酶组织化学概论

酶组织化学概论酶是一种具有催化活性的特殊蛋白质。人体的各种机能活动都与酶的活性有密切关系。

国际生物化学酶学委员会已登记的酶有2200多种。但当前组织化学技术所能显示的酶仅200多种。酶组织化学是用组织化学的方法证明酶的存在，它的基础是组织化学，目的在于阐明组织细胞内的化学反应、功能及其生物学意义。一、酶的分类

1.氧化还原酶是催化氧化还原反应的酶。包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加单氧酶。如苹果酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶与羟化酶或混合功能氧化酶。2.转移酶即催化功能基团转移的酶。此大类可根据底物中被转移的基团性质分为8个亚类。其中第6亚类为转移含氮基基团的酶，如天门冬酸转移酶。

3.水解酶即催化水解反应的酶，称为水解酶。水解酶又可根据其与水解反应有关的键的类型进一步分为亚酶类，如酯酶、糖酶和肽酶。4.裂解酶又称裂合酶。促进一种化合物分成两种化合物，或由两种化合物合成一种化合物的酶类。它可使底物移去基团，如H20、C02，并出现双键。此类酶的亚类比较多，一般表示分裂的基团，如其中第1亚类为裂解C-C基团的酶，如草酰乙酸脱羧酶；第2亚类是裂解C-O基团的酶，如脱羧酶等。5.异构酶催化同分异构体的相互转化。磷酸葡萄糖异构酶，磷酸丙糖异构酶等。

6.合成酶（又称连接酶）系指能将两种物质合成为一种物质，并必须与ATP分解相偶联的酶。二、光镜酶组织化学证明法

1．金属-金属盐法

金属盐法一般是指金、银、铜、铁、铝、钴等金属。金属、金属盐及其化合物都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的分解产物和金属多半可以结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再显现出酶反应的部位，就可以证明某种酶的存在。酶作用于底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶的反应局部，然后使其显色。其反应式如下：

Pb2+(NH4)2S

R-PO4Na2+H2O――→ROH+PbHPO4↓――→PbS

酶反应显色这种方法在底物溶液中的H+浓度为中胜或弱酸性，常常可利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此，本法常被应用于酸性磷酸酶和在中性附近起作用的磷酸酯酶类。通常称本法为硫化铅法。证明碱性磷酸酶时，通过形成可见的黑色硫化钴，称为硫化钴法。

Ca2+

R-PO4Na2+H2O―――→ROH+CaHPO4↓

酶反应

Co2+（NH4)2S

―――→CoHPO4―――→CoS

金属置换显色用这些金属盐法能够证明的酶多半是水解酶。其中有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、胆碱酯酶等。此外，根据磷酸酶的理论，利用组织化学的鉴别法能证明的酶还有磷酰胺酶、5’-核苷酸酶、ATP酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。2．偶联偶氮色素法

偶联偶氮色素法，此法又称偶氮色素法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。在这种方法中，最常用的分解产物是茶酚系列的化合物，如2-萘酚、1-萘酚、萘酚AS、萘酚AS衍生物等。但这些化合物本身也有一定的溶解性，因而其分解产物有扩散的缺点。

基于重氮盐种类不同，其偶氮颜色也各有差异，可显示出蓝色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色等各种颜色。根据偶联的时间不同，将偶氮色素法分为两种。

1）同时偶联法同时偶联法是在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。

2）后偶联法后偶联法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。

目前观，可把用这副种方乐法证演明的震酶有无：碱当性磷袄酸酶夫、酸天性磷女酸酶楚、酯队酶、β-葡苷进酸酶福、β-半乳咳糖苷而酶、β-葡糖描苷酶泛、N-乙酰芳基β-氨基凯葡糖幕酶、援氨基主肽酶西、硫考酸酯鬼酶等村等。3.色素润形成扮法（1）四乒唑盐堂法惜四些唑盐拣法是吩指含邻有四辰唑盐盖或双脚四唑惨盐的爽底物腹混合嫂液，臣在脱关氢酶则的作糟用下拥，从渔底物慰分离调出来芒的氢益原子蝇与无皆色的擦四唑昌盐或牲双四粉唑盐敲相结胜合，隙形成趴红色饭或蓝听色的件甲志（fo滑rm帜az抵an）或二边甲惭（di鲜fo怎rm搞az崇an）色素违。该毅法主存要证蹲明各削种脱挽氢酶腾。（2）靛惑酚蓝滩法庄靛劈燕酚蓝旗法用乡丰于检弃测氧傍化酶绣的方伪法，狭把二向甲基-对-苯二永胺和α-萘酚侄加入蛮底物藏混合链液中怪，由森酶作冤用而德释放壳的氧拨与此墙二者挎发生菠结合醋，形旷成靛姐酚蓝确，而钞显示罚出酶神的定蜜位。4.底物击薄膜已法榨底物责薄膜宵法是谎把酶锣底物糕在载辨物片丙上涂鉴成膜炸，然伍后再倘将含仍酶的腊组织盒切片柏贴附魄其上雅，给群以条解件让卷酶发销生反窄应，衰使底冠物分场解。酱接着值剥离格贴附盐的切梢片，禽对膜蜓进行钩特殊她染色衡，只老有底拔物被盏分解无的部谦位不闭着色物，而笼未被睡分解镰的部狐位被蹲染色狸，故厌未着计色部裁位就党是酶朵的定秘位。三、食电镜宗酶组撤织化班学证美明法1．氧曾化还挤原酶棚（1）四替唑盐怠法雹四尿唑盐竞是水什溶性弟的，共在水悄溶液状中几侦乎无铲色，津还原监后则理难溶观于水扛和脂蜓质，沿变成予有色胸的高戏电子要密度蓄的甲斥。现他在最悲常用肥的四剪唑盐有NB魂T和TN烫BT等。（2）高荣铁氰轻化物项还原排法解本沉法是傅金属顿盐法繁的一袖种，纽奉高铁押氰化骄物作展为人跳工受警氢体他而被盲使用术。高高铁氰菜化物螺接受括由酶费作用染而游疤离出膨来的泉氢，姐从而位变成灰亚铁陕氰化间物，欢此物脸质不肿溶于价水，芳并以洞电子兵密度挖高的掩亚铁列氰化闻铜的距形式恳在酶壶活性驳部位辅被捕牧捉而躬沉着挠。琥珀骄酸――陆――翅――送→延胡最索酸琥珀意酸脱宫氢酶Fe木(C心N)63-――刑――搅――→秃Fe洒(C票N)64-高铁忆氰化育物煌亚铁委氰化麦物Cu2+――酿――→阿Cu2Fe限(C脉N)6·XH2O亚铁输氰化炊物（3）二搬氨基揪联苯岔胺法二氨目基联贫苯胺版法（di寇am歪in阶ob痕en伏zi歌di祖neme触th题od，DA盛B）法主缺要用璃在直希接证捐明细维胞色仪素氧虑化酶告、过标氧化疏物酶度（内坛源性慌）、毛过氧券化氢馅酶活盛性检途测。DA则B还用钳于形劳成嗜万锇性刮多聚糊体。2.水解麦酶（1）胆吩碱酯念酶活勾性检话查法1）乙粒硫羧幕酸法搭根据北使用权的捕明捉金雨属种担类的堡不同蜜可有虏铅－贷乙硫踢羟酸针法等首，在才酶的贿作用亭下，籍游离劝的硫疗化氢尝与铅南反应稼，形欠成硫观化铅猜沉着划于酶贩的活还性部剥位。酯酶Pb陡(N伟O3)2CH3CO偶SH吼―都―→棉C猪H3CO纷OH拒+权H2S删――掘→Pb党S↓2）嗜锇捉性硫菊酯法咽是以溉嗜锇老性硫设酯作修为底括物，比用坚烤牢蓝BB疲N做偶大联剂季的方汇法。四、轮对照拴实验1.抑制雀剂对毛照用酶沙活性鸦的抑漏制剂迟确认冷酶活糊性受这到抑忽制。cA勿TP腺苷+脸Pi敲AT颤PPP抓iAD励P垮+修Pi环化误酶AT锈P酶四氧圣嘧啶磷酸瞎二酯裤酶茶碱特异倾性底桂物：5’揉-腺苷举酰-亚氨六二磷歪酸cA秧TP+泪PN商P（亚屈氨二侮磷酸普）AT度P-珍PN转P无水款解作稿用环化吹酶AT劈燕P酶2.去底醉物对啄照牌用去侍底物事的无豪底物企孵育炭液进柳行反冬应，艺确认万反应狗的消含失或漂明显攀减弱辟。3.酶活属性丧影失对搏照凡实验