抗氧化酶活性等测定方法

叶体提一、试剂配置1提L依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)糖(0.33×182.2=60.126g)×58.5=0.585g200×0.0005=0.1g使用时加入2、悬浮液：将提中的换的HEPES3、80%Percol：80ml原+20ml水40%Percol+水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处*个品*3个重*20ml*3=1080ml),悬浮液100ml个理2个种3个重1ml*3次）;80%Percol200ml;40%Percol个处*2个品*个重*次162ml二、提取步骤1、10g鲜加20ml取PBS（50mMMES，0.33M山醇10mMMgCl，0.5POASA-Na用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆大小层过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以叶绿体膜破碎）3、滤液2000g3min小心倒出清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定平转头，加速度调到9)，经30s快使其下降停止，整个离心持续大约左完成；4、沉淀用1ml提液漂洗表面浮物；5悬浮pH0.33mM山梨MgClmMKHPO，2mMASA-Na使现配加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手住离心管在冰块之间搅动叶由震动分散开来要棉吸防压破绿浮时浓点，含叶绿素2mg.ml以这样有利于保持活性。6、2000g1min;7、沉淀再用悬浮液悬;悬液，可以不)8、用剂进行梯度离心将3ml80%Percol（原液按100%算铺在10ml离心层再把3ml铺在离心管中层然后将叶体悬浮液轻轻铺在离心管上层1500g（水离心头的离心机，离心机加速要慢上升，加速度调到也慢下降，否则会破碎Percol度梯度层的形成会层色层破碎的叶绿体地为粗颗粒的Percol之间的界面有一层绿色层为完整叶绿;9、小心吸出，转移到悬浮介质，使叶绿体浓度达取体悬浮液0.1ml4.9ml80%的匀离2min清置于的色杯625nm比色照计

×50/34.5=叶mg/ml）10、叶绿体的完整性，完整达到；参考：TakedaK,T,KondaN.ParticipationofhydrogenperoxideininactivationCalvin-cycleSHenzymeinso2-furmugatedspinachleaves.PlantandcellPhysiology,1982,23:1009-1018.1

取上述制备的完整叶绿体进行如测定：1、用50mM保护酶或其他定项目的缓冲液）稀释倍，用于测定、POD、CAT、APX；2、用酮稀释2倍0.5ML提液用于测定验0.2mol/LHClO稀释3、用5%TCA释2-5倍，取1.5ml用定MDA4、用：丙酮：4.5：4.5释，用于测定叶绿素；（）活一、超氧化物歧化酶（SOD活性测定（氮蓝四唑光化还原法）、试的制（1磷冲(PBSA液磷酸氢二钠溶:取NaHPO·12H分子量358.14）71.7g；B液磷酸二氢钠溶：取NaHPOO（分子量156.01分别用蒸馏水定容到0.05mol/L）配制分别取A液NaHPO，B母液NaHPO，馏水定容至。参考文献合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2甲氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液pH7.8）至。（3）30μM溶取0.001gEDTA-Na用磷缓液容100ml。（4）60核素溶液：取0.0023g核素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM蓝四(NBT)溶取0.1840g用PBS容至100ml避光保存。（上述试剂先配好，放到4度，用之前临时按下面的方法配，然后放在4度中，不要在上层，避免见光，第一组样品加好后拿来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）酶制：（视况整品（新鲜叶片或根系）洗净置于预冷的研钵中，加入.6ml预磷酸缓冲液pH7.8）冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在℃、12000g下20min，上清液即为酶液。、酶性定（1应混合液配(60个样)别取Met溶162ml溶（量和面的浓度要核对缓液5.4ml，NBT溶6ml核黄素溶液6ml,混摇匀；SOD反应混合液个处*种3次重*次定162ml(际配置200ml)（2）分别取3ml应混合液和30（视况整最先一度梯度，看加多少合适，果量太少，最好稀释后再加，这样确）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁下去先加酶液，后加反应液，加好后摇一，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下免得雾气挡住光线照过去（3管置于光照培养箱中lux照下反应要要选择相同规格，2

因为不同的试管透光率是不一样，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相之间会遮光，每一组一个重复，就是每一中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，根和叶分开做，最大管放在中间）同时做两支对照管，其中1试取3ml反混液入30不加酶液）照光后测定作最大光还原管，另只加缓冲液于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有冲液并置于暗处）调零后，避光测出颜色即可测)（5）酶活性计算SOD性单位抑制光还所需酶量（测的样品值要在最大管的一左右才合适，否则要调整酶量）1个活单位uSOD总活性＝A×W×Vt）SOD比活力总性白质量SOD总以鲜重酶单位每克表u/g力位以酶单位每毫克蛋白表示为光照管的吸光度为品管的吸光样品液总体积，PBS的体)为定酶液用量ml，30ul为样重g，测定时应换算为叶绿体的质量mg质单位为。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。、过氧物（POD活测（创酚）（1）试剂配制：磷缓冲(pH6.0)母(HPO)和B母液NaH)混为1000ml；（2）反应混合液配制（以个样准取，pH6.0)，0.076ml液（液愈木2-甲氧基酚）加热搅拌溶解冷却后加入0.112ml％HO，混保存于冰箱中备用。POD反合液：3个2品种3次复*3ml*3次定(际配置200ml,0.076ml,0.112ml)（3）样品测定：取反液并加入μl酶液PBS对照调零，而后测定OD470值测定40秒测定，测定前等待秒，要，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相不大）（4）酶活性计算：以每minOD值（升高为1个活位uPOD=（ΔA470×Vt（W×Vs×0.01×t(u/gmin)ΔA470反应时间内吸光度的化W品鲜(；t为应(min)；Vt为取酶液总积为时取酶液体积、过氧氢（CAT活测（1）试剂配制：0.15mol/L磷冲液（pH7.0A液NaHPO)和母液NaHPO)292.5ml后用蒸馏水定容至1000ml。3

（2）反应液配制：取200ml，pH7.0的H原液）摇匀即可CAT反应液3个处*2个种*次重*3ml*3测=162ml(际配置200ml,)（3测定应液加可视情况调整对照调零定（外40s（4）酶活性计算：以每minOD值0.01为1个性单位uCAT=[ΔA240×Vt（W×Vs×0.01×t）(u/gΔA240反应时间内吸光度的化W品鲜(；t为应(min)；Vt为取酶液总积，1.6ml为时取酶液体积ml,0.1ml三、抗坏血酸过氧化物酶（）活性的测定（缓冲液为K）、试配（50个样计：（1）0.05HPOPO缓液pH7.0的配制：）K·3H：228.22×0.05×0.61=6.9607g）KH136.09×0.05×0.39=2.6538g以上两者混合起来用去离子水定容到1L）0.1mMEDTA-Na：0.01861gEDTA-Na用液定容到500ml（372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861（3）5mMAsA取0.044g坏酸用溶定容到50ml（现配176.13g/M5mM×50ml=0.044gO取0.2ml,30%H用离水释100ml（30%H为550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M实际配置0.1mMEDTA-Na个理2个品*次重*1.7ml*3测定实际配置250）5mM的3个处*2个*次重*0.1ml*3次定5.4ml;（际配置50ml,0.044g20mMH3个处*2个品*次重*次定5.4ml;实际配置50ml,0.1ml、酶性测（2ml系定（10.10酶可情况整ml0.1mMEDTA-Na的（0.05mol/L再加入0.10mlmM的AsA，加入0.10O立即在20下测定D290（）值40s内（测定时间内变化大可测定的时短点，否则长点）的变化，计算单位时间内sA减量和酶活（室温下测定，缓冲液调零计算公式：△OD/△t×Vr×VT△OD为应时间内吸光度的变40秒光0光度反应时间40应液体积2mL提液体积1.6mL光系数2.8mM为色杯厚度1cm测液体积0.1mL为品鲜重四、超氧阴离子自由基（O

2

.-

）产生速率的测定（羟胺氧化法）4

1、试剂的配制（1）1mM盐酸溶液：称取0.02085g盐羟胺用蒸馏水定容至300ml；（2）17mM氨基苯磺酸溶液：取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：：3配制）加热溶解后定容至400ml；（3α-胺溶液取0.4008g胺用冰醋酸水溶冰醋酸3配容400ml实际配置PBS，pH7.8）:3个理*个品*3次重*0.5ml*3定（配置100）1mM盐酸羟胺溶3个处*个品*次重*次定=（实际配置）17mM氨基苯磺:3处*2个品*次重*1ml*3测=（配置100ml,0.2944g7mMα-萘胺溶液3个理2个品*次重*次=（实际配置ml,0.1004g）2、O.-2

含量的测定（1）样品液提取方法同SOD；（2）取提（酶液情调整用量）中加入0.5ml（0.05M，pH7.8盐酸羟胺溶液后摇匀。（3）在25℃保温1时；（4）依次先加入1ml对苯磺酸，再加入萘胺，混合后快速摇匀；（5）在25℃保温20min后3000×g下心3min后上行（或置于冰箱待测（6）以对照管调零（用水调零水相液测定OD530值定（7）O

含计算：由测得的OD530查NO标准曲线得[]根据羟胺与O的式NHOH

＋HNO＋HO＋HO计[O

][NO

]×2=[O

]；再根据样品与羟胺反应的时和样品中的蛋白质含量，求得O

产生速率（以nmolmg蛋示，也可以nmol

鲜重表示O产=（C×V）/（nmolming鲜C标准曲线上查得的浓(umol/L)为定所提液叶绿体稀释后的体)为应间(为品鲜(绿实际质量参考文献：爱国，罗广华．植物生理学通讯，19901、试剂的配制（1马斯亮蓝溶液配制取100mg考斯蓝50ml％醇中入100ml（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。（2）100μg/ml血清蛋白BSA标准溶液：称取水溶解后定容至100，再从吸取用水定容至100也可取10mgBSA定至100ml即100μg/ml标准溶液实际配置0.05M磷冲液个处*2个品*3次重*0.08ml*3测=（际配置100ml,）5

考马斯亮蓝溶3理*2种3次*2.9ml*3测=156.6ml;（实置，20mg）2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定取μl提取液（酶液）加入0μl磷酸缓冲液即稀释成0.1ml提液入考马斯亮蓝溶液，反应2min后OD595（μl缓冲加考马斯亮蓝为对照调零（2）蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量mg/g)/(W×V×1000)C标准曲线查得的蛋白质含为液总体稀释后的体积测定时所用取液体积ml，20为重（g（H）含22一试配：1、0.2mol/L取溶0.5L中；2：112溶于0.5L的水中；3的磷酸缓冲HPOO5.6407g+NaHO5.3433g用离子水定容500ml；4、显色液：、0.1mol/L、pH磷酸缓冲+25μL二苯+mg氨吡啉；5、过氧化物酶溶液250二测步：称取植株根和叶片组织各，置于研钵中，加入1.6预至℃的0.2，匀浆，于10心5清加4调pH为7.5，再于心5min（4清1mL加0.4mL液和0.1mL化物酶溶液250UV-1601分光光度计测定波长550（）处光密度值的变化HO含mol/gFW表么）三计方要标线参考：过氧化氢（H）含量的测定参照(2002)方法并加以改进。还型胱肽GSH2．试制（1准液10mL（用配蒸馏水至10mL要)（2）5％磺基水杨酸：25g溶于水（3DTNB称取0.118905g50mL（0.1M中。（4：18.1mg溶10mL。（5）1mMGSSG标液10mLGSSG。(要实际配置0.1MPBS(pH3处*2个品*3次重*0.5ml*3次定27ml;实际配置）6mMDTNB:处理2个品*3次*次定（配置ml量）2mMNADPH:处*品*3次重*次定=（际配置50ml,实用量18.1mg(1U)GR3个理2个品*次重*0.1ml*3次定5.4ml;实际配置50ml,实量10ml5％磺基水杨酸*2个品*3次重*测定（配置10ml际量0.5g/10ml)6

0.5mM个处*2个品*3次*1.5ml*3次定81ml;实际配置100ml）乙醚（二乙醚3个处*2个品*次重*10ml*3次=（配置1000ml）PBSBuffer个处*个品*3次重*1.5ml*3次定81ml;实际配置150）2-乙烯吡:3个处*2个*次重*0.2ml*3次定10.8ml;（际用量20）乙醚:3个*品*3次复次定540ml;际用量10001．标线制作：配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM标准GSH溶液取上述标准各）加入0.5mL0.1M磷酸钠（）(含5mM，0.2mL6mMDTNB,0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GR（谷胱甘还原酶(sigma),从0.1mLGSH启反应，测定的A412绘制标准曲线。以代DTNB作空3．GSH还原型谷胱甘肽）GSSH

氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新叶片，加入（可以取0.2g鲜，加1.6ml取液5基水杨酸，研磨在14000g离心10分，取1mL上，加入1.5mL,0.5mM（pH7.5），再用5mL乙（二醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢即可，反复进行两次即为抽取两次液用于分析总谷胱苷肽含量。各取1mL上液，加入PBS(pH7.5),0.2mL烯吡啶（原装试剂浓度）合至乳胶状，在25℃应1小用醚（原装试剂浓度）抽2次，取液用于分析『GSSG－氧化型谷胱甘肽，还原谷胱甘肽不