分子生物学第四章复制

分子生物学第四章复制第一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第一节基本概念第二节复制概况第三节DNA复制的酶学

第四节DNA复制的半不连续性第五节原核生物DNA复制（E.coli）

第六节真核生物DNA复制第二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

第一节基本概念

(BasicConcept)第三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五DNA复制

亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,

合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●

复制子（Replicon）；又称复制单位或复制元AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位

1.3万～90万不等第四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五●复制体（Replisome）Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA第五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五DNA复制在细胞周期的S期E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell500-5000bp/min第六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第二节复制概况

(SurveysofReplication)第七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五一、DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了

DNA复制的这一特性概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模

板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子

代DNA分子第八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五15N标记实验·细胞生长在15N标记培养基中·转入正常N源培养基中·分离各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N标记DNA未标记DNACsCL密度梯度离心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml第九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

二、复制起点、方式和方向1、复制起点（originori或o复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点即－－整个染色体只有一个复制单位

第十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

真核生物（Eukaryote）:多复制起点即－－一个genome中有多个复制单位第十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五Replicationfork第十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

富含AT&发夹结构“呼吸作用”十分明显许多酶的结合位点300bp±

真核生物的复制原点ATrich第十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

复制叉（Replicationfork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点

2、复制方向（复制过程的顺序性）

复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛第十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五真核生物的多复制子多个复制眼第十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉

单向复制

双向复制第十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（2）复制的多模式单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核）第十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五3、复制方式大多数以对称方式进行－－即两条链同时复制也有一定时期内DNA只复制一条链的情况

（1）从新起始（denovoinitiation

）或复制叉式（replicationfork）

比较形象的－－θ

复制双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像希腊字母θ，因而叫….第二十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.第二十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

单、双向θ

复制模式图单向复制双向复制第二十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

（2）置换式（Displacementform

）又称D环复制

两条链的合成高度不对称,一条链迅速合成出互补链,另一条则形成游离的单链环(D-环)

线粒体和叶绿体

DNA的复制方式第二十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（3）共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环式复制（rollingcirclereplication）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制

病毒、细菌因子第二十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第三节DNA复制的酶学

(EnzymologyofDNAReplication)第二十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

一、DNA聚合反应和聚合酶1957ArthurKornberg首次发现DNApolⅠ

DNApolⅡ

DNApolⅢ

（E.coli）

聚合反应：底物－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→

Poly(核苷酸)n+1－3’-OH

＋2Pi

第二十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

二、三种DNA聚合酶的结构和功能（P112）第二十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

其中DNApolⅢ

全酶有十种共22个亚基β二聚体－－滑动钳第二十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五DNApolⅢ全酶的非对称二聚体第二十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第三十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能

1、DNA聚合酶活性：两者都有条件－－模板、引物

DNApolⅠ－－主要用于DNA

的修复和RNA引物的替换

DNApolⅢ－－DNA链的延长聚合方向：5’－3’第三十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

2、3’－5’外切核酸酶活性

校对功能(proofreading)第三十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第三十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五3、5’－3’外切核酸酶活性

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三个特点：

♦必须有5’－磷酸末端♦被除去的核苷酸必须是已经配对的♦被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移，Nicktranslation）第三十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五该反应具有巨大的实用价值，切口平移是体外在DNA分子上引入放射性标记核苷酸的主要技术。第三十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五4、子链DNA延伸方向只能是5’－3’已知的DNA聚合酶只能使链按5’－3’方向生长5’OHTCATCA

C5’OH3’pppOHC++ppi

P123页第三十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

ATCG

5’pppOH3’第三十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’pppa、因能量的需要，

DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端需要其他机制以解脱第三十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五b、碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpp

pOH第三十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

三、DNA连接酶（DNALigase）

所需条件：

a、

切刻的3’－OH和5’－P相邻

b、

切刻各自碱基处于配对状态

c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）

用途：复制过程中，5’端RNA引物被置换后切刻的连接

修复、重组NAD——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸第四十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五酶-AMP复合物形成

酶复合物的AMP和缺口的5‘-磷酸相连，随后与此缺口的3’-OH形成磷酸二酯键，并放出酶和AMP第四十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

四、与DNA几何学性质相关的酶1、解螺旋酶（helicase）:又称解旋酶是使DNA两条链分开的酶，通常利用ATP水解提供必需的能量。单链结合蛋白（SSBsingle-strandbindingprotein）

与单链DNA结合，阻止其再形成双链状态

2、

DNA旋转酶（gyrase）：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋第四十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第四十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第四十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第四节DNA复制的半不连续性（Semi-DiscontinuousReplication）

第四十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘

一、DNA复制的半不连续性

事实上没有发现DNA能按3‘→5’合成的证据第四十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

岗奇片段（Okazakifragment）1968

用dT-H3

短时间来标记大肠杆菌D.S.DNAS.S.DNA

蔗糖密度梯度离心测定H3-T

放射强度得到许多长度为1kb左右的DNA片段第四十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五先导链是连续复制的后随链按Okazaki片段不连续复制

先导链（leadingstrand）：DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以3’→5’链为模板，按

5’→3’方向连续合成的一条链

后随链（laggingstrand）：冈崎片段(Okazakifragment):DNA复制不连续合成链中形成的短DNA片段第四十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五后随链的片段合成需要一个周期性的起始信号

二、引物（Primer）和引发酶（Primase）DNApolymerase只能使DNA从引物的3’端延伸DNA复制如何起始？？？

RNA可能提供了DNA复制的3’端1、实验证据Ⅰ：M13phage的DNA复制显示出对转录抑制剂

的敏感性第四十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五E.coli[Rifs]

RNApol[RifS]+M13E.coliM13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifalmpinM13Rifalmpin有M13RFRifalmpin

是E.coliRNApolymerase

的抑制剂

第五十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五M13RF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物（RNA提供复制的3‘端）RF启动后，Rifalmpin

的抑制无效结论（Conclusion）：第五十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五2、实验证据Ⅱ：Reiji等的实验证据－－每一冈崎片段都产生一个RNA－DNA接头第五十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五3、后续研究发现：

♦细菌中先导链的合成受Rifalmpin的抑制

♦后随链的合成不受Rifalmpin限制（1）原因：♫先导链的起始需要RNApol的转录激活♫而后随链的起始由引发酶合成引物，而引发酶不受Rifalmpin的抑制第五十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（2）DNA复制的转录激活

(transcriptionalactivation）：

DNA复制起始时通过RNApolymerse的转录过程而解开局部的双链

转录激活时产生的RNA能否作为引物目前尚未得出普遍结论P119页第五十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第五十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（1）RNApol(RNApolymerase)[RifS]（2）dnaG(primase)[RifR]

组装成引发体

完成对后随链（先导链）引物的合成

（3）完成10±NtRNA引物合成后

DNApolII进行DNA链的延伸

DNApolⅠLigase主要实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断4、总结：第五十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五RNAprimedDNAreplication第五十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五RemovalofRNAprimersandfillingofgaps第五十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五复制叉如何诞生？有机体选择RNA作为引物的可能原因

最终避免由于最初几个核苷酸的复制错误导致的致死突变!!第五十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五后随链上所包含的事件？

三、后随链的合成及前体片段的连接第六十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

引发体（包括引发酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase第六十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第五节原核生物DNA复制

(DNAreplicationinProkaryote)

第六十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

一、DNA复制机构的研究

利用突变表型来考察基因的功能

但只能利用条件型突变温度敏感突变体

材料:E.coli或噬菌体第六十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第六十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第六十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

二、DNA复制的起始

起始方式：

a、从头起始（denovoinitiation）:

θ复制、D环复制、线状DNA的复制

b、共价延伸（covalentextesion）

滚环复制第六十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（1）OriCinE.colichromosomalDNA

1、oriC与E.coli复制的起始（从头起始）♦四个9bp的重复序列

dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列第六十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（2）简单起始过程a、涉及主要酶系：

DnaA（复制起始）、RNApol是必不可少的，此外涉及到DnaB（解旋酶）、DnaC（引发体组分）、Hu蛋白、

Gyrase、SSB、DnaG（引物酶）、TopІ和DNApolШ全酶第六十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五b、简单步骤：

*转录激活*DnaA识别并结合复制起点，DnaB－DnaC六聚体与oriC形成预引发体

*

DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA*引物合成后，DNApol组装到引发的RNA上，完成复制体的组装第六十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五DnaASSB13bprepeats涉及转录激活第七十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（3）E.coli细胞加倍时间与复制起始加倍时间37℃<20min～10h复制时间：40min左右（850核苷酸／秒）分裂过程中其它事件约需20min（组分、隔膜）因此－－加倍时间少于60min的细胞两轮复制有共用时间第七十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五2、共价延伸方式（covalenceelongation）

ФX174的若干正链的合成起始－－滚环复制过程第七十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第七十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

三、延伸过程

进入的标志：DNApolШ把第一个核苷酸加到引物的3’－OH端

（一）后随链合成的起始（前体片段的起始）后随链的第一个冈崎片段起始于先导链进入延伸之后

Φx174phage后随链的起始（负链合成、不连续合成）P117页

第七十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

Φx型引发体的组装以PriA识别引发体组装位点（primosomeassemblysitepas）开始，首先形成预引发体预引发体与引物酶结合形成了引发体Φx型引发体或其部分组分可沿单链

DNA移动到每一个冈崎片段的起点PriA提供引发体移动的动力第七十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

位于复制叉处的多酶复合体（引发体）必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段InlaggingStrand上多酶系统必须完成多次反复的启动与扩展

E.coli

启动2000—4000次的冈崎片段复制第七十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

（二）Φx174DNA的复制

a、SS→RF，

即以（＋）链为模板（－）链的合成

Φx型引发体起始后，由DNApolⅢ、Ⅰ和连接酶等协同合成（后随链的起始过程）b、多拷贝RF的合成（滚环复制）

（先导链的合成过程、后随链合成）c、后代单链（SS）DNA的合成,即以RF的(－)链为模板，合成(+)链，先导链的合成（DNA复制过程是上一过程的一部分）第七十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第七十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

A蛋白（gpA）：

♦

Φx174基因A的产物

♦结合到RFⅠDNA的复制原点的结合位点（引发体的帮助）

♦诱导相邻的识别位点的熔解(富含A/T)♦其核酸内切酶活力切割（＋）链的4305与4306碱基的酯键，并共价连接于5’端（A），另一端为自由的

3’－OH（G）Rep蛋白－－解旋酶

第七十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第八十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五复制体第八十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五复制叉处的复制体

（三）前导链和后随链的协同合成聚合酶Ш全酶前导链后随链螺旋酶引发体引物引发酶活性中心一活性中心二PriA清除SSB提供引发体移动动力极性3‘→5’第八十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五一分子的DNApolIII.协同合成前导链和后随链第八十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

四、复制终止

1、环形DNA复制的终止

a、终止序列

E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白

序列一：terEterDterA

序列二：terFterBterC

每个区域只对一个方向的复制叉起作用第八十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第八十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

b、专一性终止蛋白

E.coli中由tusgene

编码

（terminusutilizationsubstance）

通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用每次复制时只使用一个终止位点ter第八十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五第八十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五2、细菌(E.coli)DNA每个细胞周期只复制一次第八十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

3、线性DNA的末端复制的问题第八十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五?环状DNA复制是否存在这样的问题,为什么?第九十页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（1）线状DNA的复制5’末端短缩的解决模式

a、从开始就采取环化的形式－－－λ噬菌体

b、象T7噬菌体一样采取连环分子的形式

利用自身线性DNA末端的重复序列－－通过末端互补形成连环分子

c、最直接的办法－－－引入蛋白质直接从末端起始复制如－－－腺病毒－2、phageΦ29、脊髓灰质炎病毒

d、痘病病毒的末端由发夹结构连接

复制完成后错切连接第九十一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五??二聚体3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHT7噬菌体的末端复制专一性核酸内切酶第九十二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

腺病毒（Adnovirus-2）DNA的复制

35937bp

TP

C

G

IR103-162

IR;包括50bp的复制原点、富含A/T、有一个高度保守的G／C对pTP;末端蛋白的前体

80kd→

TP55kdSSB;单链DNA结合蛋白

72kdAd2DNApolymerase;

140kd

第九十三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五复制起始复合体引发复制（不需引物）

避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMP

CG●过程

SSB+ATPDNA末端解链

TPpTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OH第九十四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五腺病毒DNA复制起始G第九十五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五IRIR长的发夹结构

痘病病毒末端复制的解决方式－－－－P122第九十六页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

五、复制忠实性的保证

1、DNApol的3’5’外切酶活性

(exonucleaseactivity)

2、DNApol只能从引物的3’

端延伸DNA

（需要RNA引物）

a、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高，且不易校正

b、RNA引物最终被降解而避免错误

3、后随链的不连续合成因其有利于错配碱基的校正第九十七页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

3.6.真核生物DNA的复制(DNAreplicationinEukaryote)

第九十八页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

1、复制概况

a、多个复制元（multiplereplicon

），双向复制

b、复制元相对较小(13-900kb),

复制速度较慢,大约

500~5000bp/min

（3000bp/min）

冈崎片段100～200NTc、复制终止通过复制叉的相遇而终止第九十九页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五multiplereplicon

例；果蝇5000replicons平均40Kb（酵母）哺乳动物平均100Kb第一百页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

2、真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五种

位置核内核内核内核内线粒体

合成

与引发修复合成合成,修复复制功能酶结合前导链

后随链3’－5’校NONOYesYesYes正活性

α

β

δ

ε

γ第一百零一页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

真核生物DNA复制的引发酶●DNApolα+primase形成紧密的复合物

6-9NtRNAasprimer

●引发酶（primase）：50-60kd

●作用方式为阵发性的，每次作用拷贝6～15个核苷酸

●既能利用rNTP，又能利用dNTP

●SV40体外DNA复制情况分析

第一百零二页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

ε

δ第一百零三页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

3、真核生物的复制起始受许可因子的控制4、逆转录酶自学（P127）第一百零四页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五

5、真核生物染色体DNA末端补齐模式

(1)端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含G链)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(富含C链)

第一百零五页，共一百一十三页，编辑于2023年，星期五（2）端粒酶（

Telomerase）1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling四膜虫端粒酶

（telomerase）将T2G4

末端重复延伸游扑虫

Telomerase=RNACAAAACCCC

链+

末端结合蛋白（TBP）端粒酶－－－逆转录酶a、核蛋白（ribonucleoproteinRNP）b、含