第三讲技术方法一

第三讲环境生物技术研究方法环境生物技术Environmentalbiotechnology(一)第一节传统微生物分析方法主要内容第二节现代微生物分析方法第一节传统微生物分析方法一.显微直接计数法利用血球计数板在显微镜下直接测定。观察一定容积中微生物个体数目，然后推算出含菌数（包括死活细胞、微小杂物）。结果往往偏高。常用于形态个体较大的菌体或孢子1mm1mm二.平板计数法目的想知道待检测样品中的微生物数量原理根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。菌落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的微生物菌落总数。菌落总数并不表示实际中的所有微生物总数，菌落总数并不能区分其中微生物的种类，所以有时被称为杂菌数。操作程序首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经过培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

平板倾注法

先把适量稀释液(1mL)移进灭菌培养品，再倒入已融化并冷却至45～50℃的培养基，轻轻转动平板，使稀释液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养。

平板表面涂布法

先将融化的培养基凝固，再移入适量稀释液（0.2mL），然后用涂布刀涂布于整个平板的表面，放置片刻(约l0min)，将平板翻转,适温培养。操作方法

平板表面点滴法与涂布法相似，用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0．025mL)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在平板背面用标记笔划成四个区域)，每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平片刻(约5～10min)，然后翻转平板，适温培养。主要工具细菌:牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏：3g水：1000ml蛋白胨：5g琼脂：18gpH：7.0-7.2放线菌:改良高氏1号培养基KNO3：1.0g水：1000mlK2HPO4：0.5g淀粉：20gMgSO4·7H2O：0.5gNaCl：0.5gFeSO4

·7H2O：0.5g琼脂：18g真菌:马丁哪培养仅基KH2PO4：1.节0g葡萄育糖：10听gMg芒SO4·7凭H2O：0.述5g导N鹿aC葱l：0.继5g琼脂痕：18点g水：10倍00活ml3.撤3m万l意1%孟加心拉红/1道00披0m宋l0.聪3m彼l化1%链霉题素/1点00丘ml通常净情况漏下的五稀释苍度细菌碌：10-4~10-6真菌帜：10-1~10-3放线让菌：10-3~10-5培养臂：28~3桃0℃细菌慌：3~5d真菌榨：5~7d放线迷菌：10~14昨d2~3余d3扶~5夫d5闯~7研d20~2瘦0010望-1这0020裕-2涂00注意野事项（1）样品景稀释时尽量管使样耻品中雨的微椅生物扮细胞蚕分散均开，以单个亦细胞弹存在参（否候则一光个菌杯落就饮不只布是代厉表一磁个细献胞）（2）接袜种量晴要准窝确（3）涂炒布要柴均匀使用怒范围一般销用于浑土壤膨、水傍源、大雪气、锣食品弹等的污佛染程委度检拿验三.最大近或然迈数法东（MP湖N）目的计数烈待测正样品狭中的挨特殊划功能鸟微生赞物数竞量；酒检测园样品茧中特黎殊微报生物赞功能堤是否侮存在最大驻或然故数(m荷os棚t岸pr衣ob遍ab奖le击n腔um为be棍r，MP网N)计数桐又称梁稀释糟培养咳计数贴，适鼓用于诱测定续在一个个混煤杂的料微生伙物群被落中怪虽不振占优医势，而但却惧具有张特殊朵生理惊功能京的类晴群。其特安点是醉利用冬待测尊微生泛物的铜特殊境生理翅功能保的选洽择性穴来摆提脱其蹄他微践生物授类群窑的干享扰，月并通跳过该头生理慎功能借的表羞现来境判断券该类步群微畜生物乌的存尾在和辱丰度熊。原理将待幻玉测样捐品作秒一系搂列稀雀释，肆一直臭稀释妇到将界少量刮（如lm剂L）的唱稀释记液接谦种到女新鲜日培养砌基中迷没有帝或极在少出朵现生久长繁佛殖。阀根据悔没有绣生长毅的最小低稀萍释度预与出侮现生健长的个最高驻稀释夫度，渣采用捏“最膛大或努然数倾”理奋论，计可以熟计算捡出样亲品单获位体蓝积中叛细菌千数的环近似葱值.操作研程序10-210-310-410-510-61ml9ml稀释掩度10-110-210-310-410-5生长贩情况555555542054粘2举例重复掌管数54暖410-110-210-310-410-554220稀释度生长情况数量指标细菌近似值数量指标数量指标数量指标数量指标0000.01011302125430010.21021312205440100.41031402215450110.21102002225500120.61112012305510200.41122022315520210.61202032405530300.61212103005541000.2122211301555五次跪重复时测数健统计鞋表结果汤计算蚀：每个群干土寇中菌钻数=近似固值数量药指标你第一佛位数包稀释释倍数干土%适用售于测弯定在李一个恢混杂掏的微关生物夏群落嗓中虽谎不占贼优势动，但始却具觉有特坛殊生必理功油能的向类群特点初是利容用待增测微兴生物藏的特闷殊生宗理功食能的防选择踩性来伟摆脱招其他协微生概物类延群的答干扰欢，并恨通过拌该生买理功踩能的饲表现污来判座断该牺类群蛮微生塘物的朋存在跪和丰江度适合鱼于测雪定土渡壤微柱生物筛中的饲特定罩生理搂群（壳如氨天化、受硝化痕、纤衬维素届分解毅、固勾氮、蚀硫化角和反兆硫化须细菌执等)注意（1）菌警液稀牛释度贸要合顾适。鬼原则北是最色低稀棚释度粉的所丛有重晃复都磁应有政菌生嗓长，虹而最纸高稀吧释度婶的所异有重房诚复无馅菌生黎长。（2）每垮个接匠种稀北释度选必须悬有重竹复，衬重复蝇次数喷可根脸据需室要和辨条件兄而定政，一挪般3—衔5个重野复，馅但重特复次添数越养多，套误差灿就会糕越小黎，相暖对地胶说结历果就姓会越痕正确浆。四.微生旬物生梅物量科碳氯仿养熏蒸份培养烈法、氯仿难熏蒸经浸提匠法（狼去乙摩醇氯懒仿）原理：将富土壤造经过坊氯仿求熏蒸鄙后，度在好稻气条奥件下浓培养病（10旅d），涂然后盏测定师培养券期间CO2的释打放量蛙，根乳据CO2的增较量计施算土泽壤中诉的微闷生物炒生物嫂量碳蠢。培养城法培养娘时间槐过长队，不与适合抗快速冒测定不适拥合强书酸性垂土壤汉的测榆定不适紫合风搅干土不适怒合添宽加有候新鲜谣有机羡质的托土壤缺点原理：土摩壤经协氯仿柜熏蒸箱处理海，微门生物多被杀橡死，涂细胞怕破裂急后，喉细胞防内容询物释坡放到洁土壤挨中，农导致始土壤拜中可竞提取胸碳、反氨基棚酸、谢氮、长磷和姜硫等崇大幅导度增脸加，钱通过开测定趴浸提个液中广全碳挡的含误量可敌计算娘微生倦物生枪物量稻碳浸提茧法样品纲立即枯除去树植物辰残体西、土妈壤动兔物，者土壤府太湿育需要尾阴凉猛处凉炼干抽提才真空予时防水爆；悔培养柄过程店防漏夺气；糊氯仿谁蒸汽寄要饱岁和；垫保持丝式湿度嘱；暗忘处培描养提取测充分注意六.呼吸稠法密闭婶容器腾法、弟华勃续检压姿法、私呼吸况仪法楚、基否质诱型导呼概吸法粪（SI状R）等五.微生改物酶下法脲酶穗、磷邀酸酶浙、脱绑氢酶作、过兰氧化输氢酶自然肢样品嘉中可田培养帐的微姻生物镜占可垃数微跪生物仪的比怀例第二这节廉现代偿微生胖物分堵析方余法基于PC个R反应素的微醒生物魂分析淹方法早（PC铃R-梯DG棉GE）基于刷生物慈标记讽的微露生物压分析牧方法益（PL香FA）基于唱碳利须用方棚式的推微生灿物分安析方申法（BI勾OL抛OG）基于驴免疫柳技术陆的微茂生物虚分析昆方法籍（EL抢IS转A）基于偏原位亭杂交自反应忧的微勇生物蝇分析娘方法副（FI远SH）基于僚稳定殖同位的素探稍针-核酸饺微生滤物分识析技附术（SI舰P-留DN申A,奔S旱IP高-R延NA有,仔SI假P-革PL酷FA）PC澡R介绍PC偶R（Po员ly鹅me堪ra淹se邪C孕ha殖in截R稠ea连ct猫io努n）：即曾聚合仓酶链啄式反祸应，摇是20世纪80年代斩中期溪（19窑85）发妥展起剑来的室一项体外晴快速这核酸亿扩增技术垫，其梳基本购原理扩类似卸于DN贸A的天溜然复械制过优程。它通沿过与卧目的楚基因御两端秒互补碰的寡潮核苷述酸引舟物，驾经“变性--退火--延伸”三个女基本失反应寒步骤马完成轿对靶踪蝶序列茄的扩脖增。1.每P免CR原理DN球A模板省在高胶温下盯变性生，DN团A解链喊成单干链，呆当温矮度降枕低时摔，人顺工合代成的阴两个挤寡核瞧苷酸搅引物按在合赵适的演复性有温度来下分中别与于目的柔基因首两侧饮的两株条单驰链互床补结蜂合，躬在DN栏A聚合判酶作犹用下现，随尝着温渠度的锣缓慢汪提升遮，引经物逐译渐延杏伸，唐两条搏引物购之间胸的区虚域被垦合成点，完乘成一跑个循笋环，反然后DN配A再次株被变崭性，话进入府下一存个循爆环。凝胶保成像玩系统2.享P酱CR的反牢应流铅程预变性：94℃，2min;P1P2退火延伸变性P1P2P1P230-35Cycles94℃，30sTm-5℃，30s72℃，1-2kb/min循环补充延伸：

72℃，5-10min.5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’特异刻性强:可以估从成买千上保万个岛基因瞎中对之某个糠特定术基因查进行夫扩增祥。高效园快速:可将征所要映研究常的目舱的基针因或序某一DN浴A片段滋于数罗小时炉内扩酷增至貌百万太倍以启上,使肉骄眼能绘直接眼观察乎和判罚断。灵敏龟度高:可以慌从微备量的循样品咐中扩秆增出顶足量妈的DN躲A供分剂析研袄究和康检测技鉴定辨。重复融性好:在体羡系稳居定的甚情况蝇下，流对某呈个特谅定基包因的恒扩增头不会谜受时搂空和第操作丹主体甩变化蚊的影栏响。易自雷动化:只要翻编写查一个隙程序皮，仪挺器就肉可自炮动完视成整慈个扩朵增过抬程。3.羊P宴CR的特斤点4.谅P调CR的反浸应体败系模板引物耐热球聚合盯酶dN义TP二价邪阳离系子反应眉缓冲俩液水一.模板模板虑可以抵是DN竖A，也财可以苦是RN插A当用RN晓A做模阶板时株，先泳经过愁反转塘录生划成cD巾NA现在这用的PC歇R酶都艘仅识终别DN翻A，不论能识坟别RN森A扩增本是成宗对扩馋增RN它A易降周解，RN静A酶存瓦在广浩泛，妹活性敌稳定

选择16SrRNA的原因

核糖体rRNA的保守性和可变性长度和信息量适中(50个功能域)有重要的功能（蛋白质合成开始有关）有比较完善的16SrRNA数据库用的村最多上的是载原核比生物畅的核提糖体16剑S蛋rR晋NArD算NA和rR姐NA中的r”是ri戴bo递so犹me桥(核糖善体)的缩转写。rD弹NA指的滥是基牢因组凝中编伞码核降糖体RN劲A（rR顺NA）分翅子的蚀对应狠的DN府A序列扛，也截就是挽编码16怠S宇rR愈NA的基布因。rR短NA指的牺是rD笑NA的转溜录产逗物，首它是摆构成迅核糖裂体的慨重要覆成分燥，核择糖体汁由许目多小蔬的rR祖NA分子佳组装吩而成兆，16泡S雪rR宴NA是其搏中一乳个组巾件.一般限所分搁析的超对象施都是16至S究rD塘NA，因底为DN属A提取毛容易蔽，也炼比较练稳定16呢S首rD槐NA与16忍S昆rR虽NA的区摸别提取利用DN谷A和蛋筛白质傲对提僵取过读程中隶各种孤试剂翻不同亏的反踏应和刃溶解盾性来步达到堡分离宇目的

方法细胞提取法：DNA纯度较高，但提取效率较低，操作烦琐直接溶解法：操作简单，效率高，但获得的DNA纯度不够，需要进行纯化处理原理物理剧法：玻璃璃珠询匀浆踢法、继超声搂震荡似法、淘反复滩冻溶谈法、瓶研磨田法化学杜法：表靠面活惰性剂矛（SD脂S）生物骗法：酶均解细胞分破碎物理葱法：DN谅A分子撇断裂化学块法：对闷细胞筋壁厚慈的细却菌比障较困正难常用矛：酶毒解+S旬DS利用缺苯酚施是蛋吓白质愉的变锻性剂郊，反泽复抽畅提，看使蛋舍白质杀变性氯仿陪加速菌有机嚷相与歪水相弯分离SD愉S将细碑胞膜系裂解响，在宗蛋白芽酶K的作支用下甜消化攀蛋白迟质或飞多肽扔或小蠢肽分遮子，文核酸您蛋白猪质变伤性降赠解，喇使DN桂A从核高蛋白仁中游放离出拢来异戊垫醇作用做是消篮除抽拉提过饲程中讨产生盖的泡回沫经典湾提取母方法会（苯产酚/氯仿策有机飞提取挑法）为什胞么土环壤样锄品需准要纯泼化模洗板？有机忌质（犬如腐践殖质匹）重金泰属纯化方法

商业化的核酸纯化试剂盒传统方法（乙醇-醋酸钠）注意偶！！贫！纯爷度盐：杂蛋财白、把多糖画、酚揪类复杂走性：质粒而、原粉核基仙因组DN段A、真闻核基因组DN疾A完整童性：降解污狐染宾：有扩蔑增产列物的柏污染数斧量事：适中二.引物引物表是PC宝R特异鞭性反柱应的僚关键答，PC渠R反应炕的特网异性客取决拖于引澡物与抹模板DN熟A的互旨补程检度。了解委要扩效增片侦段的DN盆A序列找到DN横A序列危的保乌守区茅并具加有特歪异性垦（非袋特异超扩增捆区序此列的磁同源章性小卸于70朗%避开数能形渣成二宝级结驼构的青区域引物绣设计①引物隐长度:屈1屡0～30永b伐p过短艇：特味异性狗差过长联：导烦致延谱伸温宿度大悉于74℃，遣不适叛于Ta都qDN蛾A聚合雹酶进稀行反桃应（演大于38航bp）②碱基先分布:翻A、T、G、C随机私分布引物恒的设设计原地则③G+露C含量：40%～60止%，过高锣或过辆低都阶不利晶于引唉发反库应。牧有效茄引物径的Tm为55循~8投0℃，Tm最好末在72℃左港右④引物蠢间：不河能有香连续4个碱紫基互剑补⑦引物5′末端浅碱基:可不绳与模送板DN黄A互补茫，可压做修药饰，唐但3′不可茧修饰滥，因为终引物腾的延毕伸是携从3′端开桃始的⑥引物3′末端凯碱基：最扰好选T，不忧选A，为A时即城使在却错配哭的情赵况下宝，也葡能有锐引发杠链的遗合成霞，而然为T时错勉配的浩引发扰效率绳大大蛛降低糊；出树现3个以呢上的痒连续征碱基沃，如GG秧G或CC常C，也跌会使悠错误炒引发功机率辱增加⑤引物诊自身：不阻应形圣成二恶级结夸构(互补误碱基姐小于3b博p)引物依的使位用引物毕的浓员度一辣般要亲求在0.用2～0.界5µmo手l/源L低于0.齿2µmo解l/爸L:产量氧下降高于0.仆5µmo竞l/统l:促使邮错误王引导岩及非著特异筒性产茄物积痛累;易形锁成二旁聚体;这些械会与所靶序疑列竞留争DN仪A聚合锤酶和dN瓜TP乱s一般滨用TE配制备成高想浓度报母液津（10µmo换l/乘L），王保存篇在－20岔℃，使裂用前蚂用dd烦H2O稀释碍成工欠作液友。避后免反尾复冻例融，把造成蹈引物倚降解匪。冻泡干引才物－20首℃下可仍保存12慰~2据4个月劈燕，液香体状谈态可颤以保押存6个月引物1引物2注意弓！！芝！纯内度崭：混有题短片鹊段引霉物（召纯化嫌）完整汪性：避免蝇反复将冻融污此染薯：模板DN畏A三.耐热青聚合摄酶耐热死聚合郊酶的杆选择而非常抓重要生，很对大程笨度上替关系诉到扩尿增的俊效率辟和特骑异性19载83年，锄美国PE锋-C鲁et短us公司妥使用总大肠回杆菌DN炼A聚合罢酶I的Kl籍en毅ow片段渐（37拌℃）19猫87年，套发现牲耐热尸性DN禁A聚合版酶Ta忠qpo鉴l后，PC谁R反应泳特异后性得盛到提爸高Ta端qpo缴l、Pf危u、Ho标tS啊ta央rtTa悼q、Ta侍qPl绑us、Lo润ngTa恨q，其棍中使铜用较预多的谷是Ta余qDN琴A聚合池酶主要眯耐热窝酶Ta狭ppo铜l分离炕自美锯国黄芝石国闹家公承园温您泉中全嗜热谢水生俗菌Ta压qpo涂l酶有告较强禁的稳兄定性鸭，在92妄.5、95、97价.5未℃时的歼半衰秩期分目别为13予0、40、5～6m士inTa吴qpo税l酶有床较高汇的催霜化活践性，秃在所揭有的终耐热DN夹A聚合间酶中稀，催哨化活缘瑞性最改高，侄达2×上105U/箱mg最适阔催化慨温度森为75～80那℃，延射伸速挪率约谱为15涛0～30鸽0个核范苷酸/（秒·酶分稠子）（1）需气要提钳供合翁成模西板（2）不锣能起壳始新匆的DN吧A链，帅必须蹦要有续引物善提供3'－OH（3）合肿成的案方向仁都是5帜'蒙→3押'（4）除歼聚合DN孕A外还碧有其庸它功倦能。DN砖A的聚铁合酶瞒特点注意鸟！！贝！纯迈度:宿主未菌DN脉A污染遣、宿侮主蛋陷白酶容量：适量请（2.位5U帐/1达00仗ul），运过高昆，非音特异要性扩献增；萄过低往，合耍成产福物量孔少反应誉缓冲证液：匹配不同DN狐A聚合郊酶PC岂R-米DG穿GE结果成分:Tr焦is国-H始Cl、K＋、增强复剂、朽稳定社剂（Mg2+）(三羟丸甲基淹氨基帖甲烷)浓度四.反应展缓冲金液10扔mm伪ol返/LpH召8脚.3（25℃）优点酷：职①Tr奖is碱的启碱性等较强董，所伍以可寨以只潜用这津一种盒缓冲混体系椒配制pH范围壶由酸女性到途碱性品的大渴范围pH值的经缓冲念液；扒②对报生物切化学添过程复干扰阴很小比，不臭与钙映、镁壤离子健及重组金属形离子们发生疼沉淀山。为什伟么使秒用Tr严is售-H兴Cl缓冲流液缺点凳：①察缓冲痰液的pH值受肉溶液毙浓度桂影响舞较大结，缓授冲液古稀释御10追倍，pH值的桐变化轮大于0.捉1；②及温度打效应膝大，议温度困变化自对缓款冲液pH值的赤影响虎很大浩（4℃时8.物4，37驼℃时7.苦4），翠一定叹要在汉使用隔温度储下进焦行配糠制；横③易谷吸收熊空气腿中的CO2，配反制的占缓冲萝液要短盖严缠密封晌；垫④对湿某些pH电极面发生索一定跨的干知扰作锹用，潮所以催要使先用与Tr屯is溶液舞具有箭兼容猎性的型电极皆。五.二价提阳离顽子Mg2+是PC段R反应铲的稳雪定剂娇，是玻耐热粱聚合胃酶的怨重要静影响纵因子铜，对PC滑R产物疯的特偷异性机及产额量有笔显著狮影响Mg2+浓度群过低鞭，会殊降低Ta茶qDN拼A酶的漏活性脊，产晌物下麻降；Mg2+浓度区过高禾，会奔使反控应特秧异性竞降低Mg2+浓度1.点5～2.汤0m瞎mo欢l/界L为宜酿，因权为DN素A模板安、引观物和dN爷TP均可同与Mg2+结合六.抱dN碗TPdN将TP是PC包R反应谎的原尸料，右其浓闻度与惑质量浮和PC荣R反应着效率嚷有密恳切关铸系dN御TP使用省浓度后过高睬易产逗生错浪误掺披入，好或得削不到喷扩增严产物棒，过雁高dN望TP浓度判还可接能导聪致Mg2+浓度私下降使用勤浓度陆过低宏，PC挺R产物民下降一般医常用dN块TP终浓钓度以50～20抄0µmo买l/挡L为宜四种嗓脱氧祸核苷肉酸的槽浓度扑应相半同，阵如果揉其中页一种dN鸭TP偏高雄或偏踢低，凭会诱胸发聚产合酶奸的错饿误掺别入作依用，斤降低蒸合成坚速度忌，过沈早终撞止延骗伸反蓄应避免轧反复殖冻溶醋（易经降解滚）最好黑用bu稻ff患er溶解pH栋:PC半R反应怜所需筐的pH通常慰在8.愧0~无9.荒0之间污染感：DN在A污染七.水5.倍P痒CR产物游检测PC毁R反应由后期悲扩增遥产物所已不械再呈惩指数心方式四增加磁，而妖趋于幻玉一条亿平线历，如届果继烈续扩识增，所将会雾出现六大量读非特胃异性计的产伐物，兽这就移是所遍谓的价平台死效应dN唉TP、酶凶、引康物、刮镁离津子浓蜘度下孩降聚合融酶酶浸活在迫数次倚高温善后活惰性下态降产物帅浓度纠过高宗影响PC龙R反应原因凝胶物电泳葱法实时杀荧光来定量PC赤R技术定性狗及定窑量方凯法大片为段分饶子量览大，艳在电笼泳速出度慢临，而停小片阀段则待相反搞，迁披移速增率快礼。根技据凝拨胶电点泳中谎条带酸的位蔬置，窜可以杨判断PC汇R扩增吴产物译的大袍小。（1）凝小胶电丘泳法种类琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的PCR检测方法，操作简便，仅需要少量的扩增产物即可进行检测，范围100～10000bp，精度稍差聚丙烯酰胺凝胶电泳：①分辨率高，长度仅差0.2%的DNA分子即可被分开；②能够装载DNA的量远大于琼脂糖凝胶电泳；③从凝胶中回收的DNA纯度高琼脂免糖凝俗胶电易泳聚丙父烯酰始胺凝肠胶电爆泳溴化荡乙锭(E规B)是一俩种荧饶光染且料，EB分子冲可嵌注入核侮酸双艳链的原碱基瘦对之老间，负在紫权外线隐激发猛下，王发出熔红色蠢荧光绞。根网据情愤况可首在凝赛胶电傻泳液赌中加骡入终扫浓度兰为0.咱5µg/冷ml的EB（迁逼移率僚降低肥近15盼%），节亦可床在电脖泳后欲，将送凝胶尽浸入佛该浓庸度的鞠溶液络中染竭色10～15双mi炊n。染色柱观察EB见光校分解EB毅-D繁NA的EB发出勉的荧痛光比兰游离捎的凝悉胶中扁的EB荧光再强度猾大10倍，赖无需衫洗背盾景可诱筒发突滔变,具有市潜在滥致癌塘性,且具简有中宋等毒摇性EB替代仍品Go伴ld厅Vi身ew鼻(G达V)是一谜种可何代替浇溴化馆乙锭互（EB）的叫新型梅核酸选染料涝，灵券敏度浆与EB相当扎，使云用方察法与醒之完偷全相颈同，市在10挨0m赞l琼脂刷糖胶涛溶液虫中加缩慧入5μl榆Go腥ld念Vi肆ew雹™即可披。在来紫外周透射层光下肌双链DN贺A呈现炕绿色蜓荧光烂，也搬可用蔽于染RN煤A。荧光英颜料馅：Ge载ne朴Fi遇nd捞er宾™、SY薯BR托G摇re抱en、Ge常ls躬ta按r、SY籍PR革O免Or星an上ge、荧啄光素倦、绿认色荧按光蛋版白等银染荷色:银染顺色液穗中的暗银离师子(A清g+)可与倘核酸虾形成央稳定许的复愿合物朗，然极后用返还原符剂（没如甲成醛）淹使Ag+还原稠成银彼颗粒黎，可胁把核理酸电材泳带声染色也黑褐临色。割主要吵用于钟聚丙召烯酰握胺凝自胶电挡泳染墙色，悦也用骆于琼肝脂糖角凝胶朱染色标。其捉灵敏文度比EB高20基0倍。亲但银犹染色捎后，DN匠A不宜撑回收框。AgaroseGelElectrophoresis（2芝）实浪时荧茶光定绍量PC拣R技术(R惊ea借l-虾ti绑me兵Q展ua怎nt厨it政at室iv者e亲PC虽R)在PC下R反应桥体系笔中加胖入荧住光基突团，腊利用慢荧光困信号圣累积湿实时唯监测笛整个PC伪R进程病，最遣后通失过标扒准曲呢线对应未知苏模板感进行驼定量厌分析曾的方补法。扩增之曲线下图：横坐允标：扩增洁循环吹数（Cy解cl父e）纵坐甲标：荧光翠强度每个暖循环甲进行践一次黄荧光闻信号码的收芝集荧光毅基团荧光红检测父元件实时澡荧光颤定量PC滴R原理--催--扩增菌曲线实时锄荧光俘定量PC终R原理荧光违信号香的域闭值（th颈re煮sh碍ol呜d）荧光宰本底粮信号栽（ba士se严li顶ne）CT值背景洽信号奖阶段信号轧指数拒扩增江阶段平台抽期基线格范围:从第3个循纺环起讽到CT值前3个循妻环止耽，其秘终点载要根狠据每峡次实糟验的洲具体烛数据枯调整经，一娱般取赛第3～15个循孕环之证间。果早于3个循马环时畜，荧灿光信厚号很净弱，如扣除肚背景狸后的静校正均信号丙往往榆波动搅比较栋大，直不是歇真正钥的基蹦线高滨度；草而在CT值前3个循堪环之帅内，泽大多精数情喷况下绩荧光火信号须已经穗开始姑增强蓝，超凉过了播基线耽高度科，都泰不宜临当作课基线浑来处炎理阈值:基线恒范围他内荧冶光信金号强享度标俊准偏喘差的10倍基线:在PC佣R反应钻最初沈循环绣里，户荧光消信号久变化盟不大素，接珠近一竞条直笋线CT值：是PC痕R扩增畅过程吵中，吐荧光摔信号继开始场由本极底进寸入指壶数增山长阶垄段的嗽拐点浊所对卵应的命循环锣次数基线熟上方维产生借可检梅测到惭的统旷计学百上显具著的贫荧光栽发射纳时所净对应凉的PC布R循环疗次数CT值则军极具挎重现邻性CT值取壶决于既阈值轿，阈溜值取槐决于渔基线杂，基猎线取躬决于付实验焰的质泊量实时博荧光磁定量PC迟R原理--束--荧光罩定量劳原理模板DN隙A量越环多，桨荧光乌达到纠域值鼻的循拨环数疯越少浙，即CT值越岂小Lo南gD潜NA浓度山与循伍环数惠呈线植性关身系，粗通过划已知棋起始扁拷贝遗数的才标准助品可重作出劈燕标准讲曲线板，根隆据样谷品CT值，萄就可筛以计赛算出飘样品序中所存含的捆模板推量实时菊荧光版定量PC舱R原理--辨--伞-坡DN豪A产物哥的荧颈光标泪记非特娘异性匹荧光腰标记竞：1、SY借BR惩G纺re纺en特异庸性荧轧光标撕记：2、Ta仿qM精an3、Mo览le资cu颜la恼r仇Be拿ac法on4、Am蚀pl亩is盒en忍so棕rQQRSY宋BR婚G的re禾en法--鞭--工作央机理SY崭BR常G火re畜en能结围合到柔双链DN扣A的小丢沟部毕位SY字BR西G茶re摊en只有鸟和双档链DN救A结合政后才售发荧禾光变性蔑时，DN令A双链舌分开督，无涛荧光复性吗和延趋伸时脊，形则成双初链DN失A，SY从BR敞G羊re劲en发荧狐光，桃在此坑阶段寺收集迫荧光虏。模板做：6个样辉品,只改狂变SY证BR杆G发re剧en浓度SY障BR铸G女re畜en浓度军：3个浓齐度C1C挥2C3C2C1C3SY币BR援G行re仆en法--城--室-优缺歉点

对DNA模板没有选择性

----适用于任何DNA

使用方便

-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性（引物二聚体、单链二聚体、错配），但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点实时鸡荧光桶定量PC泊R方法2滑--仔--慰--累-T题aq铜Ma女n法与目既标序移列互前补Ta妹qM驳an谦--宁-水解慨型杂醒交探水针5′端标苏记有脾报告探基团(R趟ep哈or往te款r,贝R额)，如FA猴M、VI倦C等3′端标情记有绳荧光女淬灭判基团(Q差ue偏nc删he论r,于Q哪)探针蒜完整贿，R所发旨射的叠荧光哥能量侮被Q基团险吸收果，尖无荧跳光，R与Q分开铃，发授荧光Ta涨qD槐NA聚合携酶有5′割→3回′外切籍核酸战酶活猎性，很可水蚀解探巨针Ta初qM乡丰an法--卵--互-工作既原理每扩堂增一甚条DN丈A分子讲，释羊放一暮个荧常光信累号，乖可以基在循骆环过椒程中私任一哗点检完测荧墨光RQ5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双标乳记探侨针（Ta叔qm恢an爷P喉ro脂be）5′Ta瓦qM瓶an法--荣--第-优缺宾点对目婶标序袜列的身高特竟异性--相--办--阴性掌结果庆确定设计孝相对萄简单--犹--庭--与目演标序密列某姐一区邮域互际补重复推性比铅较好优蛋点只适溉合一港个特糟定的阅目标委托缺公司琴标记贩，价条格较狠高不易钞找到撞本底粪低的零探针缺恐点6.本P园CR常见新问题无扩还增产剧物非特键意性狂扩增拖尾假阳摇性问题轰一栽无扩块增产句物现象：正对塑照有扔条带途，而拼样品密则无模板:含有覆抑制幅物，著含量连低该Bu熊ff罗er对样蒙品不罗合适引物滔设计卸不当件或者唯发生贵降解反应中条件筹：退队火温愉度太麻高，闲延伸物时间傍太短对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间可能享原因问题窗二烦非特限异性驾扩增现象：PC疯R扩增倾后出牌现的兼条带替与预修计的条大小希不一歪致，副或大搁或小川，或婚者同易时出己现特闻异性膀扩增首带与典非特卸异性气扩增英带。引物牙特异孔性差酶纯施度不创高Mg2+浓度僵偏高退火厌温度华偏低Bu太ff链er不合兔适循环糖次数封过多对策重新设计引物或者使用巢式PCR换用高纯度的酶降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法更换Buffer减少循环次数

可能昨原因问题在三暖拖尾现象：产栏物在隐凝胶粒上呈Sm艇ea汉r状态酶量贴过多模板兰不纯循环救次数征过多dN赏TP、Mg2+浓度皱偏高退火县温度雅偏低Bu狡ff既er不合掌适对策适量用酶纯化模板减少循环次数适当降低dNTP和镁离子的浓度适当提高退火温度更换Buffer可能壶原因问题撑四暴假阳棵性现象：空白炸对照衔出现擦目的卖扩增之产物靶序列或扩增产物的交叉污染对策操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。7.注意海事项合理街分隔各实验线室（辟标本法处理差、PC停R反应钻液制除备、PC莫R循环闷扩增许、PC哥R产物低鉴定残区）实验摩前应博将实昏验室扬用紫喷外线法消毒竿以破勒坏残葡留的DN筋A或RN傅A配制PC斯R反应哨的移兼液器咐和其坑它移奇液器忧分开中使用吊。经烘常更笛换手传套防遍止来溉自表恋皮的蛇细胞泼污染吸样胃时尽波量一臭次性讨完成鬼，忌护多次里抽吸扒，以室免交卵叉污忌染或离产生肃气溶嫁胶污捐染8.提高PC凝R反应也特异是性的慕策略策略索一：沙巢式PC陪R（Ne衫st绵-P按CR）两套乏引物社，扩赛增两骆次两套兆引物鬼的Tm值和约浓度帆均不伞相同砌，外脑部引苹物的Tm值比畅内部雹引物赌的高午，而漫外部芒引物栗的浓钱度往娃往比籍内部升引物耐的低巢式PC软R可以弊增加烧有限青量靶燃序列伟（如供稀有mR卵NA）的周灵敏浙度，蛮并且深提高弃了困际难PC妥R的特号异性谷。巢式PC谅R一般PC袖R策略浊二：净多重PC怠R（mu杠li筹ti屡pl跳ex秩P广CR）多对像引物嘉同时老扩增毒一份DN筝A模板多重PC缘瑞R的技啦术要子素主鼻要包忘括目甘的片发段选判择、疼引物贪设计潜、复参性温毁度和酬时间烛、延防伸温姨度和扮时间弱、各宏反应欲成分鸽的用螺量策略疾三：散递减PC巨R（To声uc馅hD勤ow象n集PC叨R）递减PC今R通过口在PC佣R的前趁几个捧循环暮使用顺严紧慕的退您火条备件提闯高特碧异性钓。循太环设余在比调估算合的Tm高大蓄约5℃的退傍火温魂度下条开始姥，然蓄后每准个循虏环降纯低1℃到2℃虚,直到将退火资温度童低于Tm鸣5矩℃特异刑性最孔高的威目的宝模板锤会被览优先联扩增听，这耐些产口物在捆随后叹的循的环中墙继续艰扩增幻玉占据腔优势递减PC却R对于嘉那些错不了提解引内物和劣目的慌模板真同源收性程坐度的磁方法耕更为迫有用策略胖四：珠热启至动PC饼R（Ho慕tS愉ta忙rt侵P蚂CR）Ta次qDN搂A聚合打酶的浸最佳险延伸城温度炎在72那℃，聚腹合酶黎在室虽温仍拉然有耻活性在进线行PC喷R反应猫配制琴过程础中，靠以及目在热饿循环湾刚开扬始，尽保温荷温度剩低于犹退火秆温度祖时会显产生庭非特絮异性悲的产护物热启葡动PC势R即在戒反应厨体系擦达到筑一定凑温度贯后再守启动DN累A扩增旷的PC秤R主要每方法Ho安tS讲ta骗rtTa捏q酶：Ta歉q酶经惕过化绢学修舰饰后恶，酶侦活性群被封场闭，向要在94经-9揭5℃加热债数分津钟才泼能回热复正请常活盾力开言始反俗应Pl牺at训in垫um闪D袖NA聚合穷酶延缓妻加入Ta溪qDN掠A聚合武酶手呀工热物启动佣方法用蜡炎防护赏层将芬镁离矛子或盯酶包碧裹起胆来，骄或者叉将反员应成膏分（米如模臂板和恐缓冲优液）皆物理渴隔离切开策略项五：塞使用PC告R增强昌剂甲酰有胺、DM翼SO、甘樱油、秧甜菜泡碱等聋可作炸为PC如R的增脊强剂增强伯剂浓钢度要猎适当机理剧：降移低熔遇解温灾度，者从而婆有助摄于引括物退剖火并柳辅助DN趴A聚合劈燕酶延猫伸通巴过二谊级结浅构区基于PC嚼R的微央生物交分析听方法1.巷P隙CR若-D何GG蝇E（PC剖R-变性浸梯度痛凝胶专电泳捡）方红法2.乔P洲CR妹-S训SC秃P（PC喝R-单链丝式构象梦多态摘性）王方法3.赵P浓CR仔-R蛛LF建P送(P柿CR填-限制器性片违段长胃度多态态性伏）方题法1.PC雨R-卷DG狡GE（PC生R-树De坛na抗tu秃ri签ng茂G待ra区di灵en急t托Ge宏l蝇El哈ec阵tr互op木ho称re竞si抢s）方突法最早沈用于贡基因楚点突境变的叮检测呜。My叶uz塑er宣(垫19喷93肥)是第偶一个宴将DG钞GE用于望分子科微生劳物学伴研究轿领域选的研馋究者袜。目前谦主要功用于帮微生左物多缓样性抬检测太、微闻生物昏鉴定封、微芦生物湿分子染变异蛋、种陶群异楼化等抓方面泼。1.顷1原理DN共A变性茎剂中管变性米（解蜻链）DN雹A序列案决定互解链指行为解链DN早A在凝厚胶的根不同猎位置昂停止忌迁移殊，使泼长度伐相同师而序纠列不锹同的DN巩A片段捧分离根据危电泳爬条带缝的多年寡和贺条带棍的位你置、恐强度遣可以肚辨别赠出样代品中绒微生施物的咐种类骂和数怀量，指分析衰土壤蔬样品练中微竭生物港的多巡寿样性索。DG迟GE不是抽基于添核酸蒜分子晴量的冻不同坦将DN且A片段叉分开皇，而是赠根据壤序列温的不由同，将红片段穷大小躬相同杀的DN揉A序列奔分开叛。ATCG双链DN架A分子酒中，再由于部这四劫种碱犹基的翼组成间和排女列差静异，掀使不绣同序已列的落双链DN离A分子爷具有瞎不同澡的解柏链温冒度。10后0％变蚀性剂气：7M的尿勤素和40％的蛾去离魂子甲趟酰胺仔的混倾合物1.堵2应用微生卸物类哄群多懒样性环境惯微生晶物变把化的再动态雕检测有助商于发滨现新母的微臭生物对功渴能基粘因多直样性价的研焦究1.殖3缺点DG绕GE最多惊能分成离1k安b的DN卸A片段科，这大些序弄列只硬能提业供有续限的咽系统灿发育衰信息荐；如果维选用记实验降条件拒不当巷，不烤能保翁证将缴有一脑定序残列差走异的DN装A片段鉴完全事分开验，出厦现序尿列重私叠；有些联细菌屋具有盖多操赠纵子建，DG忠GE能将款其在PC烦R时形漆成的筐不同蜂序列诱分离状开，骡这样忙就可孙导致朝过高枝的估尊计环厉境中欧的微溜生物郊多样嚷性；DG渠GE通常钩只能育检测铜到环哀境中汁的优夕势菌盲群的充存在。氰戊仗菊酯绵处理笨土壤渣样品欺的PC透R－DG隐GE图谱茄分析2.PC庭R-删SS浴CP（PC兰R-脖re宾st旦ri缴ct酱io促n划fr佩ag握me诸nt铲l委en沸gt茄h点po肉ly泽mo推rp绵hi厦sm攻s）方隙法PC跳R-增SS蛙CP分析倦技术堡是一以种DN侨A单链绍凝胶云电泳赢技术金，它班根据淡形成腔不同移构象两的等明长DN的A单链剥在中模性聚涨丙烯务酰胺垂凝胶盯中的针电泳玩迁移血率变勇化来泥检测茎基因难变异。单链DN迷A片段平呈复耍杂的捐空间斥折叠肥构象末，这也种立境体结年构主疗要是怀由其寇内部杆碱基趴配对叮等分季子内龄相互甩作用跟力来朗维持仙的当有毅一个剃碱基多发生筛改变危时，汉会或批多或摆少地盼影响羞其空困间构蔽象，以使构扶象发涉生改被变空间交构象付有差拣异的仍单链DN哭A分子脖在聚粱丙烯伴酰胺阀凝胶颗中受跑排阻注大小训不同因此获，通志过非氏变性冤聚丙秒烯酰召胺凝先胶电猾泳(P担AG厉E)，可轻以非振常敏瞧锐地言将构卖象上壶有差咏异的封分子斗分离竞开方法吸原理DN集A片段财长度恐应使特用的罢丙烯锤酰胺犯浓度DNA片段长度（核苷酸数）丙烯酰胺（%）1kb～700b3.5700b～500b5500b～200b8200b12DN珍A链大冻小DN爪A链的捏自身闲结构温度电压影响DN被A迁移企率的琴因素胃：注意在事项核酸专片段拔的大辩小:核酸与片段批越小摊，检眠测的宣敏感促性越利高。僚对于<2限00牌bp的片街段，沿可发批现70％变嘉异；30捞0b本p能发扭现50％的茅变异五；＞50佣0b亚p的片朗段，笑仅能爸检出10％～30％的挂变异（15阵0b岸p左右尤较好足）电泳盖温度:保持旧凝胶蛇内温遥度恒倘定是SS孤CP分析耍最关清键的损因素妄。凝胶晶的浓边度、厚度及长度:一般课使用5％～8％的舞凝胶，尽量痕使凝晨胶越问薄越尖好