蚕丝蛋白制备工艺研究

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11蚕丝蛋白制备工艺研究【摘要】：植桑养蚕是我国一些地区的传统产业，在养蚕过程中得到大量的蚕茧。20世纪80年代初以来，对蚕茧开始进行深度加工的研究，其中含有丰富的丝胶、丝素、多肽蛋白等成分在食品和医药工业中有广泛的用途。为了合理利用蚕茧资源，本论文主要研究了提取丝胶的新工艺，以指导工业生产。即以蚕丝为原料，在碱性条件下加热水解提取了蚕丝蛋白。其优化的提取条件为：温度90～96℃、pH值11～12、水解时间3～4h。【关键字】：蚕丝丝胶丝素蛋白【引言】：蚕丝是一种高蛋白纤维，富含18种氨基酸，且其结构与人体皮肤相似。经水解后的丝蛋白相对分子量减小、渗透力增强，可加速细胞的新陈代谢，使肌肤富有光泽、增加弹性。同时具有很好的保湿、抗皱、润肤、抑制黑色素的生成及防止化学损害的作用。将蚕丝水解液作营养添加剂加入化妆品中，能让肌肤感觉清爽自然，另外，蚕丝蛋白可以废茧丝作为原料，成本低廉，不含生理活性成分，来源充足。因此，将蚕丝蛋白提取分离并应用于化妆品行业已成为国内外普遍研究的课题，并已达到了实用化程度。此外，蚕丝水解液在医疗保健、美容、食品、酶工程等方面也具有广阔的应用前景。丝胶是球状蛋白，可从下茧，废丝中经高温脱胶，浓缩，干燥制得，也可从丝绸制造厂家排放的废水中大量提取，丝胶二级结构主要以无规卷曲结构为主和部分β构象，含有74．61％的极性侧链氨基酸，丝胶具有良好的吸放湿性能，抗氧化性，营养及保健功能，可用作合成纤维的涤层材料，化妆品和食品的添加剂，还可在医药，固定化酶载体，高分子材料和水泥浆添国剂等方面被开发利用，回收利用丝胶，对保护环境和增加经济效益具有重要意义。天然蚕丝由丝素和被覆在其外部的胶质物质两部分组成，前者是蚕丝蛋白的主要成分，约占总重量70％，后者主要是丝胶蛋白，占总重量的25％，其余约5％是杂质部分，主要包括碳水化合物、色素、盐和蜡质等。丝素和丝胶蛋白均由18种氨基酸组成，但氨基酸组成完全不同。丝素蛋白中包含的l8种氨基酸以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸为主，极性氨基酸仅占18％左右。这种丝素蛋白作为人工皮肤和医用组织工程材料正在研究与开发。而丝胶蛋白的氨基酸组成则不同，极性氨基酸占多数，且以丝氨酸和天冬氨酸为主，非极性氨基酸只占22％。目前，丝胶蛋白已在高级化妆品、医用生物材料和表面活性改性材料等方面得到广泛应用。丝胶蛋白的广泛应用主要归功于它所具有的多种生物活性，主要包括抗氧化、美白、促进细胞有丝分裂和增殖、作为细胞培养的基质、促进微量元素吸收、抗紫外线、防癌等。在上述生物活性的试验中所用的丝胶蛋白样品，有的是利用碳酸钠、中性皂等水溶液煮沸而获得的脱胶液，经过24-48h水透析而获得的丝胶溶液及其冻干粉作为试验材料，这种纯化处理并不能保证试验样品是单一的丝胶蛋白，也就是说，可能吸附在丝胶蛋白上的一些茧层小分子物质特别是具有生物活性的黄酮类物质没有完全被除去。还有些试验用丝胶样品是用普通水或高温高压水处理后获得的脱胶液，直接干燥制成的丝胶肽及其水解物作为试验样品，这些样品中也含有黄酮类物质。目前市场上用于化妆品、护肤品和护发品等领域的丝胶粉末，大多是从茧壳或茧衣脱胶后经过酶解，没有经过进一步的纯化就直接喷雾干燥制成，同样，这些产品中仍可能含有黄酮类物质。目前已有报道彩色茧的茧层中含有叶黄素、一胡萝卜素等活性物质，新开发的家蚕荧光判性蚕茧品种的茧层中含有多种紫色荧光色素和黄色荧光色素，特别是大造茧层中含有许多黄酮类色素，这些物质都具有诸多生物活性。由于研究人员用的蚕茧品种、丝胶制备与纯化方法各不相同，很难比较和确定丝胶蛋白哪些成分具有真正的生物活性。因此，本试验使用了5种蚕茧品种(普通蚕茧、金黄茧、荧光判性雌雄蚕茧和大造茧)，利用高温高压水脱胶的方法，制成水溶性丝胶蛋白溶液，经过酒精反复沉淀来制备纯化的丝胶蛋白样品，以确保完全除去茧层上某些小分子物质，最后分别测定5种纯化丝胶样品的体外生物活性。1、蚕丝及其成分性质的组成国内外学者对蚕丝蛋白结构进行许多研究和探讨，但由于蚕丝蛋白结构的复杂性而后易变性，致使研究结果互不相同，甚至相差很大。蚕丝中蛋白含量高达98％以上，主要是由两条丝素和周转覆盖的丝胶两部分组成。根据资料调查，蚕丝的组成，含有丝素70％～80％，丝胶20～30％，乙醚浸出物0.4％～0.6％，酒精浸出物1.2％～3.3％，矿物质1.0％～1.7％。丝素的氨基酸组成和丝胶有一定差别，以蚕丝中丝素和丝胶的氨基酸组成为例，见表1．11．1丝素丝素又称丝心，是蚕丝的主体部分，是具有结晶结构的蛋白质，有18种氨基酸组成，其中7％左右为人体所必需的8种必需氨基酸。丝素的氨基酸组成结构简单，并且组成多肽分子后分子问容易敛集，所以有一定结晶性，其结晶度在50％左右。丝素中极性侧基约占29.5％，非极性占70.5％，两者比为O.42，而丝胶中两者比为2.91，两者差别较大，这也是丝胶易溶于水而丝素不溶于水且具有一定强度的根本原因。其中侧基为简单的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸约占总数的85％，三者摩尔比为4：3：1，并且按一定的序列结构排列成较为规则的链段。这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域，而带有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非结晶区域。丝素中蛋白的构象主要以无规则线团为主，还有少量。转角、螺旋等，其分子量普遍认为在3.6～3.7×范围。在水中只发生膨胀而不溶解，亦不溶于乙醇。图1.SEQ图1.\*ARABIC1蚕丝中丝素和丝胶的氨基酸组成名称丝素丝胶甘氨酸丙氨酸亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸蛋氨酸色氨酸脯氨酸胱氨酸丝氨酸苏氨酸天门冬氨酸谷氨酸组氨酸赖氨酸精氨酸41.8727.030.320.310.660.70.60.340.312.450.581.231.290.360.711.8313.754.90.80.911.070.870.51.40.233.318.71919.623.251.910.873.58长期以来，人们认为其分子是以Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X(X是包含Ser残基的其他的氨基酸残基)的氨基酸排列顺序的重复构造为主体的一根长链分子。但近几年来随着丝素蛋白分子生物学研究的进展，已认识到丝素蛋白是由大小两个多肽链通过二硫键缔合而成，大的叫重链(H链)，小的叫轻链(L链)。H链是由结晶区和非结晶区段交互排列构成，其亲水区域中存在的2个Cys残基与L链亲水区域中的Cys残基通过极性基团的相互作用而靠近，并最终缔合在一起。在特定的处理条件下，丝素蛋白分子会发生无规则卷曲结构与折叠结构的相互转变，其形态可相应的表现为纤维状、粉状、膜状、凝胶状以及溶液状，而且这些形态之间可相互转变。丝素不溶于酒精、乙醚、二硫化碳等溶剂之中，也不溶于水。但水溶剂对丝素不是没有作用的，丝素也和其他蛋白质一样，与水接触，能吸收一定量的水分而膨化，其膨化度一般不超过30％～40％。其次在一些中性盐如氯化钠、硝酸钠的稀溶液中，也能产生与水同样的膨化作用。在另一些盐，如钙和矽的氯化盐、溴化盐、硝酸盐氯化锌等浓热溶液中，几分钟内就完全熔化。丝肽是丝素蛋白水解的中间产物，丝素水解可采用酸法、碱法以及酶法得到丝肽。丝肽的氨基酸组成与蚕丝中的丝素组成基本相同，主要是由Cly、Ala、Ser、Try组成，这4种氨基酸含量总和占其氨基酸总量的88.4％，这是丝素多肽氨基酸组成的特征，其分子构象为无规则卷曲结构，且无序疏松结构。丝肽中含有多种氨基酸，其中人体所必需的八种氨基酸几乎全有，其含量约占氨基酸总量15％左右，而丝肽具有水溶性，极易被人体吸收，特别是丝肽组成中的Ser、Lys、Asp、Arg、Glu都是皮肤的营养要素。丝肽分子量分布在300～20000一个很广的范围，由于丝肽多肽链比丝素要短的多，所以其分子量亦必然要比丝素小。控制蚕丝的水解程度，可得到不同分子量的丝肽。丝肽分子量在300左右，其水溶性最好，分子量在2000以下，其水溶性良好，当丝肽分子量最高达400～5000，丝肽基本上以大分子聚合肽的形态出现，水溶性较差，放置稳定性亦随之变差。另外平均分子量低于1000的丝肽，味道可口，可直接食用，而分子质量在lOO～5000的丝肽具有良好的保湿性、分散性和溶解性，用于冰淇淋中具有很好的起泡性、持泡能力和保香性，并使口感良好。高纯度的丝肽在冷水中的溶解度非常大，而丝素只在水中发生膨润而不溶解，其主要原因是由于丝肽与丝素的分子构象不同所引起的。从圆色光谱分析来看，丝肽分子以无规则卷曲结构为主，而丝素分子的构象为反平行的折叠为主。两者构象不同的原因是丝肽的制得必须要用强极性的浓盐溶液溶解丝素，在溶剂溶解丝素过程，在数量众多强极性离子的强烈的水化作用下，水分子不仅能进行丝素的非结晶区，而且还能进入结晶区，削弱了多肽链间的范德华力，溶剂化的作用还可以用丝素大分子的多肽链部分发生断烈，这些强极性的浓度溶液使丝素发生无限膨润而成粘稠溶液，同时又破坏了丝素紧密有序的聚集态结构，使之变为疏松无序结构。1．2丝胶被覆丝素外层的是丝胶，丝胶在蚕体内对丝素的流动起润滑剂作用，在茧丝中对丝素起到保护和胶粘作用，约占茧层质量的30％。除含少量蜡质、碳水化合物、色素和无机成分外，主要成分为丝胶蛋白，丝胶是一种球状蛋白，相对分子质量为1．4～31．4万，其中Ser、Alp、Gly含量较高，相对质量分别达到33.4％、16.17％和13.49％。丝胶的2级结构以无规则卷曲为主，并含部分构象，几乎不含螺旋结构，故丝胶分子空间结构松散、无序。在丝胶的氨基酸组成中含大量的丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸等羟基和羧基的氨基酸，因此丝胶表现出较好的水溶性和吸水性，可在水中膨润溶解。将溶于水的丝胶在自然条件下放置，可得到可逆性的丝胶凝胶。在液胶向凝胶转化的过程中，伴随着部分无规卷曲向构象的不可逆转化，凝胶强度与凝胶的浓度呈正比。丝胶向凝胶转化的过程中，伴随着部分无规卷曲向构象的不可逆转化，凝胶强度与凝胶的浓度呈正比。丝胶能抑制酪氨酸酶和多酚氧化酶的活性，其机理可能是由于丝胶中高比例的羟基氨基酸与微量元素如铜、铁的络合，从而影响了酶活性的正常发挥。在酪氨酸、组氨酸等碱性氨基酸中，极性侧链氨基酸占74.16％。此外，丝胶在水中的溶解度与压力温度有关，加压加热比常压加热溶解度高，在2.5～3.O个气压下加热3h，蚕丝即可全部脱胶；其次，丝胶的溶解度与温度亦成正比，温度在60℃以下，丝胶溶解度小，60℃以上，溶解度则显著增加。当温度达到100℃时，蚕丝可脱胶完全，但所需时间较长；温度提高到105℃时，溶解度显著增加；110丝胶溶解度的大小，还决定介质的反应。在酸性和碱性尤其是碱性溶液中，溶解度急剧增加。这因为丝胶是一种具有两性反应的蛋白物质，能与酸和碱结合而成更高度溶剂化的可电离盐，即使是应用pH为9.5～lO.O的弱碱溶液，蚕丝也能在95～100℃时很快达到脱胶的目的。丝胶对蛋白分解是不稳定的，这点与丝素不同，因而也是丝胶与丝素区别的一种征象。丝胶溶液的等电点在pH3.9～4.3之间，丝胶虽然是两性物质，但酸性基比较强，丝胶溶液是弱酸溶液。1.3其他成分除上述的几种主要成分外蚕丝还含有少量的无机物、蜡质物、碳水化合物和色素。其中无机物指生丝燃烧后所残留的灰分物质；蜡质物指高级醇和脂肪酸所形成的脂和石蜡的化合物，它在蚕丝中含量甚微，存在于丝胶内层和丝素外层，约有0.19～1％，不溶于冷水，溶于酒精和乙醚，故也称为乙醚浸出物；碳水化合物大多与丝胶结合，在蚕丝丝胶中平均约含1.45％，蚕茧丝胶中含2.4％，丝素中含0.3％；色素主要存在于丝胶中，丝素中有极微量的残留色素，一般有色茧色素多，白色茧色素少。2、蚕丝蛋白的结构被覆于丝素外围的丝胶层，约占茧层质量的25％，对丝素起到保护和胶粘作用，除含少量蜡质、碳水化台物、色素和无机成分外，主要成分为丝胶蛋白(通常称为丝胶)。丝胶是一种球状蛋白，相对分子质量为1.4～31.4万，由18种氨基酸组成，其中丝氨酸(Ser)、天门冬氨酸(Asp)和氨酸(Gly)含量较高，相对质量分别达到33.43％、16.71％和13.49％。丝胶的二级结构以无规卷曲为主，并含有部分构象，几乎不含螺旋结构。接近丝素的内层丝胶中含口结构的比例相对外层丝胶来说要高，但外层丝胶在环境条件特别是湿度的影响下，部分无规卷曲能向结构发生不可逆转化。通过对丝胶基因ser1进行序列分析，确定其9个外显子中有2个外显子含有由114个枝苷酸(相当于38个氨基酸残基)为重复单位组成的构造．该重复构造中丝氨酸密码子约占40.8％，其编码的肽极有可能形成折叠和转角，因此推测丝胶中也可能含有类似于丝素的结品区。对丝胶的组成，因研究的角度不同，采用的方法和手段不同，因此得到的结果也不尽相同。金子英雄用盐析方法分离丝胶得到易溶性的A与难溶性的B两种丝胶。清水正德提出控制不周的时间，将茧层加水煮沸，分离出三种溶解性不同的丝胶。小松计一⋯在清水正德工作的基础E，运用紫外分光光度法进行分析，提出茧丝中存在四种丝胶(分别称为丝胶I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的观点。涉川明朗从组织学的角度将丝胶区分为3种，分别称为内、中、外层墼胶。蒲生卓磨等将中部丝腺切成5个部分，从各部分抽出蛋白质，进行凝胶电泳，分离出相对分子量不同(8～30万)的5种多肽。从基因表达的角度来看，目前已有5种丝胶基因被克隆和部分测序，共分离到由这5种丝胶基固转录的9种mRNA，因此丝胶可能含有9种多肽。3、蚕丝的应用长期以来,蚕丝的主要价值体现在纺织工业上,最近几年对它的不断研究、开发,它的应用范围已涵盖食品、医药、精细化工、生物技术等诸多领域,如应用于手术后的缝合线、涂料、化妆品、药物的缓慢释放、分离膜及生物活性物的固定化和生物传感器的制作等。3.1共混纺丝作者通过用丝素蛋白和聚丙烯腈共混在NaSCN水溶液进行湿法纺丝,成功地纺制出丝素白含量为15%的丝素蛋白2聚丙烯腈共混复合纤维,纤维的力学性能达到常规服用纤维的要求,纤维的外观光泽和手感与蚕丝的相似。纤维的吸湿性能较腈纶有一定的改善,染色性能也得以增强,使纤维的染色品种大大扩展,阳离子染料、酸性染料等都用于复合纤维的染色,并且均可以得到一定深度的色谱。3.2酶的固定化和生物传感器虽然许多高分子材料应用于酶生物传感器的制作,蚕丝素蛋白作为一种酶的固定基材,其最为突出的优点在于酶的固定化基于它从水溶性的SilkⅠ结构转变为稳定的水不溶SilkⅡ结构,而不需要任何交联剂,只要改变溶剂、温度等因素就能达到。Fukui研究小组首次报道蚕丝用于葡萄糖苷酶(glucosidase)的固定化[59],在1987年开始,Asakura研究小组进行了用活蚕腺体中得到的丝素蛋白固定葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)。作者研究小组于1991年开始用活蚕腺体中得到的丝素蛋白研究酶的固定化工作,制得了第一代葡萄糖生物传感器和脲酶电极。为了缩短传感器的响应时间和克服活蚕来源受季节影响的限制,作者把再生丝素蛋白应用于酶的固定化和生物传感器的制作,并用红外光谱、电子吸收光谱和扫描电镜观察酶在丝素蛋白膜中的形态,发现酶与丝素蛋白之间的相互作用很弱,它们以聚集态的形式存在。但是,再生丝素蛋白在有机体系中或在干燥状态下容易变脆,影响使用。为了克服这个缺陷,作者采用了丝素蛋白和聚乙烯醇共混物来固定酶,发现此共混的致密均质膜应用于葡萄糖生物传感器其响应速度较慢,为此制备了多孔膜,其响应时间随膜的孔隙增多而缩短,但其检测范围基本不变,使用寿命和重现性等性能也几乎与用再生丝素蛋白和葡萄糖氧化酶的共混膜制得的电流型葡萄糖生物传感器的相同,它也可以用于固定过氧化物酶,由此可见,再生丝素蛋白和它与聚乙烯醇共混物作为酶的固定化材料具有广泛的应用前景。3.3智能性水凝胶4、实验4．1蚕丝结构及其水解原理蚕丝由丝素蛋白(Fibroin)和丝胶(Sericin)两部分组成。丝素蛋白是蚕丝中的主要组成部分，约占质量的，丝胶包在丝素蛋白的外部，约占质量的25％，此外还含有5％左右的杂质。丝素蛋白中包含18种氨基酸，水溶性良好，分子量很高，其构象可分为SilkI和SilkII结构。SilkI结构包括无规线团和a螺旋，SilkⅡ结构呈反平行0折叠，两者均可通过改变温度、溶液pH值和应力作用加以转变。根据此原理，本实验在一定的温度、pH值条件下，将蚕丝水解成游离的氨基酸、二肽和三肽的混合物，使丝蛋白分子量减小、渗透力增强，能很快地被皮肤同化吸收，从而成为一种优良的营养添加剂。4．2主要材料及仪器筛选上好的蚕丝，经预处理后备用。NaOH(或KOH)试剂等。玻美计、玻璃棒、电加热器、反应器(搪瓷衬里)、温度计、天平、真空抽滤装置等。在实验过程中，pH值一定时，温度直接影响着水解液的收率和颜色。较高的温度可使蚕丝水解速度加快，但是水解后的丝蛋白颜色呈深棕色且水分蒸发较快。温度较低时在同样时问里水解不完全、收率低。因此，控制水解温度在95～100℃，可得到金黄色的丝蛋白水解液。4．3分离提取过程称取备用的蚕茧或蚕丝，计量，将其放人搪瓷反应器中，加入适量去离子水，加热、加碱，并不断调节pH值，使蚕丝充分水解，然后冷至常温，调其玻美度、脱色、除杂、抽滤、贮存备用。5、结果及讨论在实验过程中，pH值一定时，温度直接影响着水解液的收率和颜色。较高的温度可使蚕丝水解速度加快，但是水解后的丝蛋白颜色呈深棕色且水分蒸发较快。温度较低时在同样时问里水解不完全、收率低。因此，控制水解温度在95～100℃，可得到金黄色的丝蛋白水解液。5.1pH值对蚕丝水解液收率的影响（图1）图5.SEQ图5.\*ARABIC1不同温度时的收率在水解过程中，pH值的大小直接影响着蚕丝水解的收率，经反复实验，蚕丝在酸性或中性条件下几乎不能水解，在碱性条件下可快速水解。碱性越强，丝蛋白水解速度越快、收率越高。控制pH值在1l～12，可使收率达到80％。由实验可知在pH值一定的条件下，反应时问愈长，蚕丝蛋白水解量越大，但水解液颜色也愈深，收率也并不是随水解时间越长越高。因此选择水解4h，可使收率达到80％。5．2水质对水解液的影响（图2）图5.SEQ图5.\*ARABIC2不同pH值时的收率通常自来水中含有钙、镁、钠盐等杂质，它们不仅破坏蚕丝蛋白周围的水膜，同时又影响了蛋白分子的电荷。因此，会使蛋白沉淀，发生盐析现象，还会导致水解不彻底，影响产品的收率。所以在水解过程中一定要使用精制纯水或蒸馏水。5．3设备对丝蛋白水解液质量的影响（图3）图5.SEQ图5.\*ARABIC3不同水解时间时的收率设备也是影响收率的因素之一，如果选用较好的搪瓷反应器，就会避免因高温、强碱、水解时间较长而导致金属化合物进入产品影响质量。5．4贮存方式对丝蛋白水解液质量的影响蚕丝中的丝素蛋白分子因含有一定量的羟基及其它结构，容易吸收紫外线而变性，对其性能有很大影响。实验证明，随照射时间的延长，丝素蛋白泛黄程度也增加，特别是在有水存在时，泛黄更为严重，因此，为了避免水解饭颜色的加深，应避光贮存。要想获得亮度好的金黄色透明蚕丝蛋白水解液，除了控制好pH值以外，还应尽量缩短水解时间、降低水解温度、选择质量好的搪瓷衬里反应器并用去离子水或蒸馏水避光贮存。5．5样品分析经反复对比实验，筛选出4个样品，分析结果如表1所示。表5.SEQ表5.