乙肝疫苗生产发展简介详解

乙肝疫苗生产发展简介详解演示文稿当前第1页\共有48页\编于星期三\19点（优选）乙肝疫苗生产发展简介当前第2页\共有48页\编于星期三\19点2，减毒活疫苗患者---分离出致病微生物（细菌或者病毒）-----通过改变培养条件，获得不再致病微生物---培养不再致病微生物，获得大量的不再致病微生物---铝吸附-----减毒活疫苗。当前第3页\共有48页\编于星期三\19点乙肝病毒的体外培养至今没有成功前面，我们已经讲过，细菌要在培养基中繁殖，病毒要在细胞中繁殖，比如，流感病毒在鸡胚细胞中生长，狂犬病毒要在地鼠肾细胞中生生长，乙脑病毒要在vero细胞中生长。可是乙肝病毒在所有实验过的细胞中都不能生长。乙肝疫苗的研究受到了严重的困难。人们不得不寻求其他的途径去生产乙肝疫苗。当前第4页\共有48页\编于星期三\19点乙肝抗原的来源1，乙肝患者的血液：血源性乙肝疫苗。2，利用DNA重组技术构建重组微生物（酵母）表达（合成）乙肝抗原：基因工程乙肝疫苗当前第5页\共有48页\编于星期三\19点乙肝疫苗发展历史1,1963年Blumberg发现在血友病患者的血清中存在一种抗体，这种抗体能与澳大利亚土著人血液中的一种抗原起交叉反应，这种抗原被命名为“澳大利亚”抗原。2,1968年Prince在血清型肝炎（乙型肝炎）患者血清中发现抗原性与澳大利亚抗原相同的病毒样颗粒，进而初步认定澳大利亚抗原就是乙肝表面抗原。3,1970年Dane用电子显微镜在乙肝患者血清中发现直径为42nm完整乙肝病毒颗粒及直径为22nm的球形和杆形的乙肝表面抗原。当前第6页\共有48页\编于星期三\19点4,1971年Krugman发现加热处理的急性期乙肝患者的血清能部分预防乙肝感染。5,1981年Merck公司在世界上首次研制成功第一代乙肝疫苗——血源性乙肝疫苗。6,1985年北京生物制品研究所在国内首次研制成功血源性乙肝疫苗.7,1986年Merck公司在世界上首次研制成功第二代乙肝疫苗-----重组酵母乙肝。当前第7页\共有48页\编于星期三\19点8,1989年北京生物制品研究所与Merck公司签订合同，引进重组酵母乙肝疫苗工业化生产技术。1993年5月开始试生产。9,90年代德国莱茵生物技术公司发展了一种甲基营养型酵母---汉逊酵母表达系统,其乙肝表面抗原表达水平可达到500-1000mg/L.南韩绿十字疫苗公司应用该表达系统实现了重组汉逊酵母乙肝疫苗的大规模工业化生产。当前第8页\共有48页\编于星期三\19点10,大连高新（汉信）生物制药有限公司从1998年开始重组汉逊酵母乙肝疫苗的研制工作，在2002年6月获得了国家药品监督管理局颁发的“新药证书”，在2003年开始商业化生产。

11,华兰生物在2009年也将开始重组汉逊酵母乙肝疫苗的生产。当前第9页\共有48页\编于星期三\19点乙肝疫苗的发展历史第一代乙肝疫苗；血源性乙肝疫苗。第二代乙肝疫苗；基因工程乙肝疫苗。当前第10页\共有48页\编于星期三\19点基因工程乙肝疫苗1，CHO细胞乙肝疫苗。2，重组酿酒酵母乙肝疫苗。(第一代重组酵母乙肝疫苗）3，重组汉逊酵母乙肝疫苗。(第二代重组酵母乙肝疫苗）当前第11页\共有48页\编于星期三\19点

乙肝疫苗的发展历程：n80年代初期-----血源性乙肝疫苗（第一代乙肝疫苗）。1995年停产。n80年代中期----基因工程乙肝疫苗（第二代乙肝疫苗）。包括：重组酿酒酵母乙肝疫苗，表达水平不理想—50mg/L。5ug/0,5ml的成人剂量偏低，抗体滴度偏低。重组CHO细胞乙肝疫苗，表达水平低，2-5mg/L，母婴阻断效果不理想重组牛痘病毒乙肝疫苗。表达水平低，1-3mg/L，无法实现工业化生产。n90年代初期---重组汉逊酵母乙肝疫苗。更先进的基因工程乙肝疫苗。当前第12页\共有48页\编于星期三\19点国外主要的乙肝疫苗生产厂家厂家疫苗美国默克公司Merck重组酿酒酵母乙肝疫苗比利时史克公司Smithkline重组酿酒酵母乙肝疫苗法国巴斯德研究所PasteurMerieux重组CHO细胞乙肝疫苗德国莱茵公司下属的韩国绿十字疫苗公司GreenCross重组汉逊酵母乙肝疫苗当前第13页\共有48页\编于星期三\19点国内主要的乙肝疫苗生产厂家厂家疫苗北京天坛生物制品股份有限公司(北京生物制品研究所）重组酿酒酵母乙肝疫苗深圳康泰生物制品公司重组酿酒酵母乙肝疫苗华北药厂和长春生物制品研究所等重组CHO细胞乙肝疫苗大连高新(汉信）公司和华兰生物疫苗公司重组汉逊酵母乙肝疫苗当前第14页\共有48页\编于星期三\19点国内乙肝疫苗生产厂家工艺比较厂家种菌发酵细胞破碎粗纯精纯吸附北京深圳啤酒酵母四级发酵高压破碎硅胶吸附疏水层析原位吸附大连汉信汉逊酵母四级流加球磨破碎PEG硅胶吸附DEAE分子筛区带普通吸附华兰生物汉逊酵母四级流加高压破碎硫酸铵沉淀疏水DEAE分子筛普通吸附当前第15页\共有48页\编于星期三\19点公司菌种的表达水平纯化的收率北京深圳50mg/L20%大连汉信150-200mg/L15%华兰生物200-300mg/L20%当前第16页\共有48页\编于星期三\19点新乡华兰，大连汉信，北京天坛华兰：菌种好，表达水平高，纯化收率高，所以，总体而言，华兰公司的技术更为先进。当前第17页\共有48页\编于星期三\19点北京生物制品研究所(天坛生物)生产的乙肝疫苗的基本情况：生产技术：从美国MERCK公司引进。年产量：1000万人份，3000万支。生产设备：从美国购进。当前第18页\共有48页\编于星期三\19点基本技术资料：菌种：重组酿酒酵母表达水平：50mg/L表达效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵母总蛋白）纯化收率：20%发酵罐工作体积：500L一次发酵所得抗原量：50mg/Lх500L=25g纯化后所得抗原量25gх20%=5g可生产疫苗量5,000,000/5=1,000,000支当前第19页\共有48页\编于星期三\19点北京天坛的弱项和不足：表达水平低，抗原数量少，每剂疫苗只含5微克或10微克的抗原，比华兰疫苗抗原含量少一倍，所以抗体滴度低和抗体持续时间较短。当前第20页\共有48页\编于星期三\19点

北京天坛和新乡华兰表达

水平和抗原产量的比较 表达水平抗原产量北京天坛50微克低新乡华兰300微克高当前第21页\共有48页\编于星期三\19点北京天坛和新乡华兰疫苗

抗原含量和抗体反应的比较

每剂疫苗抗原含量抗体滴度抗体持续时间北京天坛5微克（儿童）10微克（成人）低短华兰公司

10微克（儿童）20微克（成人）高长当前第22页\共有48页\编于星期三\19点大连汉信和新乡华兰

纯化步骤和纯化收率的比较纯化步骤纯化收率

大连汉信多低于20%新乡华兰少高于20%当前第23页\共有48页\编于星期三\19点汉逊酵母和啤酒酵母的比较当前第24页\共有48页\编于星期三\19点

重组汉逊酵母的特点

（甲基营养型酵母）甲基营养型酵母：以甲醇为唯一能源和炭源的酵母。1,多个HBsAg基因拷贝被整合到染色体中，遗传稳定性好。2,发酵过程中不产生乙醇，黏度小，可实现高密度培养。当前第25页\共有48页\编于星期三\19点3,高效表达HBsAg400-1000mg/L。

4,发酵过程中均使用化学合成培养基，不使用酵母粉等营养成分，生产成本低。

5，生物安全性好，汉逊酵母是存在于土壤，水中的一种酵母种群。它不含人和动物的病原体，不产生内毒素。按照国外基因技术法规，汉逊酵母被列为基因操作生物安全性1组。与酿酒酵母属同一生物安全等级。国外生物安全委员会还将汉逊酵母选为典型的工业菌株的研究模型。当前第26页\共有48页\编于星期三\19点重组汉逊酵母乙肝疫苗生产工艺菌种小三角瓶

大三角瓶

种子发酵罐生产发酵罐

细胞破碎当前第27页\共有48页\编于星期三\19点

去除细胞碎片

疏水层析

离子交换层析

凝胶过滤除菌过滤

铝吸附当前第28页\共有48页\编于星期三\19点种子批系统

SEEDLOTSYSTEM在乙肝疫苗的生产过程中采用种子批系统，即由原始种子批制备主代种子批，由主代种子制备工作种子批，每次发酵都由工作种子批中取一支菌种接种三角瓶.种子批保存在液氮或－80℃的冰箱中。其目的是为了批与批之间菌种的差别降至最低。当前第29页\共有48页\编于星期三\19点重组汉逊酵母乙肝疫苗的人体试验结果A，小学生：选择348名健康小学生（HBsAg,抗-HBs,抗-HBc阴性）年龄在6-9岁之间，随机分为3组，每组接种1批疫苗，免疫剂量为10ug/0,5ml,免疫程序为0，1，6，第1剂免疫后3，7，12月采血样，用Abbott试剂盒检测抗-HBs，并观察副反应。结果如下：当前第30页\共有48页\编于星期三\19点重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小

学生抗体阳转率和抗体GMT疫苗批号人数3个月7个月12个月抗体阳转率%抗体GMT抗体阳转率%抗体GMT抗体阳转率%抗体GMT50111497,87230,598,25897,1100,0791,650210795,19246,6100,0915,6100,0875,1503127100,0311,699,21932,596,77867,6当前第31页\共有48页\编于星期三\19点结论：1，重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生后副反应轻微。2，重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生后抗体阳转率和抗体水平较高。当前第32页\共有48页\编于星期三\19点重组汉逊酵母乙肝

疫苗的人体试验结果B，母婴传播：

选择HBsAg,HBeAg双阳性母亲所生新生儿45名，按0，1，6免疫程序接种10ug/0,5ml重组汉逊酵母乙肝疫苗,采集第1剂免疫后3，7月血样，并检测。同时，还免疫了41名健康母亲所生的新生儿和5名HBsAg阳性,HBeAg阴性母亲所生的新生儿做比较。其结果如下：当前第33页\共有48页\编于星期三\19点

重组汉逊酵母乙肝疫苗

免疫新生儿后的抗体反应母亲新生儿数抗-HBs阳转率（%）抗-HBsGMTHBsAgHBeAg3个月7个月3个月7个月++4591,1141/4593,3342/45236,6615,5+-5100,04/4100,05/5223,9677,3--4185,3735/41100,041/41344,3634,5当前第34页\共有48页\编于星期三\19点重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫新

生儿的阻断母婴传播保护效果母亲人数HBsAg阳转率保护率HBsAgHBeAg3个月7个月阳性阳性452,22(1/45)4,44(2/45)95,07%阳性阴性50,00(0/4)0,00(0/4)阴性阴性412,44(1/41)0,00(0/41)当前第35页\共有48页\编于星期三\19点结论：阻断母婴传播的效果好，保护率达到较高水平，（95,07%）。当前第36页\共有48页\编于星期三\19点

由于重组汉逊酵母表达水平高，使重组汉逊酵母乙肝疫苗含有足够量的抗原，抗原浓度比其它乙肝疫苗高出一倍，成人：20ug/ml,婴儿，儿童：10ug/0,5ml。因而，免疫后产生的抗体不仅滴度高，而且抗体持续时间长。当前第37页\共有48页\编于星期三\19点重组汉逊酵母乙肝疫苗

的特点：三高1，抗体阳转率高。2，抗体滴度高。3，母婴阻断率高。

当前第38页\共有48页\编于星期三\19点用重组汉逊酵母表达产物—乙肝表面抗原制备的重组汉逊酵母乙肝疫苗是新一代的乙肝疫苗，它在临床实验中有优秀的"三高”表现，，即抗体阳转率高，抗体滴度高，母婴阻断率高。

当前第39页\共有48页\编于星期三\19点乙型肝炎病毒感染的预防：

I，被动免疫：

免疫球蛋白（ImmuneGlobulin)免疫球蛋白是将HBsAg阴性供血者的血液经低温乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量不确定，所以预防乙型肝炎病毒感染的作用也是不明确的。使用免疫球蛋白的唯一理由是当时无法获得特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）当前第40页\共有48页\编于星期三\19点乙型肝炎病毒感染的预防：

特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）特异性乙肝免疫球蛋白是将anti-HBs阳性供血者的血液经低温乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量是确定的，所以对乙肝病毒暴露后的预防作用也是确定的。经低温乙醇分段法而制备的特异性乙肝免疫球蛋白是安全的，没有证据表明它会传播AIDS。当前第41页\共有48页\编于星期三\19点特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的使用

什么情况下使用特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）1，伤口和黏膜意外暴露于HBsAg—阳性血液。2,HBsAg—阳性母亲所生的新生儿。注意：在注射特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）后，还应同时注射乙肝疫苗。当前第42页\共有48页\编于星期三\19点特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的注射剂量和注射途径；伤口，黏膜意外暴露，0,06ml/kg.最大剂量：5ml.HBsAg—阳性母亲所生的新生儿。0,5ml。肌肉内注射。

.当前第43页\共有48页\编于星期三\19点乙肝疫苗的接种剂量:分组RecombivaxHB（默克）EngerixB（史克）剂量(ml)剂量(ml)HBsAg(-)母亲的婴儿<11yrs的儿童2,5(ug)0,510,0(ug)0,5HBsAg(+)母亲的婴儿5,0(ug)0,510,0(ug)0,511`--19yrs青少年5,0(ug)0,520,0(ug)1,0>20yrs成年人10,0(ug)1,020,0(ug)1,0透析患者40,0(u