甲醇，加热回流至提取液无色为止连续回流提取法样品的提取当前第16页\共有119页\编于星期三\11点优点：1）无需过滤，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶剂，再用适宜溶剂溶解，定容，进行测定。2）提取效率高，所需溶剂少，提取杂质少。缺点：受热易分解的成分不宜使用。第一节含量测定样品的处理

连续回流提取法样品的提取当前第17页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品置适当的容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器（超声波清洗器）中进行提取。一般样品30分钟内即可完成，最多不超过1小时。保济丸（厚朴等）中厚朴酚测定+石油醚（30-60℃），超声处理（功率500W，频率33kHz）2次，每次30min超声提取法样品的提取当前第18页\共有119页\编于星期三\11点优点：超声提取能使样品粉末更好地分散于溶剂中提高提取效率和提取速度。（超声的助溶作用）缺点：促使化学反应发生（如氧化还原反应、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。

※注明超声波的频率、功率，以保证重现性第一节含量测定样品的处理

超声提取法样品的提取当前第19页\共有119页\编于星期三\11点以超临界流体作溶剂的样品提取新技术。当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态超临界流体——特殊的物质状态密度~液体→溶解能力强粘度~气体→传质快，有利于待测组分的扩散表面张力几乎为0→渗透性好密度受压力、温度的影响大→改变对溶质的溶解能力第一节含量测定样品的处理

超临界流体萃取法（SFE）样品的提取当前第20页\共有119页\编于星期三\11点最常用的SF是CO2，它的性质稳定，使用安全，价格低廉，临界点低（Tc=31℃和Pc=7.4MPa），易于操作。加入甲醇、氯仿、苯等改变极性→提取不同极性的成分第一节含量测定样品的处理

超临界流体萃取法（SFE）样品的提取当前第21页\共有119页\编于星期三\11点SFE具有优点：速度快萃取效率高、选择性较高、节省溶剂、可避免使用易燃，有毒的有机溶剂

SFE不仅常用于热不稳定成分或挥发性成分的萃取，而且也越来越多地用于热稳定性成分的萃取。缺点：对设备要求高。第一节含量测定样品的处理

超临界流体萃取法（SFE）样品的提取当前第22页\共有119页\编于星期三\11点沉淀法蒸馏法液-液萃取法

A直接萃取法

B离子对萃取法色谱法消化法

关键——保留有效成分第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化原则：从提取液中除去对测定有干扰的杂质，而又不损失被测定成分依据：被测定成分和杂质在理化性质上的差异，结合测定方法的要求当前第23页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化沉淀法原理：它是基于某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液以得到精制的方法。这种方法须注意：

1）过量的试剂若干扰被测组分的测定，则应设法除去；

2）大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分不应产生共沉淀而损失；

3）被测组分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。

当前第24页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化蒸馏法原理：利用某些被测成分具有挥发性,收集馏出液进行含量测定.目前以水蒸气蒸馏法应用较多。

1）可分为共水蒸馏法（即直接加热法）、通水蒸汽蒸馏法和水上蒸馏法。如中药制剂中的挥发油，某些小分子生物碱（麻黄碱、槟榔碱）及丹皮酚等，都可用蒸馏法提取和分离净化。

2）为了使挥发性成分更完全地蒸馏出来，有时也可用盐析作用，即在蒸馏液中加入一定量的无机盐，常用NaCl、NaSO4、MgSO4等。例六味地黄颗粒中丹皮酚含量测定

取本品约2g，研细，精密称定，用水蒸汽蒸馏，收集馏出液约450ml，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度。…274nm波长处测定吸收度…。当前第25页\共有119页\编于星期三\11点直接萃取法原理：利用试样中被测成分与干扰成分在有机溶剂中的溶解度不同，通过多次萃取来达到分离净化的目的。萃取剂的选择如苯、氯仿或乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）调整水相酸度，提取有机酸、有机碱(非离子化)第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化液－液萃取法常用的是有机溶剂直接萃取法和离子对萃取法。当前第26页\共有119页\编于星期三\11点BH+（水相）+In-(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有机相）

适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取（生物碱）水相酸度的控制离子对试剂的选择离子对萃取法原理：在适当pH中，某些有机酸（碱）性物质形成的离子与带相反电荷的离子定量地结合成为弱极性的离子对，易溶于有机溶剂，使之萃取分离。第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化液－液萃取法溴百里酚蓝溴甲酚绿当前第27页\共有119页\编于星期三\11点分离的原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱微柱色谱，也称固相萃取或液—固萃取（LSE）柱的大小：长5～15cm，内径0.5～1cm第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法当目标物与填料极性相似时，样品流过柱后，目标物在填料上有较好的保留，而极性与填料相差较远的杂质直接流出，再用适当洗脱液把目标物洗脱、收集，分析；或使杂质保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。当前第28页\共有119页\编于星期三\11点中药制剂教研室当前第29页\共有119页\编于星期三\11点硅胶、氧化铝键合相硅胶大孔树脂聚酰胺硅藻土、纤维素离子交换树脂

第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——柱色谱常用的填料

当前第30页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——硅胶、氧化铝

硅胶作用机制：溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。非极性或极性低的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。特点：通常适于酸性和中性物质的分离；如分离碱性物质，可在展开剂中加入少量稀碱。当前第31页\共有119页\编于星期三\11点如测定益母草浸膏中总生物碱含量时，使用中性氧化铝柱，以乙醇洗脱生物碱，黄酮类成分则保留在柱上。第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——硅胶、氧化铝

氧化铝分离机制：溶质在吸附剂表面的极性吸附作用碱性氧化铝适于碱性和中性物质的分离酸性氧化铝适于分析酸性和中性物质中性氧化铝能将黄酮类成份吸附在柱上，可用于生物碱、苷的分离。当前第32页\共有119页\编于星期三\11点八宝坤顺丸中国药典2005年版一部，P311

对照品溶液的制备

取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30ug的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取重量差异项下的本品，剪碎，取约2g，精密称定，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，通过中性氧化铝柱（100~200目，2g，内径1cm，用50%甲醇湿法装柱），收集至50ml量瓶中，再用50%甲醇洗脱，收集洗脱液至近刻度，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10ul与供试品溶液10~15ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每丸含白芍以芍药苷计，不得少于2.6mg。当前第33页\共有119页\编于星期三\11点中药制剂教研室当前第34页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——键合相硅胶

借助化学反应方法将固定液的官能团键合在硅胶的表面而构成键合相硅胶。有机硅烷与硅胶表面化学键合反应，形成的-Si-O-Si-C-键是对溶剂、热和化学稳定的结构。常用的有十八烷基键合相键合相硅胶（简称C18或ODS）当前第35页\共有119页\编于星期三\11点当前第36页\共有119页\编于星期三\11点

第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——大孔树脂极性大孔树脂：为丙稀酰胺聚合物，对极性化合物有相对强的吸附力非极性大孔树脂：为苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，对非极性水溶性成分有吸附力特点：表面积大，传质速率较高，具有不同的极性及适于吸附较大分子测定复方归芪剂中的黄芪甲苷用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用30%乙醇洗脱黄芪甲苷。当前第37页\共有119页\编于星期三\11点

第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——聚酰胺机制：主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上聚酰胺柱，水洗去部分杂质，以95%乙醇洗脱总黄酮后测定。

当前第38页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——硅藻土、纤维素

亲水性填料机制：分配作用应用：多以水基质液为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被洗脱。萃取率较高（一般大于80%），无浓集作用，但洗脱剂用量较大（一般大于5ml）当前第39页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——离子交换树脂

特点：可除去样品中的离子，防止组分分解，用于萃取样品液中可解离化合物弱酸性药物：中性和碱性条件下用阴离子交换树脂柱，水及有机溶剂洗脱后，酸性溶液洗目标成分当前第40页\共有119页\编于星期三\11点例益母草流浸膏中盐酸水苏碱的鉴别取本品10ml，水浴蒸干，残渣加水10ml使溶解，加稀盐酸调节pH值至1～2，…加在强酸性阳离子交换树脂柱（732Na-型，内径0.9cm，柱长12cm）上，以水洗至流出液近无色，弃去水液，再以2mol/L氨溶液40ml洗脱，收集洗脱液…作为供试品溶液。离子型化合物第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化色谱法——离子交换树脂

当前第41页\共有119页\编于星期三\11点湿化消化——强酸腐蚀

A硝酸—高氯酸法

B硝酸—硫酸法

C硫酸-硫酸盐法干法消化——高温炽灼测定中药制剂中的无机元素第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化消化法当前第42页\共有119页\编于星期三\11点硝酸-高氯酸法：适用于血、尿、生物组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机离子均为高价态离子，对含氮杂环类有机物破坏不够完全。硝酸-硫酸法：适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态。与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采用此法。硫酸-硫酸盐法：经本法破坏所得金属离子，多为低价态。常用于含砷或锑的有机样品的破坏。

第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化消化法——湿法消化法

当前第43页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化消化法——干法消化法

将有机物灼烧灰化以达分解的目的，本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机样品的破坏。

将适量样品置于坩锅中，常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。

当前第44页\共有119页\编于星期三\11点第一节含量测定样品的处理

样品的分离净化消化法——干法消化法

应用本法时要注意以下几个问题：

1）灼烧温度在420℃以下，以免某些被测金属化合物的挥发。

2）检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。

3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。当前第45页\共有119页\编于星期三\11点第二节含量测定方法的验证分析方法验证的目的

是证明采用的方法适合于相应的检测要求。需验证的分析项目

鉴别试验、杂质检查、原料药及制剂中有效成分含量测定及其它成分测定验证内容

准确度、精密度、专属性、线性、范围、耐用性、检测限、定量限、当前第46页\共有119页\编于星期三\11点指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。用回收率（%）表示。方法：回收试验法

加样回收试验法

第二节含量测定方法的验证准确度（accuracy）当前第47页\共有119页\编于星期三\11点空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。回收试验（化学药品）第二节含量测定方法的验证准确度（accuracy）当前第48页\共有119页\编于星期三\11点

已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M加样回收试验（中药）第二节含量测定方法的验证准确度（accuracy）当前第49页\共有119页\编于星期三\11点规定的范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9次测定结果评价

数据要求第二节含量测定方法的验证准确度（accuracy）当前第50页\共有119页\编于星期三\11点编号取样量（ml）原有量（µg）加入量（µg）测得量（µg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）高13134.1137.808277.422104.0199.022.97高23134.1137.808266.54196.11高33134.1137.808273.726101.32中1289.491.868180.06698.69中2289.491.868182.147100.96中3289.491.868177.55495.96低1144.745.93489.61297.78低2144.745.93488.56695.50低3144.745.93491.039100.88中间浓度加入量与供试品含量控制在1：1一般要求在95～105%范围内RSD一般在3%以内准确度应在规定的标准曲线线性范围内建立。当前第51页\共有119页\编于星期三\11点测定次数取样量（g）制剂中淫羊藿苷量(mg)加入淫羊藿苷量(mg)测得淫羊藿苷量(mg)回收率(%)

RSD%10.10981.79641.30883.084298.401.9%20.10131.65741.30882.959899.5130.09851.61071.63603.184296.1840.10711.75131.63603.4238102.2350.10221.67121.96323.630798.8160.09861.61231.96323.529498.65回收率(%)=测得淫羊藿苷量(mg)－制剂中淫羊藿苷量(mg)×100%

加入淫羊藿苷量(mg)例：取已知含量的样品(16.361mg/g)6份，每份约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，每份依次精密加入淫羊藿苷对照品溶液(0.3272mg/ml)4、4、5、5、6、6ml，再加甲醇至100ml，照拟定的供试品制备方法制备加样回收供试品溶液，精密吸取10µl注入色谱仪中，测定峰面积，按下式计算回收率，结果见下表。

当前第52页\共有119页\编于星期三\11点系指在规定测试条件下，同一均匀供试品，经多样取样测定所得结果之间接近的程度。精密度是考察分析方法在不同的时间、操作人员、实验室，所获得结果之间的重现性和重复性。在药物分析中，常用相对标准差（RSD）表示。第二节含量测定方法的验证精密度（precision）当前第53页\共有119页\编于星期三\11点偏差（d）：测量值与平均值之差标准偏差（SD）相对标准偏差（RSD）也称变异系数（CV）第二节含量测定方法的验证精密度（precision）当前第54页\共有119页\编于星期三\11点重复性(repeatability)中间精密度（mid-precision)重现性(reproducibility)第二节含量测定方法的验证精密度（precision）当前第55页\共有119页\编于星期三\11点定义：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。要求：在规定的范围内，取同一浓度的供试品，至少测6次进行评价或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9次测定结果评价重复性第二节含量测定方法的验证精密度（precision）当前第56页\共有119页\编于星期三\11点编号取样量（ml）峰面积平均峰面积测得量（µg）含量(µg/ml)平均值(µg/ml)RSD(%)14.00894.21088898.50323896.357055182.09345.5244.701.0924.00867.93341867.21960867.576505176.24644.0634.00876.81049878.23889877.52469178.26744.5744.00885.51129883.42120884.466245179.67844.9254.00879.37677877.07513878.22595178.41044.664.00875.81073877.34985876.58029178.07644.52取同一批号（20100701）的本品4ml，精密量取，平行取6份，依法制成供试品溶液，分别量取20μl各供试品溶液及对照品溶液注入液相色谱仪测定，计算欧前胡素含量及相对标准偏差，结果见表，表明方法重复性好。当前第57页\共有119页\编于星期三\11点

同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。

不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。

已有重现性验证，不需验证中间精密度重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做中间精密度重现性第二节含量测定方法的验证精密度（precision）当前第58页\共有119页\编于星期三\11点实验次数峰面积值平均峰面积值RSD（%）1296661295841.20.242295460329538242951175296586例精密吸取淫羊藿苷对照品液(23.2μg/ml)10µl注入液相色谱仪，连续进样5次，测得淫羊藿苷峰面积的相对标准偏差，结果见下表。当前第59页\共有119页\编于星期三\11点指在其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力；指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。常用阴性对照法。第二节含量测定方法的验证专属性（specificity）当前第60页\共有119页\编于星期三\11点A:阴性对照溶液色谱图；B:欧前胡素对照品溶液色谱图；C:供试品溶液色谱图第二节含量测定方法的验证专属性（specificity）当前第61页\共有119页\编于星期三\11点第二节含量测定方法的验证线性(linearity)与范围(range)

设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线性的含义范围的含义指达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间，表示：mg/L~mg/L当前第62页\共有119页\编于星期三\11点第二节含量测定方法的验证线性(linearity)与范围(range)考察方法线性与范围可通过绘制标准曲线来确定。n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r≥0.999确定样品浓度与峰面积/峰高是否呈线性关系

确定线性的范围

直线是否通过原点目的当前第63页\共有119页\编于星期三\11点qqμg)峰面积均值0.08106201.02885201.0119200.994900.24318605.17249609.8347614.496890.32424805.34619804.7837804.221250.486361211.549191211.23081210.912350.648481617.023321614.73281612.442380.810602006.691772006.55982006.42786第二节含量测定方法的验证线性(linearity)与范围(range)当前第64页\共有119页\编于星期三\11点对照品进样量（μg）0.09280.18560.27840.37120.464色谱峰面积126195238932366405482771603967Y=1292438.5776X+3839.1000r=0.9998样品进样量在0.0928～0.464μg范围内，淫羊藿苷峰面积与进样量呈现良好的线性关系。例：精密吸取淫羊藿苷对照品溶液(0.0464mg/ml)2、4、6、8、10µl注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件进行测定，记录峰面积，测定结果下表。当前第65页\共有119页\编于星期三\11点指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。如果条件要求苛刻，应在方法中写明第二节含量测定方法的验证耐用性（robustness）变动因素：测试液的稳定性、样品提取次数、时间液相色谱法：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类色谱柱、柱温，流速等。GC法：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体及柱温、进样口和检测器温度等TLC法：吸附剂或薄层板的型号和厂牌，展开温度、湿度等当前第66页\共有119页\编于星期三\11点柱温变动的影响样品不同柱温条件下峰面积相对标准偏差%35℃25℃对照品535.3740(32h)541.07400.6892537.1292(32h)541.9327供试品883.9976(32h)889.91310.2190887.3354(32h)886.9148耐用性（robustness）第二节含量测定方法的验证当前第67页\共有119页\编于星期三\11点流动相组成比例变化的影响样品不同流动相组成条件下峰面积相对标准偏差%63:3755:45供试品885.8881（0h）863.01731.7307%886.3683（0h）866.3838耐用性（robustness）第二节含量测定方法的验证当前第68页\共有119页\编于星期三\11点色谱柱的影响样品不同色谱柱条件下峰面积相对标准偏差%色谱柱1色谱柱2对照品541.4097(40h)543.59810.3096542.4932(48h)545.0605供试品894.3388(40h)904.46230.4719898.0939(48h)899.9722耐用性（robustness）第二节含量测定方法的验证当前第69页\共有119页\编于星期三\11点流动相流速的影响样品不同流速条件下峰面积相对标准偏差%1.0ml/min*0.8ml/min对照品541.0740675.9177915.54541.9327674.57849供试品889.91311106.6318415.83886.91481118.04224供试品（µg/ml）44.3344.510.287耐用性（robustness）第二节含量测定方法的验证当前第70页\共有119页\编于星期三\11点定义指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。要求是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。检测限（limitofdetection，LOD）第二节含量测定方法的验证当前第71页\共有119页\编于星期三\11点确定LOD方法1.直观法：用一系列已知浓度的供试品进行分析，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量2.信噪比法：把已知低浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限检测限（limitofdetection，LOD）第二节含量测定方法的验证当前第72页\共有119页\编于星期三\11点是指在保证具有一定准确度和精密度的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低量。

常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。定量限（limitofquantitation,LOQ）第二节含量测定方法的验证当前第73页\共有119页\编于星期三\11点当前第74页\共有119页\编于星期三\11点

方法总数修订新增删除

HPLC339302820TLC3231212GC233190

分光光度法18039

滴定法13030

重量法5011

氮测定法5110

挥发油测定法3001

浸出物测定法13121

总计4563732723仪器分析法化学分析法HPLC475GC35UV-vis41TLCS49化学法51其它41第三节常用定量分析方法当前第75页\共有119页\编于星期三\11点化学分析法可见-紫外分光光度法薄层扫描法气相色谱法高效液相色谱法荧光分析法原子吸收分光光度法第三节常用定量分析方法当前第76页\共有119页\编于星期三\11点

化学分析法所用仪器简单，结果准确。主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。包括重量分析和滴定分析第三节常用定量分析方法化学分析法当前第77页\共有119页\编于星期三\11点重量分析法挥发法萃取法沉淀法挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分的含量。如：①供试品的干燥失重测定；②水分测定均属挥发法；③中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。第三节常用定量分析方法化学分析法当前第78页\共有119页\编于星期三\11点萃取法根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如2000年版药典收载的冰硼散测定冰片的含量：取本品约2.5g，精密称定，置离心管中，用无水乙醚提取3次(6ml、3ml、2ml），每次用细玻璃棒搅拌，置离心机中，离心（每分钟转速为3000转）约5分钟，合并上清液，置已称定重量的蒸发皿中，在15～25℃放置1小时，称定重量，即得。第三节常用定量分析方法化学分析法重量分析法当前第79页\共有119页\编于星期三\11点沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法。如西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定：

取本品60片，精密称定，研细，混匀，取约18g，精密称定，加水150ml，振摇10分钟，离心，滤过，沉淀物用水50ml分三次洗涤，离心，滤过，合并滤液，加盐酸1ml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加入热氯化钡试液使沉淀完全，置水浴上加热30分钟，静置1小时，用无灰滤纸或已称定重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒重，精密称定，与0.6086相乘，计算即得。第三节常用定量分析方法化学分析法重量分析法当前第80页\共有119页\编于星期三\11点滴定分析法酸碱滴定法沉淀滴定法配位滴定法氧化还原滴定法第三节常用定量分析方法化学分析法当前第81页\共有119页\编于星期三\11点酸碱滴定法适用于测定中药制剂中所含的生物碱、有机酸、内酯类组分的含量。对于K·C>10-8酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。对于K·C<10-8的弱有机酸、生物碱或水中溶解度很小的酸碱，只能采用间接滴定或非水滴定法测定。

第三节常用定量分析方法化学分析法滴定分析法当前第82页\共有119页\编于星期三\11点例：颠茄酊中生物碱的含量测定精密量取本品100ml，置蒸发皿中，在水浴上蒸发至约10ml，移至分液漏斗中，蒸发皿用0.1mol/L硫酸溶液10ml分次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用氯仿分次振摇，每次10ml，至氯仿层无色，合并氯仿液，用0.1mol/L硫酸溶液10ml振摇洗涤，洗液并入酸液中，加过量的浓氨试液使呈碱性，迅速用氯仿分次振摇提取，至生物碱提尽。每次得到的氯仿液均用同一水10mL洗涤，弃去水液，合并氯仿液，蒸干，加乙醇3ml，蒸干，并在80℃干燥2小时，残渣加氯仿2ml使溶解，精密加硫酸滴定液（0.01mol/l）20ml，置水浴上加热，除去氯仿，放冷，加甲基红指示液1～2滴，用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴定。每1

ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于5.788mg的莨菪碱。当前第83页\共有119页\编于星期三\11点沉淀滴定法银量法适用于测定中药中无机卤化物、有机氢卤酸盐及有机卤化物四苯硼钠法适用于测定生物碱的含量亚铁氰化钾法

第三节常用定量分析方法化学分析法滴定分析法当前第84页\共有119页\编于星期三\11点配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸铵法。用以测定鞣质、生物碱及含Ca+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。如①万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；②牛黄解毒片中石膏的测定。氧化还原滴定法用于测定氧化还原性物质，酚类、糖类、含Fe、As的中药制剂。如①磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；②牛黄解毒片中雄黄的测定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的测定。第三节常用定量分析方法化学分析法滴定分析法当前第85页\共有119页\编于星期三\11点该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法,具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。该法要求被测成分本身或其显色产物对可见－紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。

第三节常用定量分析方法可见-紫外分光光度法当前第86页\共有119页\编于星期三\11点单波长光度法

特点：选择被测成分的λmax为测定波长，而共存组分在此波长处基本无吸收吸收系数法对照品比较法标准曲线法

第三节常用定量分析方法可见-紫外分光光度法当前第87页\共有119页\编于星期三\11点分类方法特点吸收系数法测定所配供试品溶液在规定波长的吸收度，根据被测成分的吸收系数（E1%1cm）计算其含量①对仪器要求高，注意仪器波长、空白吸收的校正，吸收度准确度的检定和杂散光的检查②无需对照品，方法简便对照品比较法在同样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成分的量应为后者中被测成分的量的100%±10%，用规定波测定二者的吸收度，则可计算出供试品中被测成分的浓度或含量对仪器要求较高标准曲线法配制一系列不同浓度的对照品溶液（常为5个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制A-C曲线，或求出其回归直线方程。在相同条件下，测定供试品溶液的吸收度，就可求得供试品中被测成分的浓度或含量。①本法对仪器的精度要求不高，有时标准曲线不通过原点，只要重现性好也可使用②该法在比色法中最常用当前第88页\共有119页\编于星期三\11点例：华山参片中莨菪碱的含量测定对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的硫酸阿托品，加水制成每1ml相当于含莨菪碱7μg的溶液，即得供试品溶液的制备取本品40片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量，置具塞锥形瓶内，精密加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（PH4.0）25ml，振摇5分钟，放置过夜，用干燥滤纸滤过，取续滤液，即得测定法精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml，分别置分液漏斗中，各精密加枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（PH4.0）10ml，再精密加入用上述缓冲液配制的0.04%溴甲酚绿溶液2ml，摇匀，用10ml氯仿振摇提取5分钟，待溶液完全分层后，分取氯仿液，用氯仿湿润的滤纸滤入25ml量瓶中，再用氯仿提取3次，每次5ml，依次滤入量瓶中，并用氯仿洗涤滤纸，滤入量瓶中，加氯仿至刻度。照分光光度法（附录ⅤB）分别在415nm的波长处测定吸收度，计算，即得当前第89页\共有119页\编于星期三\11点供试品溶液中若有多种组分共存，可通过测定多波长处的吸收度，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。包括双波长法（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。第三节常用定量分析方法可见-紫外分光光度法多波长光度法当前第90页\共有119页\编于星期三\11点第三节常用定量分析方法可见-紫外分光光度法多波长光度法——等吸收点法

设a、b分别为干扰组分和被测组分，λ2为测定波长（λS），λ1为参比波长（λR）。①选择λ1和λ2的两个基本条件：（i）a在λ1和λ2处应具有相同的吸收度，即ΔAa=Aaλ2-Aaλ1=0，以便消除a的干扰。（ii）b的ΔAb=Abλ2-Abλ1应足够大，以便提高测定的灵敏度和准确度。通常λ2选在b的λmax附近。

②定量公式△A

=△Aa

+

△Ab

=

△Ab

=（Ebλ2

-

Ebλ1

）·

L

·

Cb

=

K

Cb

即△A与Cb成线性关系，而与干扰组分浓度无关当前第91页\共有119页\编于星期三\11点样品经薄层分离后，用一定波长的光扫描吸收紫外可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，用薄层色谱扫描仪（光密度计）测量被斑点反射或斑点发射的光束强度的变化而定量，可用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。第三节常用定量分析方法薄层扫描法当前第92页\共有119页\编于星期三\11点薄层吸收扫描法第三节常用定量分析方法薄层扫描法用钨灯或氘灯为光源在波长为200～800nm范围内选择合适波长进行测定。Beer定律Kubelka-Munk理论散射参数（SX）SX=0（即薄层固定相无散射作用）时，A与KX呈线性关系，服从Beer定律。SX>0时，透射法的A值随着SX增大而增大，而反射法的A值随SX的增大而减小。薄层板的散射现象当前第93页\共有119页\编于星期三\11点用于定量分析时需对曲线进行处理：曲线较直法：岛津CS系列采用该法。该法特点：需知SX值，根据SX值，将Kubelka-Munk曲线校正为直线。计算机回归法：Camag仪器采用该法。由计算机根据最小二乘法原理对标准品测定值进行相关分析，得到最佳回归方程。不需要SX值。

薄层吸收扫描法第三节常用定量分析方法薄层扫描法当前第94页\共有119页\编于星期三\11点薄层荧光扫描法第三节常用定量分析方法薄层扫描法基本原理：F=KC

光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到10～50pg。适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。

Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。当前第95页\共有119页\编于星期三\11点考察内容：标准曲线考察分离度考察重复性考察准确度考察第三节常用定量分析方法薄层扫描法新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性。当前第96页\共有119页\编于星期三\11点第三节常用定量分析方法薄层扫描法适于用Kubelka-Munk曲线校直法进行定量校准的仪器①检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校为直线，否则，调整SX值再校正，直至工作曲线成直线为止。②考察工作曲线是否过原点，以确定采用一点法或二点法定量。③确定点样量的线性范围。即使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。当前第97页\共有119页\编于星期三\11点第三节常用定量分析方法薄层扫描法定量峰与相邻峰之间较好分离，分离度（R）应大于1.0按拟定的含量测定方法，对同一批样品进行多次测定（平行试验至少6次以上），计算相对标准差，RSD应不大于3%。

至少需要6次试验，在供试品中加入纯品，测定其含量。

加样回收率要求在95%～105%之间。当前第98页\共有119页\编于星期三\11点回归曲线法内标法外标法外标一点法外标两点法第三节常用定量分析方法薄层扫描法当前第99页\共有119页\编于星期三\11点①外标一点法工作曲线通过原点时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=F1·A式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F1为直线的斜率。第三节常用定量分析方法薄层扫描法薄层色谱扫描最常用的定量方法当前第100页\共有119页\编于星期三\11点②外标二点法工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为：C=F1A+F2

式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。

第三节常用定量分析方法薄层扫描法当前第101页\共有119页\编于星期三\11点注意事项：点样量必须准确宜用定量毛细管点样。采用随行标准法，即供试品与标准品交叉点在同一板上；为减小误差同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个；调整供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；第三节常用定量分析方法薄层扫描法外标两点法外标一点法当前第102页\共有119页\编于星期三\11点应用范围：主要用于测定含挥发油及其他挥发性组分的含量。气相进样量小第三节常用定量分析方法气相色谱法理论塔板数n：对柱效高低的评价指标，n高，则柱效高，分离效果好。理论塔板数低于规定值，则要考虑更换色谱柱。速率理论：说明色谱柱、载气、柱温等对柱效的影响。分离度R：R≥1.5时，表明两峰完全分离。系统适应性实验：理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子等。实验条件的选择：固定相、柱温、载气等。定量分析方法：归于化法、外标法、内标法。当前第103页\共有119页\编于星期三\11点优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来的定量分析误差。缺点：样品的配制麻烦，选择化学结构、物理性质与待测组分相似的纯品作为内标物不易寻找。气相色谱法第三节常用定量分析方法内标法内标物的选择原则：①应是样品中不存在的纯物质。②加入量应接近于被测成分。③其色谱峰应位于被测成分色谱峰附近且与之完全分离。

当前第104页\共有119页\编于星期三\11点同一检测器对不同物质具有不同的响应值，故不能用峰面积直接计算的被测成分的含量，要引入校正因子（f）。药典中采用的是相对重量校正因子（fw）.即被测成分单位峰面积所相当的物质量（Mi/Ai）是内标物单位峰面积所相当的物质量（Ms/As）的多少倍。

Mi/Aifw=Ms/As内标法加校正因子气相色谱法第三节常用定量分析方法内标法AsCi

=

f

CsAi校正因子经常不知，可采用药典方法测定校正因子再用内标法.当前第105页\共有119页\编于星期三\11点

课间习题：十滴水软胶囊中樟脑含量的测定

本品由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中药制成，樟脑是其主成分之一，具升华性，故采用气相色谱法，以樟脑为对照品，薄荷脑为内标物，对其进行含量测定。

色谱条件与系统适用性试验

以聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温150℃。理论塔板数按樟脑峰计算应不低于2000，樟脑峰与内标物质峰的分离度应大于2。

校正因子测定

精密称取樟脑对照品（r）50mg，置10ml量瓶中，精密加入薄荷脑内标物质(s)50mg，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取1～2μl，注入气相色谱仪，Ar=211948、As=215835，计算校正因子（保留四位有效数字）。当前第106页\共有119页\编于星期三\11点测定法

取装量差异项下的内容物，混匀，取0.8g，精密称定0.7956g，置具塞试管中，用无水乙醇提取5次，每次4ml，分取乙醇提取液，合并，转移至25ml量瓶中，精密加入薄荷脑125mg，使溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(i＋s)。精密量取1～2μl，注入气相色谱仪测定，Ai＝108685、As＝123544，计算即得（保留两位有效数字)。解答问题①本法属于气液分配GC还是气固吸附GC？②采用的是外标法还是内标法？

③求算樟脑的含量。(药典规定，本品每粒含樟脑不得少于53mg。)课间习题：十滴水软胶囊中樟脑含量的测定当前第107页\共有119页\编于星期三\11点解：求算校正因子（f）

f=

(As

/

AR)(MR/Ms)=

(215835

/211948)

/

(50mg

/

50mg)

＝

1.108求算供试液中樟脑的浓度Ci（mg/ml）Ci

=f

Cs

=

1.108X

X5

mg/ml

=

6.30mg/mlAsAi123544108685课间习题：十滴水软胶囊中樟脑含量的测定当前第108页\共有119页\编于星期三\11点应用范围：适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。实验条件的选择：色谱柱的选择、洗脱方式的选择、检测器的选择、HPLC前处理色谱柱的选择：反相色谱柱、正相色谱柱、离子对色谱柱

第三节常用定量分析方法高效液相色谱法当前第109页\共有119页\编于星期三\11点定量分析方法外标法内加法

第三节常用定量分析方法高效液相色谱法当前第110页\共有119页\编于星期三\11点

课间习题.牛黄解毒片中黄芩的含量测定

本品由牛黄、大黄、黄芩、冰片、石膏等八味中药制成。中国药典以黄芩苷为指标，采用HPLC测定其中黄芩的含量。

（1）色谱条件与系统适应性试验

固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），流速1ml/min；检测器：紫外检测器，检测波长为315nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。

（2）对照品溶液制备

精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，以甲醇溶解配成每1ml中含31.2µg的对照品溶液。当前第111页\共有119页\编于星期三\11点

（3）供试品溶液制备

取牛黄解毒片20片，剥去糖衣，精密称定6