分光光度法新

分光光度法新第一页，共六十一页，编辑于2023年，星期五第九章吸光光度法学时数：6学时第二页，共六十一页，编辑于2023年，星期五第九章吸光光度法(Spectrometer)9.1吸光光度法的基本原理

1物质对光的选择性吸收2光的吸收基本—朗伯比尔定律定义3偏离比尔定律的原因9.2目视比色法及光度计的基本部件

1目视比色法

2光度计的基本部件9.3显色反应及显色条件的选择

1显色反应的选择2显色条件的选择3显色剂4三元络合物在光度分析中的应用特性简介9.4吸光度测量条件的选择

1入射光波长的选择2参比溶液的选择3吸光度读数范围的9.5吸光光度法的应用1高含量组分的测定—示差法2多组分分析3光度滴定4酸碱离解常数的测定5双波长分光光2023/5/253第三页，共六十一页，编辑于2023年，星期五作业:P271:1、2、4、5、9、10、132023/5/254第四页，共六十一页，编辑于2023年，星期五前言基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。包括比色法、可见分光光度法及紫外分光光度法等。比色法(Colorimetey)：比较颜色深浅来测定物质浓度的方法。分光光度法(Spectrophtometer)：应用分光光度计来进行比色分析的方法。（又称吸光光度法）分光光度法特点：1

灵敏度高：达10-5～10-6

mol/L。适用于微量组分的测定。2

准确度高：相对误差为2～5%，满足微量组分测定的要求。3速度快、仪器操作简单、价格便宜。4应用广泛:①分析对象有无机物质和许多有机物质的微量成分。②用于化学平衡等理论的研究。2023/5/255第五页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.1吸收光度法基本原理

(BasicPrincipleofSpectrophotometer)10.1.1光的基本性质光的电磁波性质射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光2023/5/256第六页，共六十一页，编辑于2023年，星期五光的波粒二象性波动性粒子性E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J,焦耳）：光子的频率（Hz,赫兹）：光子的波长（cm）c：光速（2.99791010

cm.s-1）h：Plank常数（6.625610-34

J.s焦耳.秒）2023/5/257第七页，共六十一页，编辑于2023年，星期五单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿2023/5/258第八页，共六十一页，编辑于2023年，星期五表1物质颜色与互补光颜色的互补关系物质颜色（透射光）吸收光颜色波长/nm黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿紫蓝绿蓝蓝绿绿黄绿黄橙红400～450450～480480～490490～500500～460560～580580～600600～650650～7802023/5/259第九页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.1.2物质对光的选择性吸收(SelectivityAbsorption)物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光2023/5/2510第十页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生反射、散射、吸收或透射。如下图，如被照射的是均匀溶液，则光的散射可以忽略。

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————界面反射损失入射光束透射光束界面反射损失溶液散射损失2023/5/2511第十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期五物质对光吸收的本质一束光能量分子+hν(原子)M+hν=M*(基态)(激发态)

分子(原子)(离子)基态能级1能级2能级3hν2(ΔE)hν3λ3λ2hν1λ1

仅当照射光光子提供的能量(hν)与被照物质的基态与激发态能量之差ΔE相等时才能发生吸收。不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。所以物质对光的吸收具有选择性。ΔE=hν物质或溶液2023/5/2512第十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期五吸收光谱或吸收曲线(absorption,spectrum)

固定被测物质的浓度和吸光厚度，在不同的波长处测定其吸光度。以吸度为纵坐标，以测定波长为横坐标作图，即为吸收曲线。定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收

不同物质吸收光谱不同相同物质吸收光谱相同ABA在一定条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。一定的物质，浓度增加，λmax不变，吸收程度成比例增加AC增大2023/5/2513第十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期五吸收光谱AbsorptionSpectrum纯电子能态间跃迁S2S1S0S3hE2E0E1E3S2S1S0hAhhh分子内电子跃迁带状光谱锐线光谱A2023/5/2514第十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期五(a)(b)(c)(d)220240260280

nm

A0000(a)联苯(己烷溶剂)；一些典型的紫外光谱(b)苯(己烷溶剂)；(c)苯蒸汽；(d)Na蒸汽。2023/5/2515第十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.1.3光的吸收基本定律—朗伯-比尔定律A：吸光度；I0：入射光强度；I：透射光强度；k1

：比例常数；b：液层厚度（光程长度）

1729年，Bouguer首先发现物质对光的吸收与吸光物质的厚度有关。1760年他的学生Lambert更明确地指出：如果溶液的浓度一定，则光的吸收程度与液层的厚度成正比，这个关系称为朗伯定律。表示为：

一、吸光度(absorbance)入射光I0透射光Ib2023/5/2516第十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

1852年，Beer指出：光的吸收与吸光物质的数量有关；如吸光物质溶于不吸光的溶剂中，则吸光度与吸光物质的浓度成正比。即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。这个关系称为比尔定律。式中c：有色溶液浓度k2：比例常数2023/5/2517第十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

a-为吸光系数，单位为L/gcm,b单位cm,c单位g/L。

κ-为摩尔吸光系数，单位为L/mol.cm,c单位为mol/L两项合并得：朗伯-比尔定律κ与a的关系式中M为物质的摩尔质量。经研究：当一束单色光，通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，其吸光度与吸光厚度和物质浓度成正比。κ是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于1mol/L吸光物质在1cm光程中的吸光度，是吸光物质吸光能力的量度。它可作为定性鉴定参数，也可反映方法灵敏度。测定波长不同时，κ不同。2023/5/2518第十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期五二、透光度T(transmittance)吸光度与透光率的关系T：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%2023/5/2519第十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期五四、工作曲线

工作曲线又称标准曲线或较正曲线。绘制时先配制一系列具有不同浓度吸光物质的标准溶液，然后在确定的波长和吸光厚度(光程)等条件下，分别测量其吸光度。以吸光度A为纵坐标，标准物质的浓度c为横坐标作图，即为工作曲线。AccxAx在多组分体系中，如果各种吸收物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和。三、吸光度的加和性：2023/5/2520第二十页，共六十一页，编辑于2023年，星期五例：Fe(II)的质量浓度为5.0×10-4g/L的溶液，与1，10-邻二氮杂菲反应，生成橙红色配合物。该配合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.19。计算1，2-邻二氮杂菲亚铁的

a和κ解：已知c=5.0×10-4g/L,

A=0.19,MFe=55.85或：2023/5/2521第二十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.1.4偏离朗伯比尔定律的原因实际测定时，标准曲线往往不成直线，如图4，发生正偏移或负偏移，这种现象称为对朗伯-比尔定律的偏移。一、物理因素L—B定律基本假设：入射光为单色。实际上仪器发出的入射光是波长范围较窄的光带组成的复合光。设由λ1和λ2两束光组成，其吸光度分别为A’和A”对λ1对λ2偏离的原因有：1非单色光引起的偏离2023/5/2522第二十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

测定时入射光的总强度为(I’0+I”0）,透射光的总强度为(I1+I2)，因此所得吸光度值为：将I1和I2代入得：可见，κ1=κ2

时，A=κbc，A与c成直线关系。如果κ1≠κ2，A与c则不成直线关系。κ1，κ2差别愈大，A与c之间的线性关系偏离也愈大。2023/5/2523第二十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

尽量选取吸光度随波长变化不大的谱带A的复合光进行测量，则A随波长变化小，κ的变化小，引起的偏离小，A与c基本为直线。若选用谱带B的复合光进行测量，κ的变化大，A与c的线性关系也差。选取谱带A处作入射波长，还可保证吸光度最大，灵敏度最好。故在选用入射光波长时，我们应考虑：2023/5/2524第二十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期五2、非平行入射光引起的偏离

朗伯-比尔定律要求入射光平行垂直入射。若入射光束为非平行光，可能导致工作曲线产生正偏离。bb’3、介质不均引起的偏离

朗伯-比尔定律要求吸光物质溶液：均匀的、非散射的。若溶液不均，如产生胶体或浑浊，当入射光通过该溶液时，除了一部分光被吸收外，还有一部分因散射而损失，使实测的吸光度偏高，从而使工作曲线产生正偏离。2023/5/2525第二十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

L-B定律的基本假设要求溶液中吸光质点是独立的，彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。高浓度时(>0.01mol/L)，由于吸收组分粒子之间的平均距离减小，相互影响邻近粒子的电荷分布，使吸光能力发生变化。即改变物质的摩尔吸光系数(κ)。

其相互作用的程度与浓度有关，浓度增大，吸光度与浓度之间的关系偏离线性关系越大。所以一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。二、化学因素引起的偏离1、高浓度引起的偏离2023/5/2526第二十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期五Cr2O72-+H2O=2H++2CrO42-（橙色）（黄色）

L-B中浓度(c)应指吸光物质的平衡浓度，即吸光型体的平衡浓度。实际常用吸光物质的分析浓度。只有当平衡浓度等于或正比于分析浓度时，其吸光度符合比尔定律。但溶液中吸光物质常因缔合、离解、互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相互作用等而形成新的化合物或改变吸光物质浓度，这些都将导致偏离比尔定律。如2、化学反应引起的偏离2023/5/2527第二十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.2目视比色法及光度计的基本部件c1c2c3c4以眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法，称为目视比色法。常用的目视比色法是标准系列法比色管优点：设备简单，操作简便，不要求有色溶液服从比尔定律，广泛用于准确度要求不高的常规分析中。缺点：准确度不高，如溶液中存在第二种有色物质，无法测定。许多有色溶液不稳定，标准系列不能久存，经常用时配制，麻烦。cx一、目视比色法2023/5/2528第二十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期五二、光度计及基本部件两种方法的测定原理相同，只是获得单色光的方法不同，前者用滤光片，后者用棱镜或光栅等单色器。由于两者均基于吸光光度测定，统称为光度分析法。国产分光光度计类型主要有：72、721和725型。其主要部件和光路示意图如下。光源单色器吸收池检测系统参比池光电比色法：使用光电比色计测定溶液A进行定量分析的方法分光光度法：使用分光光度计测定溶液A进行定量分析的方法2023/5/2529第二十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期五2023/5/2530第三十页，共六十一页，编辑于2023年，星期五比色池盒2023/5/2531第三十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期五紫外可见分光光度计2023/5/2532第三十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

光度计的基本部件和光学示意图123456789101112图672型分光光度计光学系统图

1-光源2-进光狭缝3-反光镜4,7-透镜5-棱镜8-出光狭逢9-比色皿10-光量调节器11-硒光电池12-检流器2023/5/2533第三十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期五各部件的作用及主要性能1光源可见光区：使用钨灯，加热到白炽时发出波长约为320～2500nm的连续光谱。光强度与温度成正比，一般工作温度为2600～2870K(熔点3680K)。温度与电源电压有关，电压稳定，光强度稳定。近紫外光区：使用氢灯或氘灯，产生180～375nm连续光谱。2023/5/2534第三十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期五将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。由棱镜或光栅等单色元件及狭缝和透镜组成。2

单色器棱镜

棱镜单器由棱镜、透镜和狭缝组成。单色的纯度决定于棱镜的色散率和出射狭缝的宽度。玻璃棱镜对400～1000nm波长的光色散较大，适用于可见光分光光度计。光栅

光栅是利用光的衍射和干涉原理而进行分光作用。具有色散均匀、工作波长范围宽、分辨率高等特点，一般用于中高档仪器中。2023/5/2535第三十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期五滤光片三棱镜分光2023/5/2536第三十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期五各部件的作用及主要性能3吸收池有玻璃和石英两种。可见光区：用无色透明、耐腐蚀的玻璃比色皿；紫外光区：用石英比色皿。其厚度分别为0.5、1、2、3cm的长方形或园柱形。2023/5/2537第三十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期五4检测系统测吸光度时，透过比色池的光强度先转为电流，这种光电转换器件称为检测器。要求检测器对测定波长范围的光有快速、灵敏的响应。且产生的光电流与光强度应成正比。光电比色计及可见光分光光度计常使用硒光电池或光电管作检测器，采用检流计作读数装置，两者组成检测系统。123e-e-+—e-4图7硒光电池示意图1-Fe片2-半导体硒3-金属薄膜4-入射光线常用硒光电池，如图7。一般可产生10-100μA光电流。电流大小与照射光强度成正比。长时间强光照射时，会产生“疲劳”。具有坚固、价廉和无需外接电源等优点。光电池由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空二极管。阴极表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏材料，有足够能量光子照射时，能发射电子。当两极间有电位差时，有电流。其大小与光照强度有关.为光电池的1/4.光电管光电二极管阵列2023/5/2538第三十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期五三、分光光度计的类型单色器参比池R样品池S检测器光源1单光束单色器RS检测器λλ光源2双光束I0It单色器单色器样品池检测器λ1λ2光源λ1λ23双波长2023/5/2539第三十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.3显色反应及显色条件的选择9.3.1显色反应的选择待测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应。与待测组分反应形成有色化合物的试剂叫显色剂。

显色反应可分为两大类：络合和氧化还原反应。前者是主要的。1.灵敏度高

一般κ为104～105时，可认为反应较灵敏。2.选择性好

显色剂仅与一个组分或少数几个组分反应显色。3.显色剂在测定波长处无明显吸收

通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为“对比度”，一般要求显色剂与有色化合物的对比度Δλ在60nm以上。显色剂应具备条件:4.

反应生成的有色化合组成恒定，化学性质稳定2023/5/2540第四十页，共六十一页，编辑于2023年，星期五1显色剂用量图8吸光度与显色剂浓度的关系Mo(V)与SCN-反应情况就如图8(3)。9.3.2显色条件的选择

M+R→MR

（待测组分）（显色剂）（有色络合物）2023/5/2541第四十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期五2酸

度

酸度改变引起平衡移动，影响显色剂及有色配合物的浓度，还可能引起配位基团(R)数目的改变，从而改变溶液的颜色。酸度还与金属离子水解有关。适宜酸度范围是通过实验来选择的。3显色温度显色反应一般在室温下进行，有时加热可使显色反应完全，一般是通过实验找出适宜温度。4显色时间大多数显色反应需要一定时间，时间长短有时与温度有关，一般可由吸光度—时间关系曲线得到。R-+Mn+=MRn+H+HR显色剂有色配合物ApH吸光度与pH值关系At吸光度与时间关系2023/5/2542第四十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期五

光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。消除方法：(1)加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色络合物或无色离子。(2)选择适当的显色条件以避免干扰。(3)分离干扰离子。(4)可选择适当的光度测定条件(波长和参比)，消除干扰离子的影响。5、干扰的消除2023/5/2543第四十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.3.3显色剂无机显色剂与金属离子生成的配合物不稳定，灵敏度和选择性不高，应用不多。

与金属离子可形成螯合物，显色反应的选择性和灵敏度都较无机显色反应高。研制高灵敏度和选择性的显色剂仍是吸光光度法研究中的重要课题。有机显色剂一般都含有生色基团和助色基团。

生色基团是指某些含不饱键的基团。如偶氮基(-N=N-)、醌基、亚硝基(-N=O)、硫羰基(=C=S)等基团。助色基团是某些含孤对电子的基团，如-NH2、-NR2、-OH、-OR、-SH、-Cl及-Br等，影响生色基团对光的吸收，使产物的λmax向长波方向移动，颜色加深。这种现象称为“红移”。其影响见表3。有机显色剂表3铁（III）与有助色团和无助色团的有机试剂反应所得产物颜色的比较2023/5/2544第四十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期五有机显色剂的类型1。偶氮类显色剂：分子中含有偶氮基。这类化合物都是有色的。具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点。是目前应用最为广泛的一类显色剂。如偶氮胂III和PAR。

偶氮伸III

偶氮胂特别适合于铀、钍、锆等元素总量的测定。其衍生物偶氮氯膦III是我国目前广为采用的测定微量稀土元素的较好的试剂。

PAR在不同条件下，与很多金属离子生成红色或紫红色的络合物，如用于银、Hg、Ga、U、钢铁中的铌、钒、锑等元素的比色测定。也应用于三元配合物。PAR：4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚2023/5/2545第四十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期五铬天青S结构式2。三苯甲烷类显色剂：这是一类应用很广的分析试剂，种类很多。铬天青可与许多金属离子形成三元配合物，用于吸光度测定，常用来测铍和铝。2023/5/2546第四十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期五多元配合物及应用特性简介特性1、比较稳定，可提高分析测定的准确度和重现性。2、对光有较大的吸收容量，进行光度测定时，它比二元络合物具有更高的灵敏度和更大的对比度。3、形成三元配合物的显色反应比二元体系具有更高的选择性。多元络合物是三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配体所形成的三元络合物。1、三元混配配合物2、离子缔合物3、金属离子-络合剂-表面活性剂体系4、杂多酸其主要类型2023/5/2547第四十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.4吸光度测定条件的选择一、入射光波长的选择原则：1、最大吸收λmax2、吸收最大，干扰最小Aλ配合物显色剂λmax配合物显色剂二、参比溶液的选择测定时，用参比溶液调节仪器零点，可消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。参比类型：1、纯溶剂作参比。(只有待测物质与显色剂的反应产物有吸收)2、试剂空白作参比。(除试样外的其它溶剂)3、试样溶液作参比。(显色剂无吸收，试样中其它组分有吸收，但不与显色剂反应)此时通过参比溶液的透射光2023/5/2548第四十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期五三、吸光度读数范围的选择0204060801000.10.30.200.50.41.00.6∞1.5AT在不同吸光度范围内读数对测定带来不同程度的误差。可推证如下：设试液服从比尔定律，微分，得：(2)/(1)，整理后得：以有限值表示，可写为：(2)(1)式中：Δc/c表示浓度的相对误差;ΔT表示透光度的读数误差.即浓度的相对误差取决于透光率的读数误差ΔT和透光度T的大小。2023/5/2549第四十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期五假设ΔT为常数，上式可以写为：当T=36.8%时，A=0.434时测量误差最小。百分透光度在10～80%（即A在0.1～1.0）范围内的ΔC/C比较小。因此测定时应使被测试液的吸光度在此范围内才能得到较好的结果。ΔC/C与T的关系ΔC/C0.368T2023/5/2550第五十页，共六十一页，编辑于2023年，星期五9.5吸光光度法的应用主要用于微量组分的测定，也用于高含量组分的测定、多组分分析及化学平衡、络合物组成等理论研究。一、高含量组分的测定——示差法方法原理：若测定试液浓度为(Cx)，用稍低于试液浓度的(Cs)标准溶液作参比溶液，调节仪器透光度读数为100%（A=0)，然后测定其吸光度(Ar)(相对吸光度)，对应的透光率称相对透光率(Tr)，则有：示差法要求：仪器光源有足够的发射强度或能增大光电流放大倍数,以便能调节参比溶液透光率为100%。100%T%Tr%TS%普通光度法示差光度法Tx%2023/5/2551第五十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期五二、多组分分析

(1)吸收光谱不重叠，或至少可以找到某一波长时X有吸收而Y不吸收，在另一波长时，Y吸收而X不吸收。如图12-1，可分别在波长λ1和λ2时，测定组分X和Y而相互不干扰。(2)吸收光谱重叠：找出两个波长，在该波长下，二组分的ΔA较大，如图12-2，在波长λ1和λ2时测定吸光度A1和A2，由加和性得方程式：解方程可得：cx和cy假定溶液中同时存在两种组分X和Y，它们的吸收光谱一般有如下两种情况：2023/5/2552第五十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期五三、络合物组成及稳定常数的测定1、摩尔比法M+nLMLn固定Cm，逐渐增加CL，测定一系列Cm一定、CL不同的溶液的吸光度A。以A为纵坐标，CL/

Cm为横坐标作图。

当CL/CM<n

时，A不断提高。当CL/CM>n时，A不再改变。两条切线的交点所对应的横坐标CL/CM比值为n，则络合物的络合比为1:n。122023/5/2553第五十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期五2、等摩尔连续变化法方法原理：保持(cM+cR)一定，连续改变cR/cM，配制出一系列显色溶液，分别测定系列溶液的吸光度A，以A对cM/(cM+cR)作图(下图)。曲线的折点所对应的cR/cM值就等于络合物的络合比n。当络合物较稳定时，曲线的折点明显，反之，则应用切线外推法得到折点。适合于络合比较低，稳定性较好的络合物组成的测定。1.00.80.60.40.20.0

此法还可测定络合物的离解度α。B点对应的吸光度A相当于配合物完全不离解时溶液的吸光度A，由于络合物部分离解，对应的吸光度为A’，其离解度计算为：M+nRMRn2023/5/2554