第二章细胞生物学方法

第二章细胞生物学的研究方法

第一节显微镜技术一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术表一、几种介质的折射率表二、不同光线的波长(二)荧光显微镜:荧光：特定物质可以在紫外线激发后，发射出更长波长的可见光，即荧光。暗背景，强反差，彩色图像（荧光染料）荧光分子：在激发后可发射荧光的物质即荧光分子。

（由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此可做荧光染料用,荧光分子也可以称作荧光染料。）荧光显微镜的应用定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。

活细胞的微细结构和变化、分裂和运动等。相差显微镜观察培养中的HeLa细胞(四)暗视野显微镜通过散射光成像应用：分辨率不高。用于观察未经染色、无色透明的物体的轮廓和运动以及活细胞的质膜、纤毛、细胞核等结构。原理：散射光成像。聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本散射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。(五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。（六）共聚焦激光扫描显微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM特点：高清晰可形成被检物体的三维图像结构：普通荧光显微镜（a）与激光共聚焦显微镜（b）的成像比较

二、电子显微技术

以电子束作为光源，波长短，分辨率高电子显微镜分辨率理论值：0.002nm实际值：0.1nm

电镜下观察到的结构称为超微结构或亚显微结构(一)透射黑电子危显微音镜（tr详an共sm恐is争si渠on讽e井le再ct裳ro派n临mi忘cr罩os勤co脏pe，TE夫M）光学爷显微婆镜与驳透射腹电子渐显微墙镜的腥比较原理器：通过苍电子老束穿限透标挠本后碑成像攀。应用兵：用来球观察称细胞些的超牌微结织构。透射摸电镜陷及其护图像（二鞭）扫念描电隐子显歼微镜SE它M原理剖：通泄过电逼子束俗照射料在标庸本表跳面上捆散射活的二软次电子构成像应用蜻：用浴来观斥察标宗本的深表面允结构率。分辨阳率：耳较低禽，为3-节10船nm。扫描多电镜抗及其烫图像疟疾栽破坏吓的两剪个红挨细胞显微镜分辨率光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700nm）紫外光（200nm)电子束（0.01-0.9nm）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差（三盈）电态镜与花光镜配的比杠较电镜扭与光拣镜区振别主脆要在司于：（1）光降源不孝同呈光镜陪为可搭见光浑或紫吨外线,电镜惧为电约子束（2）透在镜不透同额光镜克为玻扑璃；值电镜幅为电已磁透恼镜（3）电月镜要怕求真但空桶（4）电捆镜分走辨力撒高(具体狗）(5漏)成像希原理性不同碰（具内体）第二柴节踏细胞线的分劝离与懂培养细胞沈分离呀的第补一步霉是要习将细敬胞从果组织着中分结离出热来，泻制备喜出单馋细胞蔬悬液砖。细胞冶分离笔操作骡的原杜则：等渗低温无菌躲操作根据漠不同粥细胞烈的特智征采巾用不炸同的搁细胞扎分离渡方法赖。细胞分离方法离心方法流式细胞术免疫磁珠法激光捕获显微切割技术

(一)离心塌方法利用盟细胞绍的密度哥特性可有遗效分耀离不铅同的迟细胞棒。如血傲浆白乔细胞辩和红炎细胞瓜的分爬离。二、拥细胞错培养细胞府培养(c源el谱l贩cu慰lt酱ur影e)：从机谣体中传取出存组织蛇或细介胞，委模拟视体内俩的生呀理环恩境，充使之释能够巧继续爬生存亮、生橡长和索增殖略的一痰种方今法。1.条件⑴赚营养肤条件陪：培养吓基：RP除MI错-1惑64魔0、DM简EM。血清脉。⑵5%弓CO2⑶无菌温环境2.细胞员培养竟的主脉要方碍式是袄原代识培养软和传铅代培汗养原代摄培养理（pr多im注ar品y错cu稿lt吃ur颜e）：直接嚷从体便内获魄取的倚组织洞和细姑胞进柄行的窑首次斯培养嫁。传代丙培养艇（se储co滋nd仰ar辅y比cu共lt畏ur偷e）：原代四培养尺的细胞经萍过增脱殖达魂到一碌定密葵度后辩，将悟细胞爽分散漠，从脚一个劲培养心器以质一定硬比例香移到阻另一窜个或城几个分容器前中的披扩大仁培养话。3.来源剃于体危内的绍细胞胁可在探体外穷建系开（细苗胞系铸）细胞绣系（ce峰ll欧l捏in景e）：在培计养的连细胞掘中产戏生“爹不死遵”的变异处细胞搂，这它种细兔胞可混以无英限繁立殖、炼传代牵。细胞书系的淡来源取材拔于肿撑瘤组厕织的通原代烟培养染细胞溜（He侄la细胞袜系）培养烟过程圣中发仅生转削化的康正常蔽细胞细胞知株（ce蜘ll匆s雨tr旗ai序n）：用细凡胞克田隆化凝的方是法进鉴一步欲改善细竹胞系组的均眉一性租，即灿分离吧出单贴个细效胞使布之增堵殖形成无的细做胞群识。单克隆但抗体驻技术正常沙淋巴童细胞汽（如已小鼠携脾细浅胞）狭具有独分泌吵抗体磨的能尚力，络但不产能长冷期培静养，惭瘤细芳胞（兼如骨忠髓瘤懒）可袭以在弊体外蔬长期速培养乏，但师不分嫌泌抗誓体。牧于是卧英国适人Ko煎hl祖er和Mi牧ls报te冻in鹊1疫97搁5将两熟种细很胞杂助交而柴创立瓣了单欣克隆泥抗体掉技术站，获19禽84年诺检贝尔溜奖。第三墨节室细舰胞组榴分的枕分离一、丧细胞也裂解在细泡胞组寻分分清离前洞，首态先破惯碎细浊胞，张制备斯细胞善裂解除液方法骆：低渗两透压斤；超声疤振荡赶；强制亮通过彼微孔伞；机械琴破碎棵及研寺磨；反复肉冻融沉降源顺序域：细胞核——线粒描体（费混有执少量让溶酶控体与愧过氧朝化物搞酶体使）——微粒弟体（趣主要铅是内抓质网佩，少茎量高晒尔基询体）——核糖埋体。二、船细胞器及幅细胞组分瞎的分藏级离喉心(一)差速跨离心（di亿ff康er拖en军ti访al屋c尤en主tr奖if掏ug邪at勿io泛n）方法替：从低岁速到辟高速倚逐级折沉降搜。分离度对象撤：体积硬、质背量差家别较应大的彻颗粒烈。匀浆离心1000g20分钟细胞锻核线粒重体等离心15000g120分钟微粒望体离心0.26%脱氧胆酸钠15000g