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文档简介

基因工程

田长恩Tel因工程1基因工程概论2天然DNA的制备3分子克隆工具酶4分子克隆载体5表达载体6PCR技术及其应用

7目的基因的制备8基因克隆的筛选策略10细菌基因工程

11酵母基因工程12植物基因工程13动物基因工程14基因工程的安全9转基因及其表达10.1大肠杆菌基因工程10.1.1对载体的要求10.1.2策略克隆表达10.1.3对宿主的要求10.2其他细菌基因工程10.2.1其他革兰氏阴性菌基因工程10.2.2革兰氏阳性菌基因工程10.2.3链霉菌基因工程10细菌基因工程CloninginBacteriaWhatdoweneedforcloninginbacteria?Vectors,hostcellsandtechniques10.1大肠杆菌基因工程10.1.1对载体的要求Originofreplication(复制原点)Relaxed(松弛性)plasmidori:ColE1/pUCori(tomakecopiesofclonedDNA);Stringent(严谨性)plasmidori:pSC101.Episome(附加体)canreplicateandbeinheritedstabilitywiththereplicationofhostchromosome(染色体).Payattentiontoincompatibility(不相容性)oftwoplasmidswiththesametypereplicon(复制子).

RecognitionBinding

SextamaboxPribnowboxStartsitefortranscriptionSDStartcode

16-19bp5-9bp10bp

3’–TTGACA———TATAAT———A/G……….AGGAGGT……….ATG-3’5’–AACTGT———ATATTA———T/C……….TCCTCCA……….TGA-5’

-35-10

PromoterandSDsequenceofprocaryote5’-UTRRibosomebindingPromoter(启动子)(Operator,操纵子)ManipulationUnitofgeneexpressioninE.coliNegativeRegulationofgeneexpressioninE.coliTerminator(终止子)Mostexpressionvectorsincorporateafactor-independentterminator(本征终止子)downstreamfromthesiteofinsertionoftheclonedgene.Selectablemarker(选择标记)Antibiotic(抗生素)resistance:ampicillin(Ap),kanamycin(Km),tetracycline(Tc),chloramphenicol(Cm),etc.MCS(多克隆位点)最好置于易于辨别的报告基因中10.1.2策略克隆

Usingrelaxedplasmidforcloningshortfragments;UsingthefollowingvectorsforcloninglargefragmentsofDNA:VectorHostInsertsize(kb)cosmidE.coli35–45P1phageE.coli70–100PACsE.coli100–300BACsEcoli≤300YACsS.cerevisiae200–2000kb表达

Factorsaffectingtheexpressionofclonedgenes:Promoterstrength:thestrongerthebetter;Transcriptionalterminator:asdescribedabove;Plasmidcopynumber:themorethebetter;Plasmidstability:episomispreferable;Host-cellphysiology:latelogphase;Translationalinitiationsequences:SD;Codonchoice:preferenceofcodon.PromotionofinitiationoftranscriptionStrongorcontrollablepromoterEfficientextensionofRNAAvoidanceofattenuatororadditionofanti-terminatorIncreaseofstabilityofmRNAAdditionofterminatorofpolyAsignalPromotion

of

translationAUG,UAA/UAG/UGA,SD:CCACCATGG,PreferenceofcodonIncrease

of

stability

of

proteinFusionexpression,Secretiveexpression,Preventionofinclusionbody,Deficientsystemofrestriction-modification,DeficientrecipientStrategiesforpromotionofgeneexpressioninbacteriaPromoterstrength:Thestrongpromoterandregulatable(可调控)promoterarepreferable.Currentlyweuseoneofthefollowingcontrollablepromoters:λPL,T7,trc(tac)orBAD.Controlofexpressionofchloramphenicolacetyltransferase(CAT,氯霉素乙酰转移酶

)inE.colibythreedifferentpromoters.PromoterUninducedlevelofCATInducedlevelofCATRatioλPL0.027528.181025T71.1415.4013.5trcThegeneforT7RNApolymerase(gene1)isinsertedintothechromosomeofE.coliandtranscribedfromthelacpromoterandwillbeexpressedonlyifIPTGisadded.TheT7RNApolymerasewillthentranscribethegeneclonedintothepETvector.Iftheproteinproductoftheclonedgeneistoxic,itmaybenecessarytofurtherreducethetranscriptionoftheclonedgenebeforeinduction.TheT7lysozymeencodedbyacompatible(相容的)plasmid,pLysS,willbindtoanyresidualT7RNApolymerasemadeintheabsenceofinductionandinactivateit.Also,thepresenceoflacoperatorsbetweentheT7promoterandtheclonedgenewillfurtherreducetranscriptionoftheclonedgeneintheabsenceofIPTG.StrategyforregulatingtheexpressionofgenesclonedintoapETCo罪nt娱ro巨l窄of阴c即lo颜ne历d粗ge衡ne凳e产xp倾re锯ss夕io毕n德us辅in命g衬th闸eλc惰Ipr罪om嚷ot偶erGe督ne桨o赏f湾in钉te破re忍stλcIre奋pr绪es困so发rPtr茶pPL色氨篇酸Co么nt释ro魔l驾of昆c稼lo剃ne傻d罚ge够ne风e替xp默re拒ss衰io默n独us床in从g半th爽eλc东Ipr里om扎ot区erλcIre巷pr屠es亿so夫rGe伴ne错o企f洪in拨te抢re烘stPtr疤pPtr自pRe傍gu艺la在ti俱on犯o煤f壁th勤epB扩ADpr逢om绢ot迟er杰.Th晨e属co嫌nf缠or绍ma如ti隐on灭al富c努ha检ng技es但t鲜ha讨t太ta怪ke花p腾la喝ce别o师n捕ad疾di麻ti贪on旗o家far务ab悔in患os基e.We减st器er建n碌bl械ot咳s回ho折wi挡ng唉t然he童i错nc谨re魂as驾e靠in孩s违yn浇th挑es遣is析o镇f芬a滑cl掠on虾ed辆g忠en勤e窃pr脑od锅uc罢t鞠wh逆en仔d刮if角fe跪re阴nt傍l念ev联el抖s险ofar秋ab元in思os灿ear床e准ad换de梳d誓to熊a叙c列ul袭tu令re构o费f亲th港e建ho陶st研c荐el绞l.Re放gu怎la备ti络on刷o位f哑th侨etr介c/铁ta着cpr先om蠢ot毯er烧.Th邪etr项c/爸ta统cpr贞om风ot期er孕s恭ar裕e荐hy恐br棉id睡o萌ne桶s滤de县ri戴ve趣d熊fr头omla东can笋dtr乡丰ppr阀om掏ot扎er芽s,僵a参nd猜c艘an山b愿e扯in轧du蒙ce妹d区by年l厚ac宗to孔se队a察nd触I足TP度G.乳T刮hi洽s秋ki饼nd凭s川of止v壮ec突to险rs泊c秆ar闻ryla注cOan音dla振cIge康ne忧.阿拉摆伯糖外源律基因何在大稿肠杆端菌表瓦达的慨形式包涵方体蛋贱白:表达歌产物稀在菌会中积乏累并冲致密子地聚礼集成决无膜以的存斯在于点胞质伐和细均胞周爽质的泥裸露翠结构驰。主众要由趁外源蛾基因委产物咏组成上,其礼氨基门酸序枣列正缴确,劣但空抄间构滩象错亮误,阿一般本缺乏恳生物趁活性殿;还咱含受搬体细任胞的映一些默表达胀产物积、DN居A、RN菊A和脂鹅多糖幕等。存包涵双体具其有较湿好的刃蛋白须酶抗张性、捐水溶棋性小次和密补度高偏,可炕离心仆分离前。融合芹蛋白村:将外搅源基购因与睛受体姿菌基铲因重抗组在仍一起尼,但牲不改琴变两枝个基因因阅唱读框犬而表迷达的蚁蛋白势。一自般受惊体菌替蛋白探位于N端,保外源沿蛋白草位于C端。凶融合歼蛋白派的表指达效准率较排高,乏稳定蛛性增臣加,谊具较正高的亚水溶炉性和贵一定籍的生唱物学卷活性滋。利屈用受捉体菌系蛋白荡的特循异性悠抗体种、配麻体或洁底物弊亲和工层析湾等分姓离纯众化融窝合蛋浊白,伐然后个再裂燃解融图合蛋看白间筒的肽岩键,烧可获闸外源最蛋白任。整合身表达默型外迹源蛋淹白:细菌秀中的做重组绑质粒推,传士代会颠丢失析。因董此,敏要将表圣达的疏外源喇基因赖整合率到染木色体红,使碧之稳梢定地尤遗传凝和表两达,路可通过DN设A同源色重组聋即“基因覆打靶鸣”实现王。分泌良型外圾源蛋眨白:外源确基因册的表幸达产漫物通绘过运铲输或跪分泌即的方福式穿过细无胞的勺外膜术进入清培养斥基。弊优点敞:简弹化纯字化工劫艺;滚减少了外术源蛋陵白酶舞解;摆利于怀形成湾正确踏的空鸭间构弯象。肉通常贯在N端加昌入由15~30个氨胳基酸东组成耳的信号剥肽(si丸gn戴al返p骗ep筋ti忍de)序列位。表面得展示歇:将转泛基因择的表腥达产筒物定扛位在冲宿主套表面嫂的基黄因工芦程技逆术Di洋su射lp军hi圣de瘦b败on选d(a订)挨Sc躺he禁ma狱ti示c讨re遍pr掘es展en签ta覆ti告on嘉o竿f惑su拳rf为ac腐e榴di济sp绩la般y.(b启)橡A赏ve名ct冷or爱u局se袭d零fo简r钥fa岗ci颤li期ta踩ti筋ng虫s灭ur笋fa慕ce臭d柔is址pl献ay雨.怜HA领,ha酬em滤ag希gl征ut液in忘inep辱it掌op抖e;c-渴my索c,c-贸my凤cep就it逆op京e.PeptidesequenceAntibodyrecognition-Glu-Gln-Lys-Leu-IleSer-GIu-Glu-Asp-Leu-Anti-mycantibody-His-His-His-His-His-His-COOHAnti-His(C-terminal)antibody-Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr-Anti-V5antibodyPe叠pt绑id授eep摧it薯op泽es(抗原子决定捎基),巷a忽nd喊t报he壁a梯nt拆ib泼od拿ie碌s激th妹at捐r孙ec池og纤ni做ze忙t棵he蒙m,秧f货or共u谅se北i垫n乌as锡sa小yi辣ng次f敲us蠢io扯n锯pr挽ot陕ei浙ns徐.Apo俊ly叹hi芳st汽id过in翼eta怀g斧at染t档he懒C浓t薯er啄mi司nu角s尺ca委n辩fu将nc侵ti尾on咱f泰orbo睁th追a顽ss绝ay步a草nd矮p盆ur悔if班ic丧at捧io狭nVe妄ct贤or氏s醉fo境r四ex光pr桑es鸦si均on深o希f蚊fu坑si鲜on意p末ro卵te话inIt脾i耀s洒cr违uc悟ia耗l死to甩k拿ee淹p骄th来e杜co困rr艳ec拼t各re鹅ad欠f匠ra秀me兰w袜he桥n俊co政ns纤tr默uc规ti布ng碍f仰us柏io亭n尸pr框ot盛ei另nTh旗re稠e茅di贼ff究er岗en寄t所va浊ri搂an渴ts显(熄A,旁B旺,宣C)毁a廊ll袋ow似t坊he碌i罗ns霜er殿t加to汗b圣e姜pl往ac场ed愁i侦n确ea漏ch饶o甚f记th慢e猎th覆re距e烂tr此an阿sl洒at屑io侵na虽l离re橡ad皇in盈g盯fr语am甘es阀.斩Th戚e衣se扒qu疾en摆ce竹h烛ea鞋vi包ly帆-s雀ha愉de瓜d葬sh赏ow穗s旨th怨e画ba壳se掉s依eq挠ue堆nc衰e辞wh限ic徐h取is存a呀lt睡er臂ed立i泳n绪ea朗ch具o摄f依th牲e尚th织re差e跌ve疲ct诵or多s.野T捕he甘l互ig象ht局ly朗-s抱ha望de乳d寸bo慰x脱(A五GA倦TC摩T)粱i阔s絮th翼eBg铸lII姜s界it叮e雕of逐t退hepo芦ly卡li必nk忘er.桂No匠te上t沸ha买t项th沃e涝in糖it苏ia默l脚A使re往si决du脆e衫of畅t储he奖r园es环tr拐ic瓦ti坝on香s孤it虹e啊is委a研t庄a悠di嗓ff平er馒en词t穗po链in误t睛in陆t串he属t有ri娇pl宵etco茅do误nin默e跪ac级h枣of布t浑he蛾t身hr谋ee安s凶eq气ue捐nc叠es组.ABCPu看ri五fi棍ca男ti满on旺o屠f采a医cl省on角ed倦g游en畅epr秒od额uc菜t烦sy昌nt适he战si地ze捕d漆as栗a票f撤us启io侍n仇to晚t沾hebi乏ot锦inca最rb连ox韵yl肌as准eca阔rr满ie担r纹pr刺ot岛ei荣n就(t守ag库).Ad丹di威ti建on盈o谢f兴a秒ta补g/卫ta宣gs今f厕ac沸il晚it腾at展es夹i脚so拍la游ti热on书a塘nd鄙p俘ur谈if米ic箩at泰io开n妥of迹p存ro剥du划ct牌o袄f辽cl掀on路ed暴g府en弹ePu次ri岛fi币ca委ti与on瞒o芝f陆a翻cl晕on券ed掀g西en所epr歇od裕uc总t粗sy俱nt仗he勿si掘ze轻d叫as倒a尸f声us矛io陪n该to浆t绪hebi踢ot纵inca标rb嗽ox票yl辅as核eca喝rr盛ie员r牙pr的ot买ei线n干(t季ag拣).Pi咸nP闷oi坚ntTMve狗ct萌or•岂Ex掉pr胸es肚si侄on缠i冈s踪蝶co敲nt密ro冶ll底ed恐b蚊y伯T7挡orta谜cpr就om山ot慨er辰.•廉So授me知o并f打th呀em买c钥ar妹ry灶a缴D比NA扑s振eq派ue犬nc裁e知sp椅ec毁if跃yi唉ng宾s冲yn随th饼es修is高o笨f鲁a狮si住gn财al芝p轻ep膊ti团de呼.•午Pr跟es膏en支ce壮o辟f题an腐M址CS尸a术dj衡ac谋en蹦t其to缓a通f太ac懒to赚r-Xacl报ea枣va扒ge缴s监it行e.•骑Sy务nt沃he蠢si管s咱of味a微n价N-垦te报rm肝in飞albi烘ot驴in卵yl厘at助edse倍qu死en毙ce饥t辰o伤fa堆ci乒li艺ta馆te妙p委ur篇if丘ic浮at澡io位n.•猪Th歉re泥e天di真ff车er产en崇t驾ve例ct辩or请s跨of旨e践ac始h码ty尊pe最p赢er女mi孤tt句in勺g说tr碗an德sl纪at廊io朗n气of造t蛙he段c更lo蓝ne位d鉴ge液ne蒜i蹈ns初er蛾t游in金e惊ac码h度of膨t饥he没t奔hr爷ee杀r村ea妨di窜ng郑f星ra铲me打s.•组Pr谎es倚en障ce耗o碌f兴a雪ph骄ag毒e坛SP临6谎pr企om贯ot们er偿d属is庄ta身l默to脖t榆he兄M悔CS谢t捞o纠pe胳rm淋it进t禾he色s汉yn若th蛮es舌is喜o息f婆RN络A资pr馋ob买es第c颈om帖pl窝em钩en走ta具ry巡寿t毅o领th艰e雀cl腰on活ed员g偿en改e.Se躲cr据et煮io终n搜Cl得on液in迈g藏Ve刃ct晋or10肆.1梦.3常用稼大肠想杆菌告宿主StrainGenotypePromoterBL21HsdS,galT7HMS174recA1,hsd,RrifT7M5219lacZ,trpA,rpsLλPLRB791W3110,lacIq,L8Lac,tacRe巾ci旺pi云en缺tsh杰ou沫ld吼b处e鸽de尸fi革ci酒en咽t铅in眠r坝es礼tr姑ic需ti份on枕-m经od搬if盲ic筐at吊io趴n喷sy黑st魔em甚a仗nd锋d带o件no河t久pr租od盛uc前e判to甲xi冶c丧pr哲od踏uc揭ts阿.10盖.2其他表细菌喘中的绒克隆Mo亏st背c膛lo谷ni抓ng晶e月xp是er虑im渠en铅ts剪a高re拐c蒜ar拆ri孙ed息o沟ut局w核it躲hE.久c堵ol肚ias震t挺he己h歌os概t,绵a携nd浑t鸦he飘w烤id锋es暂t舍va少ri我et管y同of蕉c璃lo弯ni沾ng旱v拼ec籍to特rs维a墨re爪a粗va亏il嚼ab牌le纷f橡or腔t抹hi斤s险or挽ga鲜ni部sm懂.E.液c圾ol译iis迎p掏ar楚ti层cu似la肾rl球y达po辽pu侧la贴r赏wh扩en漂t羡he吧a企im略o所f道th齐e元cl桃on论in骑g诉ex喊pe熊ri偏me设nt物i侄s吨to匠s惑tu舍dy所t何he旦b遭as品ic会f启ea吹tu低re其s多of脊m纪ol漠ec北ul惊ar范b勿io傍lo别gy市s展uc浑h碗as姥g廊en怪e遭st口ru召ct退ur赢e网an草d输fu碧nc脏ti威on肾.Ho酬we篮ve袭r,揉w代he昼n兆th陵e镇ai某m短is第n勺ot喊t缘瑞o新st滔ud缘瑞y兆a蚊ge烫ne收,载bu踢t扫to塘c犯on葵tr步ol眼o芬r妹im铸pr炊ov箩e嘴sy掌nt夜he泼si影s属of割a口n杂im海po利rt盖an岭t售me踩ta争bo挽li码c含pr锹od冤uc油t添(e酒.g村.故in肿su经li我n)抖,贪or嘉t钳o输ch跪an市ge盆t挠he拒p谜ro筝pe军rt放ie陈s碗of幼t麻he劝o忘rg洪an递is央m津(e虹.g何.顽to凤i清nt衣ro盾du要ce油h惯er鞋bi肠ci厕de而r秒es裕is塘ta课nc列e厌in贸to记a蚂c川ro城p),ot汁he佣r倒or页ga航ni连sm渔s赵sh熔ou旋ld规b滩e足tr蒜an靠sf比or谋me扬d.讨Be胞ca蒸us亏e棚it安l唉ac视ks含s殿om幅e叶au刚xi横li太ar轨y嚷(辅助镇的)草bi子oc补he羊mi稿ca落l塔pa粮th翠wa茧ys狗t崖ha刷t谨ar近e滨es舒se珍nt剖ia谜l并fo蔽r高th横e维ph床en咳ot泼yp禁ic饥e仁xp垫re浴ss液io周n倦of泰c泄er炕ta册in雨f躺un监ct雪io括ns秋,忧e.摊g.梅d板eg险ra醉da拴ti喇on化o染f金ar奔om该at推ic君c昌om日po裤un泼ds趣,尺an通ti亮bi竞ot丧ic衬s止yn祖th宝es坟is担,pa嗓th眼og钻en肉ic醋it测y,鸽et四c.太I贿n猫su顾ch快c俱ir兄cu赖ms必ta堵nc厘es柴,馆th钱e夕ge递ne悬s怠ha飘ve帝t虎o壁be蹲c艳lo疤ne常d望ba物ck挥i捎nt帽o唱sp狠ec盈ie涛s从si岁mi辽la担r浇to雷t被ho神se扣w鸣he偷nc速e朝th摩ey坡w产er唤e鼠de级ri康ve反d.秤W全e轧th核en罪c笛on话si洲de跨r惯cl叫on冲in瞎g膛ve泉ct较or步s隶fo酒r推or型ga愚ni纪sm跌s台ot踩he券r托th备anE.桥c到ol溉i.Ge晨ne丢ra街ll速y,浪w浙e重co熄ns需tr横uc迷t脱sh半ut愤te冒r朽ve胳ct锋or材t氧o浴am鱼pl匠if借y介ta垫rg铺et巩g匠en懒e夕inE.江co施lifi爹rs或t,横a罢nd捧t普ra及ns钥fe撇r士ve治ct拉or眼i脏nt尿o命ot局he喂r原ho古st牵c狼el骡l过to膊p裳ro走du歪ce饺t药ar袍ge房诚t息pr湿ot桥ei食n建th如en伸.Cl辽on辱in栗g加incy捐an帽op宏hy蹲ta(bl弃ue柏-g堵re凯en恐a仅lg翼a,蓝绿跟藻)Sy伶ne浑ch梢oc骨oc处us(球们藻):图PC供C6钞30估1,卖P已CC谱79摸42泽,筐PC捎C7弊94柴3,杯P以CC使70娱02林,它P谊CC拨73期60书9,泉P进CC词N施KB闷G地04似29凉02湾-Y吸Gl单ll尊6;Sy施ne条ch乓oc窝ys煎ti赞s(集明胞藻):避PC餐C6忽71稍4,疤P戒CC餐63弓08腿,跳PC孝C6伶80沟3,演P困CC疲69愚06怨;An错ah路ae镜na(鱼战腥藻)PC扯C7驼12芬0;Sp陈ir乱ul所in亡a(钝踏顶螺芹旋藻)ec廉t.Go昨od乏f溜ea利tu笋re今s精as掌h俊os穗t缺ce原ll臭:ea馆sy浊t扇o幻玉tr隙an蠢sf掌or桃ma化ti穿on闭;ph予ot宏os掠yn倒th安et何ic遍al跪lyau导to富tr给op规hi航c老or鉴ga吗ni坐sm(光赵能自疤养生抵物);酬he荐al场th陆y耕fo死od10秀.2青.1其他验革蓝膜氏阴鞭性菌缠的基碰因工谢程Ca质MV枣35唇S朵pr牺om夺ot万errb捏cSte挤rm闻in跳at准orVe耗ct易or粥t歇o乔tr折an卵sf静or鸽m述bl习ue柴-g信re首en傍a刻lg主aHo别mo受lo劣go屠us闯s河eq移ue甘nc撤eHo轨mo答lo迟go银us遮s竹eq役ue章nc尺eA析ge质ne辨t唯ar旋ge爽ti宗ng壶v帐ec烦to壳r歉f顾or柏b狸lu虎e-踏gr艰ee珍n蛙al庙ga10播.2高.2革蓝恒氏阳辞性菌灾的基依因工悉程Cl辜on吊in译g辆inB.Su厦bt此il遣is(枯翻草芽雅孢杆忍菌)Go黎od曲p怒ro寻pe患rt野ie泻s衔fo载r街ge猾ne驴e瞧xp拆re匀ss姿io鸡n:se碍cr谁et厘iv恼e必ex脆pr楼es炉si荡on刻;差ea素sy僻t申o菌tr晶an麻sf亭or棒ma调ti渡on充;石To幅xi烈n-酒fr均ee孝a绕nd仍n门on班-pa果th庆og今en瓣ic(致筒病性魄);稿ea兽sy扑t毫o义cu航lt案ur孩e持an槐d栗ra签pi勿d胡gr信ow类th派;Wi押ldtp蓝yeB.su嚼bt毒il歼isse垮cr榴et管spr腥ot稀ei匹na营se(蛋炊白酶参)ou爷t呼of瞎c冶el它lan动d垒he星nc灯e橡in继fl鼻ue北nc厦e稿st晴ab梦il屠it蒸y导of锻p助ro椒du送ct劫s律oftr荷an随sf低er晃edge央ne蚂,湖th册er威ef锅or纺e控mu吗ta专nt杜i扔n落re嗽la氏te属d惰ge蜂ne陡i住s尊pr己ef菌er糕ab仔le照.Ve持ct责or翁S款iz度e/野kb索m沫ar虎ke天r登Co换py宜n残um戒be档r影Ty横peCl栏on尸in生gCl塑on版in醉gCl罚on陆in著gSh饼ut卧erIn睛te悬gr裤at厘io笛nIn倍te搁gr念at城io络nEx储pr忽es简si牺onEx缸pr希es闲si张onEx勉pr君es痒si伪onEx由pr蹦es橡si忍onCl蜓on笋in融g斤ve饼ct岸or知s荡inB.Su休bt愈il统isE.婚co芝li-B.窑su级bt趴il像isSh捞ut旱te叹r锣ve皱ct钟or步sA墙ty吸pi袋ca信lpM仍UT疯INve殃ct乎or要.Th霞eEmR,la懂cIan弄dla减cZge稻ne娱s方ar怀e撕ex罗pr宣es壶se球d饿inB.su令bt苦il赔isan娱d岗th揭eApRge引ne赶i尽s姐ex告pr迷es射se辅d尸inE.鬼c毒ol腥i.‘Te齿r’艰:呀te萍rm臂in罗at延or住;延‘O既p’晶:La葱cIop巨er拦at面or慈.In耳te究gr钻at暮io等n倾ofpM鸡UT辉INin叮to籍a膨t堂ar洽ge惠t努ge拉ne激.Gr飘ay辆b挺ox津c腾or饺re呢sp疲on暑ds旦t箩o本th厘e顿in乏te白rn四al失s岸eg杂me壳nt衣o旬f掘th兰e担ta匆rg筛et绒g根en保e.浅T扑he例v奇ec快to搁r伞is堵i腥nt预eg法ra理te躺d谎inor厌f2by内a另s盏in收gl责ecr泄os鹿si赔ng能ov堆erev鲁en聋t.In垮se防rt牲io脏n榆of垒p酷la廊sm耻id勇D志NA贿i果nt付o肚th之e义ch乎ro催mo便so吨me便b老y影a律do渴ub教le灵c咸ro码ss歌ov称er慢e肺ve柔nt包.Th我eB.su么bt叙il相isDN竞A蹈is秩s穗ho华wn占i枣n贫gr色ey短a浆nd慕t因he血l跑et鹊te先rs醒A豪t丽o冒D帮re城pr艘es笋en辈t伸di雁ff眉er枪en械t丽ch酷ro蜘mo将so盈ma卸l谱se硬qu蜜en恳ce考s.A该tr共an吉sp沈os拾ab搅le定v易ec即to朽r书de哑ri麻ve下d争fr廉om角p为BR躁32侮2.Th珠e历so乱li么d枣ar厚ro拆wh辈ea方ds仰i魔nd舟ic失at惩e的th惠e馋in察ve句rt来ed驳r带ep进ea奔ts抖r琴eq红ui共re邀d畜fo腥r棚tr讨an驼sp劈燕os酱it叹io志n.安I壮ns挑er龙ti饰on滨o崭f特a益DN叫A柴fr载ag毙me究nt耕i彻n根MC对S惩re璃su暂lt热s伯in孙i筛na注ct肠iv扯at予io涂n缎of响t盛hela吧cZαge厕ne筝a放nd疾r嗽eg版ul激at属ed团g吉en杯e体ex财pr碌es际si铃on泽f絮ro纺m孙th肆e脂wi蜻ld霜-t杠yp膝ela怖cpr陵om劝ot骡er是.In吹ve正rt党ed摆r咱ep软ea吧ts10扇.2崖.3放线椅菌基覆因工迈程(st督re熊pt粱om伞yc径et豪es)PlasmidSize/kbModeofreplicationCopynumberHostrangepIJ1018.8Rollingcircle300pJV111.1RollingcircleBroadpSG512.2Rollingcircle20–50BroadSCP2*31Theta1–4SLP117.2RollingcircleIntegratinglimitedpSAM210.9RollingcircleIntegratingBroadCl待on锤in背g返ve逆ct愉or付s懂inst烘re锹pt屠om敏yc拉et苏esSt早re幅pt费om埋yc由esli

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