分子生物学分子克隆

分子生物学分子克隆第一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五分子克隆

分子克隆（molecularcloning）是扩增DNA片段的数量。一般程序是将需要扩增的DNA片段连接到载体（vector）上，再将重组的载体导入宿主细胞中，重组载体在宿主细胞中复制，目的DNA片段也同时得到扩增。

第二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌的一般性质

大肠杆菌是需氧或兼性厌氧细菌，革兰氏阴性，在琼脂培养基上形成圆形、光滑的白色菌落。大肠杆菌中有一个4.2×106bp的环状染色体DNA。除少数菌株外，大肠杆菌通常不致病。用于分子克隆的大肠杆菌必须具备一些特殊的性质，除极少数例外，用于分子克隆的大肠杆菌都是由K-12菌株衍生而来的。为了消除受体大肠杆菌对外源DNA的限制作用，一般都是选用具有限制缺陷的突变体作为受体菌。

第三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌的遗传标记

大肠杆菌的遗传标记一般采用三字母命名，如tet

r、tet

s、amp

r等，其中上标r代表抗性（resistance），s代表敏感（sensitivity）。当大肠杆菌中含有质粒或噬菌体时，记为E.coliK-12（pBR322）、E.coliK-12（λ）等。第四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌培养基

液体培养基（LB液体培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1gNaCl，加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。）、固体培养基（加琼脂或琼脂糖）。有些培养基需要加一些不耐高温的成分，应在培养基高压灭菌后冷却到一定温度再加入，这些成分的母液可通过过滤除菌。第五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五在液体培养基中生长

用于转化的大肠杆菌受体菌应采用对数期的细菌；用于提取质粒的应采用饱和期的细菌。在经预备实验测出生长曲线后，通过测定培养液的O.D.600就可以知道液体培养基中的细菌处于什么期。第六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五在固体培养基上生长

划线法或稀释法可得到单菌落。上层琼脂常用于噬菌斑的筛选。浓度较低的上层琼脂与菌液混合后倒在下层琼脂上面。倒置培养。

第七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五载体

载体主要有两类：质粒（plasmid）和噬菌体（bacteriophageorphage）。它们都经过了人工的改造，使其能更好地满足分子克隆工作的需要。它们在宿主细胞中都能够复制，并且在带有外源DNA片段时也不影响它们的复制，而单独的外源DNA不能复制。

载体还必须带有一些遗传标记，以供选择。第八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒（plasmid）的一般性质

质粒是在细胞内能自主复制的双链共价闭合环的DNA分子，大小从1kb到200kb不等。大肠杆菌中的F因子就是一种质粒。

在质粒上插入一段外源DNA，只要不破坏复制起始点，外源DNA就可以和质粒DNA一起复制。质粒上往往带有编码某些酶的基因。当外源DNA片段插入到某一遗传标记基因中，该基因就失去活性，若该基因能够赋予细菌某种性状，根据性状的改变就能筛选出含有重组质粒的菌落。

第九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒的遗传标记

质粒携带的常见基因有β-内酰胺酶基因，带有这种质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素（amp

r）；氯霉素乙酰基转移酶基因能够抗氯霉素（cat

r）。其他一些遗传标记有lacZ、tet

r、str

r等。第十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒的复制类型

一般来说，一个质粒上只带有一个复制子（replicon），目前使用的大多数质粒载体都带有一个来自pMB1质粒的复制子。其他常用的复制子还有ColE1、p15A、pSC101等。质粒在大肠杆菌中的复制有两种类型：一种是松弛型控制复制（relaxedcontrolreplication），一种是严紧型控制复制（stringentcontrolreplication）。二者的区别是带有的复制子不同，导致在一个细胞中质粒的拷贝数不同。

第十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒的复制类型

在正常生长情况下，每个细菌细胞中可有15～20个拷贝的松弛型质粒（带有pMB1或ColE1复制子），而对于严紧型质粒（如带有pSC101复制子）来说，每个细胞中仅有1～5个拷贝。当用氯霉素处理细菌时，氯霉素抑制了蛋白质的合成，严紧型复制质粒的拷贝数并不增加，而松弛型复制质粒的拷贝数可增加到2000～3000个。第十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五严紧型控制复制

严紧型控制复制（stringentcontrolreplication）的质粒的复制，取决于细菌细胞周期之初合成的不稳定蛋白，因此与细菌染色体的复制同步，每个细菌细胞中只有1~5个质粒拷贝。

pSC101复制子部分来源于R6-5质粒的复制子，R6-5复制子编码了一个必需的顺式作用蛋白，该蛋白对复制起点具有正调节作用，而对自身基因repA基因（编码该顺式作用蛋白的基因）的转录则有负调节作用，所以带有这种复制子的质粒属严紧型控制质粒，蛋白质合成抑制剂处理也不能增加它们的拷贝数。

第十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五松弛型控制复制

松弛型控制复制（relaxedcontrolreplication）的质粒的复制，依靠宿主细胞提供的半衰期较长的酶来进行，因此即使宿主的蛋白质合成停止，质粒的复制仍继续进行。当在培养基中加入氯霉素时，抑制了宿主的蛋白质合成和染色体复制，但质粒仍在复制，最后可达到每个细胞内含2000~3000个质粒拷贝。这一性质被利用来进行分子克隆。第十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒的不相容性

带有两种不同复制子的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中，称为质粒的相容性。

带有两种相同复制子的质粒不能稳定地共存于同一个细胞中，称为质粒的不相容性。

根据质粒的相容与否，可将质粒分为各个不相容组。同一不相容组的两种质粒不能稳定地共存于一个细胞中，不同不相容组的两种质粒可以稳定地共存于一个细胞中。

现已发现了三十多个不相容组。第十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒不相容原理

当两个不相容质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两种不同的质粒在一个细胞中的拷贝数并不总能保持相等。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，另一种质粒处于优势。细菌繁殖几代后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但不会兼而有之。第十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒载体的选择一种理想的质粒载体应具备下述条件：分子相对较小，3~10kb左右。这可使限制性内切酶在质粒载体上的作用位点减少。

在复制子以外的适当位点，构建几个限制性内切酶的单一位点，酶切位点最好位于易于检测的表型基因上。

质粒能赋予宿主细胞易于检测的表型，重组质粒能使表型发生变化。

若用于分子克隆，应是松弛型控制质粒。第十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五Lac操纵子调控模型第十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五α互补的原理

现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸（α肽）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到β－半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。第十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五α互补的原理

这种载体适用于可编码β－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但这两个肽段可以融为一体，形成具有酶学活性的β－半乳糖苷酶。这种互补叫做α互补。

β－半乳糖苷酶能将无色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）转变成蓝色的5-溴-4-氯靛蓝，用这种方法可方便地检测出该酶活性的存在。第二十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五α互补的应用

当外源DNA插入到载体lacZ的多克隆位点上后，破坏了α肽，从而不能发生α互补，不能产生有活性的β－半乳糖苷酶。

当培养基中存在IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）和x-gal时，由携带了外源DNA的重组载体转化的细胞长成白色菌落（或无色噬菌斑），而由没有携带外源DNA的空白载体转化的细胞长成蓝色菌落（或蓝色噬菌斑）。第二十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五质粒pBR322的图谱

pBR322质粒带有pMB1复制子，属松弛型控制质粒，经氯霉素处理宿主细胞后，每个细胞中可积累1000～3000个质粒拷贝。第二十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五重组pBR322质粒转化大肠杆菌后的选择方法

（假设外源DNA插入到ampr基因中）

4个菌落都是由质粒转化了的细菌形成的，2,3两个菌落中的质粒没有携带外源DNA，1,4两个菌落中的质粒携带了外源DNA。第二十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pUC19质粒

pUC19质粒带有来自pBR322的ampr和pMB1复制子，带有lacZ基因，在lacZ中含有一个来自单链噬菌体M13的多克隆位点（multiplecloningsite,MCS;orpolycloningsite）。pUC8和pUC9以及Puc18和pUC19是成对的质粒，在一对pUC质粒中多克隆位点的方向相反。第二十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五多克隆位点

多种不同限制性内切酶的单一切割位点密集排列的DNA位点，用于插入外源DNA片段。一般位于DNA载体的某一遗传标记基因内，以便通过插入失活该基因来鉴别重组体。（multiplecloningsite,MCSorpolycloningsite）

第二十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pUC19质粒图谱第二十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五重组pUC质粒转化大肠杆菌后的选择方法

（外源DNA插入到lacZ基因中）

6个菌落都是被pUC质粒转化了的细菌形成的，其中1,3,4号菌落中的质粒没有携带外源DNA，2,5,6号菌落中的质粒携带了外源DNA。第二十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pUC质粒拷贝数多的机理

RNAⅠ和RNAⅡ是以质粒DNA同一区段相反的两条链为模板合成的，RNAⅡ大，RNAⅠ小，RNAⅡ与质粒的复制起点DNA结合，经RNaseH切割后，可作为引物复制质粒DNA。

pUC质粒缺乏rop基因，使得其在一个宿主细胞中的拷贝数在不加氯霉素时可达500～700个。rop基因产生一个63个氨基酸的小蛋白，称为Rop蛋白，它能增强RNAⅠ与RNAⅡ的结合，而RNAⅡ是质粒复制的引物，所以rop的存在抑制质粒的复制。第二十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pSP质粒

pSP64和pSP65的多克隆位点方向相反，还带有来自噬菌体的SP6启动子，可转录插入片段的一条链。pSP70～pSP73以及所有的pGEM在多克隆位点的两侧有SP6和T7启动子，可在体外加入SP6或T7RNA聚合酶分别转录插入片段的两条链，以制备单链RNA探针、制备体外翻译的mRNA模板、合成反义RNA等。

第二十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pSP64质粒图谱第三十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pGEM-3zf(+/－)质粒图谱+和--

在于f1复制起点的方向不同第三十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五pGEM-3zf(+/－)质粒多克隆位点序列图第三十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五穿梭质粒

穿梭质粒（shuttleplasmid）是一种杂合质粒，它们既含有能在原核细胞中复制的复制起始区，又含有能在真核细胞中复制的复制起始区，所以它们可以在两类细胞中扩增。如将酵母的2μm环质粒与pBR322融合在一起的pJDB219就是一种穿梭质粒，用pJDB219克隆的基因可以先在E.coli中筛选鉴定（在酵母中操作重组DNA有一定困难），然后再转入酵母中进行表达。第三十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五穿梭质粒

由大肠杆菌质粒载体和牛乳头瘤病毒（bovinepapillomavirus，BPV）构建成的pBPV-BV1是一种典型的动物细胞系统的穿梭质粒载体，它既可以在大肠杆菌细胞中复制筛选，也可在动物细胞中复制表达，每个细胞平均有10～30个拷贝。第三十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体headsheath第三十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体（λphage）基因组的一般性质λ噬菌体为双链DNA细菌病毒，在噬菌体头部时DNA为线性分子，大小48.5kb。线性分子的两端有12个核苷酸长的5’突出粘性末端，称为cos位点（cohesive-endsite），这两个粘性末端富含CG，能互补，但不是回文结构。通过两端的粘性末端连接，线性分子可转变成环状分子。第三十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体（λphage）基因组的一般性质3

DNA分子可分为3个区。左臂区含有编码头部和尾部结构的蛋白基因，右臂区含有负责DNA复制、使宿主细胞裂解的基因，以及这些基因表达的调控序列。中央区的基因对于形成噬菌体是不必需的，这一段可被外源DNA取代。第三十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体中央区的基因

中央区编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，它们包括一些与重组有关的基因（例如redA和redB），使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的int基因，以及把原噬菌体DNA片段从宿主染色体上删除下来的xis基因。若用外源DNA片段取代这个区域的基因，不会影响噬菌体的形成。

第三十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λDNA的结构线性分子环状分子左臂

左臂

右臂右臂中央区中央区（40%）Cos位点第三十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体载体对大肠杆菌培养条件的要求

λ噬菌体侵染大肠杆菌时，首先吸附在细胞外膜的受体上，这些受体由大肠杆菌的lamB基因编码，其正常功能是转运麦芽糖进入细胞内。由于麦芽糖可诱导这些受体的合成，而葡萄糖抑制其合成，故用作λ噬菌体宿主的大肠杆菌应在含麦芽糖的培养基上培养。第四十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五图6－6

λ噬菌体的生长途径第四十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五裂解生长途径λ噬菌体与膜上的受体结合→环化→θ环复制产生子代环状DNA→转录和翻译出各种蛋白。子代环状DNA→滚环复制产生线状多聚体→包装成子代噬菌体颗粒。

溶源性生长

子代环状DNA→整合到大肠杆菌染色体上→随染色体DNA复制而复制。第四十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体改建成载体的基础λ噬菌体可在细菌细胞中大量繁殖。λ噬菌体的中央区对于自身繁殖是不必需的，可将外源DNA插入或取代中央区，外源DNA将随着λ噬菌体DNA的扩增而扩增。λ噬菌体DNA改建成载体后，可以携带较大的外源DNA（最大容量可达22kb，质粒载体最大只能携带15kb的外源DNA）。λ噬菌体载体转导细菌的效率比质粒载体转化细菌的效率高得多。第四十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五对重组λ噬菌体大小的要求

宿主细胞内的λ噬菌体DNA必须具有适当的大小，才能被包装到事先组装好的、由蛋白质组成的头部（前头）。野生型λ噬菌体DNA为48.5kb，被包装的效率最高，并且形成的噬菌体颗粒感染力最强。实验表明，当构建的λDNA分子的长度在野生型的78～105%范围内，仍可被包装成具有感染力的噬菌体颗粒。如果构建的λDNA小于野生型的78%或大于其的105%，就不能形成具有感染力的噬菌体颗粒。第四十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五将λ噬菌体改建成载体的措施消除基因组必需区内不必要的限制性内切酶酶切位点。在可替代区构建所需的酶切位点。可在外源DNA插入位点之前加入适当的启动子，以表达外源DNA。加入易检测的表型基因（如lacZ）。重组λ噬菌体最好能够包装，以增加转导率。（使用λ噬菌体载体时，培养基中必须加入麦芽糖）第四十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五转化、转染和转导转化（transformation）：使质粒DNA进入宿主细胞转染（transfection）：使裸露的噬菌体DNA直接进入宿主细胞转导（transduction）：使用完整的噬菌体颗粒感染宿主细胞，噬菌体DNA在噬菌体蛋白及宿主细胞的受体蛋白协助下进入宿主细胞第四十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五插入型载体和取代型载体

在λ载体中，只有单个切点供外源DNA插入的叫插入型载体（insertionvectors）；那些具有成对的切点，且切点间的片段又可被除去并被外源DNA取代的载体叫取代型载体或替换型载体（replacementvectors）。第四十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λ载体的优点经改造的λ载体比质粒载体的优点在于：①可携带较大的外源DNA片段，其最大容量可达18～22kb，而质粒载体的最大容量一般不超过15kb。②重组后的λDNA在体外包装成噬菌体颗粒，与质粒转化细菌的效率相比，转导具有更高的效率。③重组的噬菌体容易筛选和贮存。噬菌斑原位杂交比细菌菌落原位杂交灵敏。第四十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五合适载体的选择①取代型载体容量较大（最大23kb），适合于构建基因文库，插入型载体适用于克隆较小的外源DNA片段。②优先考虑带有插入失活基因标记基因的载体，如lacZ。③选择带有适当酶切位点（与外源DNA片段相应）的载体。

在替换型载体中，没有替换的载体（两臂直接相连）不能形成有感染力的噬菌体颗粒，所以只要形成了噬菌斑的都是重组λDNA。第四十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五插入型载体λgt10和λgt11图谱第五十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λgt10的特点

λgt10为CⅠ阳性，在带有h

f

l

突变（高频溶源化）的大肠杆菌中CⅠ基因能够高效表达，CⅠ产物能抑制早期转录并阻断晚期基因的表达，与CⅠ同时表达的int基因产物可识别宿主菌和噬菌体基因组中的att位点，并在该部位将二者结合，使噬菌体载体DNA整合到细菌染色体中，以极高的速率进入溶源状态（>99%）在培养基平板上形成浑浊的噬菌斑（因细菌生长缓慢造成）。第五十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λgt10的特点

在CⅠ基因中有一个EcoRⅠ位点，在此位点插入外源DNA后，破坏了CⅠ基因，合成活性阻遏物的功能遭到破坏，噬菌体DNA大量复制，进入裂解周期，在培养基平板上形成清晰的噬菌斑。

在BNN102（C600h

f

lA）宿主菌中筛选重组体，在C600（无h

f

l

）宿主菌中增殖载体。第五十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λgt11的特点

λgt11DNA中有lacZ基因，在lacZ基因中有EcoRⅠ位点，没有插入外源DNA的载体所形成的噬菌斑呈蓝色，插入了外源DNA的噬菌斑为无色。若外源DNA的读码框与lacZ的读码框相吻合，就可以表达出融合蛋白，这样便于用抗体检测。第五十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λZAP噬菌体载体结构和其中的pBluescript噬菌粒第五十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λZAP载体的特点

λZAP载体是一个插入型λ噬菌体载体，在λ噬菌体的中间区用一个叫pBluescript的噬菌粒取代（pBluescript也是一种可以独立使用的载体）。pBluescript载体是由pUC质粒载体衍生而来，它含有一段来自M13或f1噬菌体（单链丝状噬菌体）的复制起点和终点，故称为噬菌粒（phagemid）。噬菌粒（phagemid）既有单链噬菌体的性质，又有质粒的性质。第五十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λZAP载体的特点

pBluescript中含有lacZ，lacZ中有多克隆位点，可插入外源DNA。多克隆位点两侧有T3和T7启动子，利用这两个启动子可在体外分别以外源DNA的两条链为模板转录出两条链的RNA。λZAP载体感染大肠杆菌后能形成噬菌斑，可利用蓝白噬菌斑筛选重组DNA。在辅助噬菌体M13（或f1）超感染下，辅助噬菌体基因Ⅱ表达的蛋白质会识别f1的复制起点，并以滚环式沿pBluescript序列合成单链DNA，直到f1终点止，然后切割下来，两端连接成单链环状DNA，最终被M13（或f1）辅助噬菌体合成的蛋白质包装成单链噬菌体颗粒，排出细胞。第五十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五λZAP载体的特点

被包装成单链噬菌体颗粒的噬菌粒可以感染新的细胞，在新感染的细胞中以质粒的形式扩增和表达外源DNA。由于lacZ的作用，可用蓝白噬菌斑和蓝白菌落选择重组子。多克隆位点的两端有T7启动子和T3启动子，可以在体外加入相应RNA聚合酶，转录出外源DNA的任意一条链。此载体可以携带10kb的外源DNA。第五十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五粘粒（cosmid）载体的特点

粘粒载体长度为4～6kb，由质粒的复制子（通常是ColE1）和λ噬菌体的粘性末端（cos）合在一起构建而成，含有一个抗药性标记（通常是ampr）和若干个限制性内切酶的单一切割位点，能容纳35~45kb长的外源DNA片段。插入外源DNA后可被λ噬菌体的包装蛋白包装，然后转导大肠杆菌。在宿主细胞中以质粒的形式扩增。第五十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五图6

｜

粘粒载体及其克隆步骤9第五十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五粘粒（cosmid）载体的特点

通过转导进入宿主细胞后，cos位点连接成环状，以质粒的方式复制，但不能裂解宿主细胞。若给宿主细胞再感染λ噬菌体，或使溶源性宿主菌转变成裂解生长，则裂解出的转导性颗粒中一部分含有重组粘粒，其余部分含有λ噬菌体DNA。若感染的λ噬菌体是cos序列缺陷的，则裂解出的转导性颗粒全部是重组粘粒。这些含有重组粘粒的转导性颗粒既可以用于转导其它细菌细胞，也可以用于保存。第六十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五粘粒（cosmid）载体的特点

在载体中增殖的DNA片段越大，基因文库中重组体的数目就越小，有利于减少工作量，还能克隆完整的真核基因（含有内含子，很大）。粘粒载体适合于克隆大片段的DNA，小片段DNA插入后因不能形成有感染力的转导性颗粒，反而不能克隆。粘粒载体容纳外源DNA的范围是47～33kb。第六十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五单链丝状噬菌体M13载体的特点基因组为单链环状DNA（正链），全长6407个核苷酸。在宿主细胞中可转变成双链环状DNA（双链复制型）。在宿主细胞中可大量合成单链DNA（正链）。在双链环状DNA中插入外源DNA，可大量合成外源DNA的一条链（插在噬菌体正链DNA中的那一条），为DNA测序提供模板，或提供单链探针。第六十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五图6－10M13mp18载体图谱第六十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五M13单链噬菌体载体的构建

在M13噬菌体的基因Ⅱ和基因Ⅳ之间有一个507bp的间隔，对M13进行改造以使其成为载体主要是在这一位置进行，在此位置插入标记基因lacZ和多克隆位点，但不要影响复制起始区的功能，因为复制起始区也在这一位置。

M13噬菌体载体可以携带约30kb的外源DNA。第六十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五M13噬菌体RFDNA的复制

当M13噬菌体以吸附细胞壁上性纤毛的方式，感染雄性大肠杆菌（F+）后，在细菌胞内酶的作用下合成负链DNA而成为双链DNA，称为复制型DNA（replicationformDNA，RFDNA）病毒基因以RFDNA负链为模板转录，当基因Ⅱ产物在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即开始。新合成的正链逐渐取代原有的正链。当复制叉绕负链模板整整一周时，基因Ⅱ产物将被取代的正链切下，经环化及合成负链后，又产生了一个RFDNA，依此继续扩增。第六十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五M13噬菌体RFDNA的复制第六十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五M13噬菌体正链DNA的复制

当细菌细胞内RFDNA的拷贝数达到100~200个时，细胞内也产生了足够量的单链DNA结合蛋白（基因Ⅴ产物），这些蛋白有两个作用，一是抑制基因ⅡmRNA的翻译，二是与新合成的正链DNA结合，阻止它再转变成RFDNA。此时RFDNA的数量保持不变，但单链正链DNA的合成不断进行。产生的子代单链DNA在溢出宿主细胞时被衣壳蛋白包被，衣壳蛋白是基因Ⅲ和基因Ⅷ的产物。第六十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五感染M13噬菌体形成浑浊噬菌斑

感染M13噬菌体的细菌并不被裂解，可继续生长，但感染了M13噬菌体的细菌的生长速率为正常生长速率的1/2。在琼脂或琼脂糖覆盖层内生长的未感染细菌生长较快，形成较为浑浊的背景，相对于这一背景，由生长缓慢的感染细菌形成一个不断扩大的环带，最终形成肉眼可见的噬菌斑。每个感染细胞内每一代可产生数百个病毒颗粒，因此，在培养基中将积聚大量的病毒颗粒。

第六十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期五DNA分子的连接粘性末端的连接可使用大肠杆菌DNA连接酶。DNA连接酶催化DNA连接反应时要加ATP。平端的连接应采用T4噬菌体DNA连接酶。平端连接相对于粘端连接是低效反应，它要求4个条件：低浓度的ATP、高浓度的连接酶、高浓度的平端底物、没有亚精胺类的多胺。加入适量的聚乙二醇（PEG）能促进平端的连接。第六十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期五平端产生的方法①用适当的限制性内切酶直接切出平端；②对5’突出粘性末端用Klenow片段或T4DNA

聚合酶补平；③对3’突出粘性末端用T4DNA聚合酶修平；④对3’突出或5’突出粘性末端用S1核酸酶切平。第七十页，共八十六页，编辑于2023年，星期五平端加连接子后连接平末端添加连接子（linker）后，用限制性内切酶切出粘性末端后连接第七十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期五平端加适配器后连接平末端添加适配器（adaptor），产生粘性末端后连接第七十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期五平端的同聚物加尾连接第七十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期五相同粘性末端的连接切口切口第七十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期五不同粘性末端的连接（T4DNA聚合酶有3’→5’外切活性）补齐法切齐法第七十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期五

为了分子克隆，重组DNA应导入易于培养繁殖的细胞，如大肠杆菌、酵母等。为了获得转基因物种，也可导入动物、植物或其它微生物细胞。对于不同的受体细胞，应选用相应的载体（能否复制、遗传标记、能否表达、插入失活等）。在一般情况下，受体细胞对于质粒转化和病毒DNA转染是不敏感的。采用适当的物理或化学方法处理受体细胞，可以使其成为接受外源DNA的敏感态，这时的受体细胞称为感受态细胞。

重组DNA导入受体细胞第七十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期五CaCl2法（化学法）

低温下用CaCl2处理，即可形成感受态细胞。加入重组质粒，42℃保温1.5分钟即可使外源DNA进入宿主细胞。第七十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期五高压电穿孔法（物理法）

将受体细胞和重组DNA（或直接是外源DNA）混合后，加高压电脉冲可导致转化