第八章 分子育种

第八章分子育种一、分子育种的概念与程序概念

按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组技术和DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系，亦即基因工程。2.植物基因工程

植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。3.基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离重组子的检测4.观赏植物基因工程的目的基因1、观赏性开花、花色、花型、花径相关基因。2、抗逆性抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因3、切花寿命4、花期调控二、基本技术及原理（一）DNA重组技术将外源DNA片段与载体分子连接，形成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。DNA

重

组

技

术（二）基因工程的基本概念1.转化（Transformation)：是指将外源DNA导入受体细胞的过程。2.复制子（Replicon)：具有一个复制起点(ori)的DNA分子称为一个复制子。3.载体（Vector）：能与外源DNA连接并实现转化的复制子。4.重组子（Recombinant）：连接了外源DNA分子的复制子。（三）基因工程的工具酶限制性内切酶（restrictionendonuclease)DNA连接酶（ligase)末端修饰酶（五）基因工程的载体系统1、质粒载体2、噬菌体载体3、病毒载体质粒图谱及质粒构建启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子

（标记基因）

目的片段选择标记

载体(六)植物基因工程的报告基因定义特点在选择培养基上生长报告基因与目的基因嵌和表达研究调控区报告基因的种类新霉素磷酸转移酶（Neomycinephosphotransferase–II,NPTII)基因氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因潮霉素磷酸转移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hpt）基因β–

葡萄糖酸苷酶（β–Glucuronidase,GUS）基因荧光素酶（Luceferase,Luc）基因抗除草剂（Basta,Bar）基因三、转基因操作的方法(一)外源DN秘A导入段植物奏细胞歪的方帮法载体尊介导渗的转库化方谱法DN争A直接桶导入额法种质盼系统狠法外源DN悉A导入各植物必细胞约的方架法1、致可癌农牺杆菌讽介导胶的Ti质粒脂载体给转化植法2、病竟毒介衬导的肠基因旗转移3、基绿因枪疑介导孕的基木因转告化4、PE撤G诱导循的基烂因转撇化5、脂龄质体跨介导6、电总激法弃介导7、超紧声波焰介导8、显茫微注罩射9、激察光微租束10、种王质系追统介番导基势因转剧化法1、致癌兆农杆岩菌介滤导的Ti质粒压载体低转化管法含有Ti质粒皂的致权癌农贿杆菌殖与一字些植谣物的涂细胞赴接触障后，Ti质粒纺的一夜部分染（T-侵DN汇A）可稿以导眼入植丝式物细芳胞，叙整和袖到植汉物基滔因组DN离A随其揪复制御。根益据这招一特茧性可需构建在一系贿列Ti质粒缝载体拆，述与含车目的随片段痕的DN并A片段嘴重组折，导狱入致恢癌农板杆菌菠，再果采用盆叶盘俘法、砌原生广质体毯培养邻法、吵细胞既培养逆法，典通过椒致癌斤农杆勒菌介返导进令入植颠物细漂胞。根瘤埋农杆陕菌及Ti质粒Ti质粒根瘤格农杆汇菌染屡色体俭外的奸遗传峰物质晚，为津共价量闭合爹环状维的DN渔A分子天。Ti质粒碗的功抚能为农董杆菌歌提供尼附着攀于植鉴物细管胞壁蛛的能荣力；参与仰寄主绍细胞猛合成串激素讯的能腾力；诱发舍植物涛产生沃冠瘿轿瘤；赋予扫寄主呈分解扁冠瘿担碱的闹能力悟；决定碎寄主智范围禁。Ti质粒细的结茂构T-眉DN私A区Vi喝r区Co逮n区Or扣i区Vi劫r区LBRBETi放P急la户sm织idT-母DN辽A区Or牌i区Co爱n区Vi肌r区操勒纵子胆的基荡因结唤构与缴功能Vi蒜r区是巷一段碍长度造为35毕KB操纵归子包含稻六个叶基因罪：Vi爪rA、Vi重rB、Vi浑rC、Vi跳rD、Vi拳rE、Vi雾rG。核心区左边界右边界T-析DN梯A的结难构与透功能拴∶LBRBLBRB植物赞遗传泰转化坦的载邀体系半统一元监载体怀（顺之势载功体）双元届载体冒（反刑式载站体）农杆画菌介裹导的箭转化促质粒摇的构济建P驰G2纵T贼NO详SAm班prP侧G1针T目的基因报告基因，选择标记基因Vi围r区目的基因报告基因，选择标记基因LBRB农杆始菌导膜入方草法共培厅养法叶盘侧转化出法整株陪感染冈法原生化质体鼓共培正养法2、基瞒因枪汪介导钞的转葡基因下操作基本踢原理操作帐步骤优点影响项转化究效率冬的因钱素Bi笑o-谷Ra构dBi馅ol脖is好ti靠c两DS稿-1音00吐0/增He烦a警nd烤H扶ep沉ta削S胳ys阿te辅mBi坟o-撒Ra会dBi智ol端is孙ti贷c跟DS毛-1翅00真0/锁He遗a素nd括H街ep膊ta碗S鸣ys林te瓦m操作缺步骤预培非养转基极因操奴作转基匆因植茂株筛钟选和品培养转基云因植液株的极鉴定田间义释放影响动转化漠效率交的因兼素金属纱微粒DN参A沉淀剪辅助植剂DN详A纯度拌和浓丹度微弹邀速度植物钟材料基因菜枪法裙的优艰点无宿丈主限西制；靶受笋体类么型广鼓泛；可控斧度高宜；操作骄简便隐。问题叼：转化新效率门低；嵌合毯体多托；稳定蛙性差言，瞬雕时表渗达；外源谊基因宿沉默展；整合帅机理液不详膝。3、PE雾G诱导尤的基鹅因转谁化聚乙油二醇处（PE核G）、细多聚挎鸟苷稳酸、徒磷酸拐钙在近高PH值条墨件下夕诱导介原生中质体店扑获DN万A分子杨。步骤成：共保居温；稀释PE宣G；非选璃择培及养；选择吼培养轨。优点秋：转化显顺利搁，对及细胞嫁伤害央小；避免赛嵌合扣体的亚生成承；易于健选择掩；便于昏进行京理论姑研究磁；受体莲广泛雪。4、脂绩质体码介导用化谜学物卖质将DN气A包裹滚成球虾体，镰通过彻植物龄原生积质体萄的吞畜噬作轰用，竿把DN到A导入义细胞督。5、电撤激法料介导利用兴高压套脉冲建作用脂，在尽原生贝质体外上形户成可嚷逆的垫瞬间阵通道筋，从咳而促握进外蹈源DN枯A的摄哨取。＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－6、超虑声波臣介导7、显冬微注挂射8、激认光微忠束9、种赠质系总统介轿导法生物芳媒体枝转化配系统(二)转基铜因操裳作的佣受体娃系统1、高剖频再乒生体腹系的骄建立愈伤兽组织击再生川系统直接籍分化粗再生序系统原生膜质体许再生谢系统胚状剪体再姿生系耐统生殖继细胞师再生归系统2、抗柴生素他敏感扇实验抑制梢细菌端生长杀死漫非转析化细马胞3、农寨杆菌臣敏感泛实验(三)转化惊细胞室的培吹养和岩转基座因植智株的勿再生恢复秧生长筛选坝培养植株沉再生四、源转基帮因植况物的越鉴定遗传咐鉴定表达言鉴定表型理分析葱鉴定利用客报告编基因No页rt丢he步rn杂交We尼st直er吨n杂交直接山鉴定DN出A分子韵是否锅整合拣到基宴因组万上。1）扩箭增目致的片谨段；2）杂谊交信污号鉴老定。（So装ut谅he鸦rn杂交）鉴定认步骤盼：筛选剂鉴定州（利掌用质毒粒上殃的选手择标精记）报告处基因滥鉴定未（利笔用质毙粒上抹的报用告基功因）遗传模鉴定生长单试验

DNA鉴定-southernRNA鉴定-northern蛋白质鉴定-westernSo悲ut泽he山rn每D朽NA印迹地杂交植物进遗传恭转化铃流程适宜愉外植书体的惩选择稍及再漆生体窄系的舱建立抗生狗素筛宇选压言的确盏定及危农杆和菌菌宇株的殊选择遗传膛转化旗操作载体厨介导虚的虾转化怨方法DN波A直接向导入头法种质虫系统稳法选择云培养转基岔因植芦株鉴深定获得恒再生岛植株转化已质粒绣的构胜建转基姨因植乳株的触繁殖网与应淹用利用截报告祥基因So络ut更he斥rn杂交No欺rt泪he齿rn杂交We抄st宝er倍n杂交五、话基因稍工程木的安僵全性（一芹）安柜全问例题的祖考虑工程嫌菌株炒的处兔理转基俗因植秆物的烫释放转基盘因产枣品的踪蝶安全1.转基趴因作呈物本祥身成武为杂互草；2.转基淘因作呢物使柴其亲镰缘野锄生种茧成为午杂草拜或超伶级杂今草；3.转基盏因作恳物可绘能产扁生新苦的病盾毒或桐疾病截；4.转基驳因作膊物对呢非目叙标生帅物的贸危险公；5.转基龙因作懒物作私为外相来种控对新欲生境四的入握侵，胞使生链物多拨样性妹受到弃威胁丘；6.转基虫因作码物对哄生态冠系统浴及生俯态过塌程的斯影响忆；7.其它齐一些敲不可陪预计鼓的风器险。（二屡）转幅基因文植物厦的风业险（三湿）生控物安绩全的太管理法国亚为对吓遗传紧修饰招生物身体(G忙MO锅)的评弊价和临立法倦成立糖了两秃个专住门委降员会浪。第一奶个是寺遗传晓工程庭委员眉会，丸成立响于19钥75年，豆任务要集中榨于实牙验室孝的重泛组DN她A的研袭究；19天86年又叨成立集了生旗物分叛子工托程委盗员会悦，它花的任姓务是大评价弦遗传游修饰薯生物弊体的辰大田惰试验茂、释惭放以修及商弓品化忧过程励的安苍全问妹题。进入90年代至特别梦是19随92年联震合国婚环境恐与发作展大芝会的灰召开爬，更等加促逢进了老国际壶上对孙生物误安全或立法浮工作需的重循视，认特别消是大价会由霉许多馒国家职签署日的两班个纲拥领性昏文件《2赔1世纪帜议程》和《生物堪多样祥性公镰约》均在愁有关虚条款庄中提兵到了马生物臣技术竹安全宗问题析。19滥93年，鞋在原脊国家饶科学壶技术染委员腊会领灾导下豪成立脚了国脾家生叔物遗挺传工刻程安秋全委泄员会松，由境来自吵卫生赞部、牺农业感部、红轻工展业部惹的专叼家组索成，趟负责烛医药护、农腔业和涌轻工怕业部杏门的么生物拴安全纷。目前嫌，在宴中国设负责阔生物检安全态