分子生物学笔记第一节的含义

第一 绪所谓在分子水平上命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生。第二 分子生物学的主要研究内由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的和研究技研究内容包括核酸/组的结构、遗传信息的、转录与翻译，核酸1PAGEPAGE7能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。细胞生物学：从细胞普通生物学（动物&植物）&微生物学：不同生物类型动（Biochemicalprocesses）1是什么（what，生物学重要性和具体过程），)不具有多样性，不能携带的信息，当时对携带遗传信息的分子的是足的进步。1944年，Avery等人发现从致病力强的光滑型（S型）链球菌提在对DNA结构的研究上，1950-52年Wilkins及Flanklin用X-线衍射技术测定这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年ton和rik双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。基配对是核酸、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA的可能模.年代 特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传，随后研究表明这套遗传在生物上述重要发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本。1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤颗粒中发现以RNA为模板合成1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细胞溶血症的血红蛋白1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为工DNA分子有效地插入到细菌细胞之中，产生了重组DNA的克隆。Berg是重组1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的重1979年技术公司用人工合成的人胰岛素重组转入大肠杆菌1993年，Mullis由于发明PCR仪而与第一个设计定点突变的至今我国已有人干扰素、人2、人集落刺激因子、重组人乙型肝、工程幼畜腹泻等多种工程药物和进入生产或临床试用，世界上还有几百种工程药物及其它工程产品在研制中，成为农业和转动植物和剔除动植物的成功是工程技术发展的结果投放市场，1996年转玉米、转大豆相继投入商品生产，最早研制得total:52600000USA:30300000Agentina:10000000Canada:300 500000诊断与治疗是工程在医学领域发展的一个重要方面。 缺陷我国也在1994年用导入人凝血因子Ⅸ的方法成功治疗了乙型血友病的患者。在我国用作诊断的试剂盒已有近百种之多。诊断和治疗正1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列；他和齿类动物以及水稻、拟南芥和酵母等50多种生物的全组序列测定工作。提出、启动的人类组计划(HumanGenomeProject，HGP)，被誉为生命科学的“登月”计划。年月日国家人类组研究项目斯博士隆重宣布，美、英、日、法、德和中国由30亿个碱基对（3×109bp），组成的人类组，蕴藏着生命的奥秘。科学家发现人类数目约为3.4万至3.5万个，仅比果蝇多2万个，远小于原先10万个的估计。2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO），20031215启动两个首单克隆抗体 1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术出单克隆抗体80年代以后随着工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌分子遗传学基本理论建立者Jacob和Monod最早元学说打开了细菌代谢的分子机制而获得了生理医学奖。同时他们还了mRNA分子1977年最先发现猴SV40和腺中编码蛋白质的序列是不连续的，这种内部的间隔区（内含子）在真核组中是普遍存在的，揭开了认识真核组结构和调控的序幕。70年代中期以后，癌和抑癌的发现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其在免疫活性细胞对抗原的识别及其活化信号的传递途径方面和细胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，当然要达到最终目标还需相当长时间的努力。期 遗传信息的传递与保持（replication转录与调控翻译与调控 教加强沟通（师生、学生、与外界作业 能力、学习资源利用能力等、表述能力小组学习（克 、一起进步（多元化人才培养、重能力培养平时小考期末考试平时相互帮助（2分TurnerP.C.etal.MolecularBiology.科学WeaverR.MolecularBiology.科学BenjaminLewin.GenesVI,OxfordUni.Press,。《分子生物学》，中国，1997。《现代分子生物学》，高等教育，1997。《分子遗传学》，科学中国生物信息：分子生物学信息网 生物软件 中华网：大学分子生物学教学：/fzjx/fzswx/classguide/ Ergito(GenesVII）:TutorialsinMolecularBiology: .分子生物学习题及解答.大学，2002王金发等.分子生物学与工程习题集.科学第2DNA第1节细胞的遗传物质第2节核酸的化学组成第3节核酸的结构第4节核酸的物理化学性质第5节超螺旋和拓扑异构第1编码氨基酸的61个子具有简并性、通用性b、编码选择性表达的信原核生物的结构占Genome的比例很大，Φx174phage5386bp，结构15RNA：传染媒介是颗粒（组RNA、蛋白质外壳Tobacco 类（viroid）:使高等植物产生疾病的传染性因子，只由RNA组成Prion(proteinaccousinfectionsparticle)朊－－－蛋白质样的因人类库鲁（kuru）均由传染原蛋白颗粒引起，统称Prion(朊朊毒体的致病过程是：首先经一定途径（如进食患病动物和内脏）侵入机体并进普利学说公布之初，在学术界曾遭到猛烈，多数人持否定态度。因为分子生物学发现的重大科学价值，普利荣获1997年度生理学或医学奖。第2DNAisanucleotidepolymerwithcovalentbondsbetweenthesugarandPhosphateAlongmolecularchaincontainingasugar,aphosphateandoneoffourdifferentnucleotidebases.ChemicalComposition（化学组成 -phosphodiester (G) (C) (T)名称与缩写 cytosinethymine guanine名称与缩写 adenosine(Ado) guanosine(Guo) cytidine(Cyd) thymidine(Thd) （带磷酸adenosine5’-mono(di,tri)AMP,ADP, (dAdo) dAMP,dADP,主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子第3.1938...Atry 首次用－射线分析b150 hgf A+G/T+C=1A+T G+192 Aldr d &Rosalind 直径

螺距为34Å(任一条链绕轴一周所升降的距离每圈有10个核苷酸(碱基力（Vandewaals疏水作用力(Hydrophobic 碱基内能增加(温度),图反向重复序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeats,IR）,又称回三螺旋DNA(TribleHelix T.S1953年，Watson&CrickD.SDNAmodel潜在的专一与 (蛋白质)结合的能形成T.SDNA1957年Felsenfeld等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链如：polyA/polyU polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出1987年Mirkin.S.M证明smidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在，这些发现促进了三螺旋DNA的研究a、D.SDNAD.S.DNA→T.SDNAS.S☆ (偏碱性介质中稳定 G＊G、A＊A、☆PY/PU +PY(偏酸性介质中稳定) 常见类型G＊C＋ 3、四股螺旋DNA (tetraplexDNA,TetrableHelixDNAA、稳定真核生物结构B、保证DNA末端准确C、与DNA分子的组装有关D、与的meiosis&mitosis有1、条件：加热，pH，（尿素、酰胺)，低盐浓度¤¤DNA溶液的温度（0.1℃／分）Tm=ofCtC0/2OD增加值的中点温度(85-95℃)DNA双螺4TmAT,C,GGC Tm值愈AT形成变性，变性加快，Tm值小 已知大肠杆菌的组为4.2x106bp,COt1/2= 四、核酸分子杂交固相杂交(滤膜杂交1975E.M.Southern S.S.DNA×S.S. J.C.Northern S.S.RNA×S.S. Western Protein(antigen)×＊固相分子杂交(1975EM第5一、超螺旋 松驰态DNA（relaxform）低能量常态超螺旋（Supercoied） 正超螺旋（positivesupercoiled）overwinding右旋负超螺旋（Negative 松缠unwinding(左旋White

W（Writhingnumber）：超盘绕数，即超螺旋数，直观上为双螺旋在空间的转动2、核酸的一级结 书写方3、 ＆Crick的 参 大小 二级结构的多态 6、变性：溶解曲线 化学试剂、盐、7、复 形成、类第3章与组的结断裂构 性2）种C真核生物的结、簇、DNA、分散重复DNA序列人类组计了解人类组的重复顺序、人类组计划第1节的概第2节命名简第3第4节及组的大小与C值第5节第6节第8节第9节人类组研究进第1节的概结构：编码蛋白质 调控研究的发 分子反向生物学1955，Benzer用以表述T4具溶菌功能的区的2个亚区: 第2节命名简表示3个小写斜体字母表示 3个小写斜体字母+1个大写斜体字母。自然质粒3个正体字母，首字母大写重组质粒在2个大写字母前面加小写人 一、割裂的发

第3真核生物的都是不连续或割裂(splitgene)。 开的。割 割 SplittingGeneSplittinggeneSplittingGene 大T抗原小t抗原Splittinggene割裂的外显子在中的排列顺序和它在成熟mRNA产物中的排列顺序是相 关系的序列，结果表明一个的外显子常与其他的外显子有亲缘关系。两个相关内含子之间的亲缘关系远远不如其外显子之间的亲缘关系紧密 SplittinggeneIntron并非“含而不露 细胞色素bIntronII编码成熟Exon并非“表里如一人类尿激酶原ExonI不编码氨基酸序并非真核生物所有的结构均为splittinggeneHistonegenefamilyYeast中多数第4节及组的大小与C 的例子里，甚至有5060kb大多数酵母小于2kb，很少有超过5kb的开 开 广和

由于人们无法用已知功能来解释组的DNA含量，所以产生了C值(Cvalue第5节 一阙新歌声漱玉，歌声漱玉采莲人一、原核生物的(overlap在细胞 中，一般一段序列只以三种白质可读框一种被阅，但是在一些或线粒体中，两个近的一种巧妙的方式生，并不同的可读框被阅读并表达，因此一段相同的DNA序列可以编码两个非同源蛋白φXl74的DNA序列组织上有(overlap-gene)和内①一个完全在另一个内部如：B和A＊E和D内部分一个碱基在这 一个特定的外显子可能选择性地与不同的外显子连接形成信使RNA第6节 细菌的组通常仅由一条环状双链聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核（nuleoid）。类核无核膜与胞A超螺旋。Fig.TypicalbacterialE.coligenomeisasingledouble-strandedDNAmoleculeof1.6ButE.coliisonly~2minDNAis~1000largerthanthesizeoftheThisisachievedbysuper-coilingtheDNAgyrase旋转酶introducesnegative-superhelicaltwistsintotheDNA. degreeofsupercoilingofthechromosomeisstrictlyregulated.( 具有子(trnascriptionaloperon)结构,其中的结构为多顺反子数个子还可以由一个共同的调节（regulatorygene）即调节子（regulon）X174D-E-J-F-G- 外壳蛋白J、F、G、组装蛋白D裂解蛋白E.coli色氨酸子9个顺反子9个酶真核很少，如18s5.8s28srRNA在大多数情况下，结构在细菌组中都是单拷贝。细菌组编码顺序一般不会，和组不同的在DNA分子中具有各种功能的识别区域如起始区OriC，终止区TerC,转在或子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸子后尾含有40bp的GC丰富区，其后ProkaryoticDNAiscompacted–E.g.E.colipacks1.5mmchromosomeintoacellthatisonly1uminNohistonesornucleosomes–SmallbasicproteinsMAYserveasimilarGenesusuallydonotSingleoriginofreplication（二）质粒指细菌 组大小约质 、转（一）真核（二）真核（四）叶绿 （一）真核(Eukaryoticchromosome组蛋白核小体着丝粒（centromere或中心粒)和端粒 Chromatinstructureenablesthechromosomestoaltertheircompactnessasthecellprogressthecellcycle.组蛋白 Mononucleosomestypicallyhave~200bpDNA.End-trimmingreducesthelengthofDNAfirstto~165bp,andthengeneratescoreparticleswith146bp.The10nmfiberisacontinuousstringof4.结构的形（1）有丝中期的（二）真核组(Eukaryoticchromosomegenome结构复杂，数庞大，具有许多起点，每个子大小不一断裂（splitgene)。与间的非编码序列为间隔DNA（spacerDNA).7）功能相关的构成各种，可串联在一起，也可相距很远。8）可移动因素（geneticelement),又称为自私（selfishDNA).真核生物组的结–编码蛋白质tRNA顺式作用元件（cis-acting指与结构表达调控相关、能够被调控蛋白特异性识别和结合的DNA序 真核生物分布在多个上，而原核生物只一个乎每一个都是完整的连续的DN段；真核生物组的起点多，缺少明显的子结构，而原核生物的组含有编码2个细胞色

5.4—DH降解酶(ND1～6)和2线粒体是 需与 互作编码一些遗 图1-1线粒体DNA叶绿体组较大，在高等植物中通常为140kb第7DNA一

第8节（gene 。超（genesuperfamily)指一组由多及 。 簇(genecluster)是指中的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复 DNA），成簇存在 概念：DNA有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度同主体DNA有 lite大DNA（macrosaliteDNA)又称为经典DNA。总长度100kb~几个Mb。根据顺序组成。小DN（minisaliteDNA)由中等大小的串联重复序列构成，总长约0.1~20kb，分布在所有，往往近于端粒处。高度可变的DNA、端粒DNA（串联的微DNA（microsaliteDNA):重复单位为1~5bp,重复次数为10~60次，总长度,短散在核元件（shortinterspersednuclearelements，SINEs),主要是Alu重复序列。序列中有限制酶Alu的酶切位点（AGCT）而得名。重复次数30~50万，散在分布于组中，与表达调控有关。长散在核元件（longinterspersednuclearelementsLINEsKpn一、人类组的基本特点三、人类组计划断 人 A+GG+CSNP300SNP2（240 D三、人类组计划 组计划(HumanGenomeProject，HGP)， 年月决定出资亿，用15年时间（1991—2005年）完成“人类组计划”。“人类组计划”是生物学有史以 年月日国家人类组研究项目斯博士隆由30亿个碱基对（3×109bp）组成的人类组，蕴藏着生命的奥秘。科学家发现人类数目约为3.4万至3.5万个，仅比果蝇多2万个，远小于原先10万个2－5完成5人 断裂构 性种类真核生物的结、簇、DNA、分散重复DNA序列人类组计第四章DNA 第一节DNA概述第二节DNA的酶学DNA

第一节DNA概述(DNAReplication:An三、起点、方式和方向 DNA中含有一定起点和终点的单位。1.3万—90万不Aunitofthegenomeinwhich aregionfromoriginto Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNACsClCesiumchloridedensitygradientultracentrifugation（CsCl密度梯度超离心LabeledE.ColiDNAwith 三、起点、方向和方AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprisesinglereplications.（单子）1、起点（origin，ori或O，原点）开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单起点，即——整个只有一个单位真核生物（Eukaryote）：多起点，即－－一个genome中有多个单位2、方向（过程的顺序性 fork）：中参与的活性区域，即正在发生眼 真核生物的多 多个（1）单双向取决于起点处有一个还是两个（2）的多模多起点、单方向（真核多起点、双方向（真核3、方从新起始（denovoinitiation）或叉式（replicationfork置换式（Discementform）又称D circle从新起始（denovoinitiation）或叉式（replicationfork）或θAreplicationeyeformsathetastructureincircular置换 form，又称D线粒体和叶绿体DNA的方共价延伸方（covalenceelongation）或滚环式 （rollingcirclereplication）由于时产生的滚环结构形状象σ，又称σ 1968年（ReijiOkazaki）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验experiment了研究在脉冲标记实验中所发现的10－20s的小片段在全过程中的发展结局，将实验菌株先进行同位素标记培养30秒，然后转入正常培养基继续培养数分为此将DNA的这种方式称为不连续模式，将最初合成的10－20s片段称如果两条极性单链的DNA均按这种不连续的模式进行，后随链的合成可以在模板单链到1000－2000核苷酸长度后，开始从5’→3’合成片段，而先导链的合成从进化的原则讲，大可不必按片段的模式不断地启动小片段的合成，既耗时又费能。换言之,DNA的应该是按一种半不连续的方式进行，即先导链以连续的方式完成子代DNA的合成，而后随链以不连续的方式完成OkazakiDNA全部为小片DNAIIIdUMPDNA分子中，必然会导致生物的表达与进化过程中的潜在，实际上E.coli依靠了两种机制了dUMP掺入到DNA分子的过程。由dut编码的dUTP酶（dUTPase）能有效dUTPdUDdUTPasedUTP1／1200dUTP分子的DNA分子中的dUMP切除，形成一个无嘌呤或嘧啶的Ap位点（apurinicapyrimidinic链为模板重新聚合和连接，完成切补修复过程.1200dUMP被切除的dutungdut－突变体的脉冲标记实验中，由由于已掺入的dUMP被切除的几率降低，片段变长。选用连接酶突变体第二节DNA的酶学 ofDNA底物： 模板（temte):解开成单链的DNA母链引物（primer):寡核苷酸片段,3’-OH末端,dNTP其它酶和蛋白质因子:合酶（DNA DNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNA (一)DNA聚合酶催化的反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+2、3’－5’ 校对功能 KornbergInfact,thereare5polymerasestodate,althoughwewillfocusonlyonDNApolDNApolDNApolDNAPolymeraseDNAPolymeraseDNApolⅡ：5`3`聚合酶活性及3`5`:–α5`3` DNApolⅢ是主要 为什么子链DNA延伸方向只能是5’(一)模板对的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有相关蛋白的：dnaA、dnaB、dnaC……dna相应的表达产物蛋白质：DnaA、DnaB、DnaCDnaXDnaA：辨认起始位点DnaBDnaC：辅助解螺旋酶使其在起始点上(二DNA拓扑异构酶I（topoI）拓扑异构酶II（topo(三)单链DNA结合蛋白(SSB):表4参与DNA的酶及蛋白DNADNADNA合成RNA引物DNA

1、基本概 DNA子体时3、起点：结构特方向：叉眼单双向的决定条件的多模式D环（置换式4、酶三种 聚合活 外切活 5、DNA的半不连续实 先导 后随BacterialDNATerminationofDNAStudysystem:theE.colioriginlocusoriCisclonedinto smidstoproducemoreeasilystudiedminichromosomes.Initiationisdividedintothefollowing–1.recognitionoftheorigin（识别原点–2.separationofparentalstrandsandstabilizationofsinglestrands（分开双 HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.假定每个都在同样的一个起始点（i）开始，那么距i近的将先被而得多些，远离i的将得少些。因此在一个群体中离i点越近的出现频率越高。假如–双向的，频率以i为中心呈双向梯HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.测定了大肠杆菌上很多的频率，发现以OriC附近为WhatdoesthisexperimentThereisasingleceonthechromosomewherereplicationReplicationproceedsinbothThetworeplicationforksmeetatnear31’onthegeneticmapThestructureofOriCHowisreplicationDnaAproteinbindsto9-mers9nt聚合体DnaAtogetherwithHUdenaturetheDnaBhelicasebindstheopenInitiationofDNAreplicationinE.AlongwiththeHUprotein,thednaAprotein-ATPcomplexbindstothe passingthefournine-mers.Inall,thiscomplexcoversabout200bp.（随同HU蛋白一起，dnaAprotein-ATP复合体结合到DNA上，包围4Opencomplex（开放复合体）和Preprimingcomplex(前复合体ATP这时DnaB和DnaC蛋白进入DNA的熔解区与OriC结合形成前复SeparatedstrandsintheoriCregionarepreventedfromreannealingbythebindingofsingle-strandedbindingprotein(SSBprotein).TheprimosomecomplexAhelicase(DnaB)beginstounwindtheSSBbindstopreventGyraserelievesthetension.PrimasesynthesizesashortstrandofPrimasebindstodnaBproteinatoriCandformsaprimosome体Let’sreviewtherolesofthemajorDnaA-RecognizesoriginanddenaturestheDnaB-HelicasethatunwindstheDnaC-RequiredforDnaBHU-histone-likeproteinstimulatesPrimase(DnaG)SynthesizesRNASSB-SinglestrandedDNAbindingRNApolymeraseFacilitatesDnaADNAgyraseRelievestorsionalDammethylaseMethylatesGATCsequencesatReviewInitiationofDNAreplicationinE.oriCcontainsfour9bpbindingsitesfortheinitiatorproteinDnaA.SynthesisofDnaAiscoupled联系togrowthratesothatinitiationofreplicationisalsocoupledtogrowthrate.DnaAformsacomplexof30-40molecules,facilitatingmelting解链ofthree13bpAT-richrepeatsequenceforDnaBbinding.DnaBisahelicasethatusetheenergyofATPhydrolysis水解tofurthermeltthedouble-strandedDNA.SSB(single-strandedbindingprotein)coatstheunwindedDNAtopreventDNArenaturing.DNAprimaseloadtosynthesizesashortRNAprimerforsynthesisoftheleadingstrand.Primosome(体):DnaBhelicaseandDNAElongationinvolvesanothercomplexofproteinscalledtheREPLISOME(体，颗粒).Itisassembledfromitscomponentseachtimereplicationoccurs.E.colireplicationmachinery(Elongationphase)HelicaseunwindDNAatreplicationforkinareactioncoupledtoATPSingle-strandedDNAbindingproteins(ssb)bindandstabilizetheDNAinasingle-strandedconformationaftermeltingbyhelicasesPrimosomesynthesizesRNAprimersonlaggingDNAPolIIIthetrueE.coliDNATopoisomerase–relaxessupercoiledDNAthatformsaheadofreplication–decatenatesthefullyreplicatedDNAPolIrecesRNAprimerswithDNAbynick- joinsOkazakiConcurrentDNABothstrandsreplicatesimultaneouslyatthesamereplicationThelaggingtemtestrandisloopedtoinvertthephysicaldirectionofsynthesis,butnotthechemicaldirectionDNApolymeraseIIIfunctionsasadimer,witheachcoreenzymeachievingsynthesisononeortheotherstrandIfthepolymerasecomplexismovingcontinuouslyalongtheleadingstrand,howdoesitdiscontinuouslysynthesizeDNAalongthelaggingstrandintheoppositedirection??TerminationofDNASpecificterminationsitesofDNAreplicationexistinE.Terminationinvolvesthebindingofthetusgeneproduct(tusprotein)--terbindingprotein,aninhibitoroftheDnaBhelicase（终止位点结合蛋白，ThisterbindingproteinmayacttopreventhelicasefromunwindingDNA(willthereforehalt停止polIIIandpolIaction).DNAreplicationproducestwointerlockingrings（连环）whichmustThisis plishedviatheenzymetopoisomerase.TerminationofE.coliDNAreplicationTrapthereplicationforks（使叉受到限制Containsequencesthatfacilitatedecate-nationandpartitioningof<300SummaryofstepsinE.coliDNAdnaAproteinmeltsduplexinoriCdnaB(helicase),alongwithdnaCandATPbindstoreplicationfork(dnaCproteinexits).(Pre-primingcomplex)Singlestrandbindingprotein(ssbprotein)bindstoseparatedstrandsofDNAandpreventsreannealing.Primasecomplexeswithhelicase,createsRNAprimers(pppAC(N)7-10)onthestrandsoftheopenduplex2(Primase+helicaseconstitutetheAftermakingtheRNAprimers,DNApolIIIholoenzymecomesinandextendstheRNAprimer(layingdowndNTP's)ontheleadingstrand.4.Asthereplicationforkopensup(viahelicase+ATPaction)leadingstrandsynthesisisanuninterrupted不间断的process,thelaggingstrandexperiencesagap.ThegapregionofthelaggingstrandcanwindaroundoneactivesiteunitofthePolIIIcomplex,andboundPrimaseinitiatesanRNAprimerinthegapregion.Onthelaggingstrand,PolIIIextendstheRNAprimerwithdNTP‘sasthelaggingtemtestrandisloopedthroughthePolIIIcomplex. Aftersynthesisofanascent初始fragmentthelaggingstrandloopisreleasedandthesinglestrandregionfurtherupnearthereplicationforkissubsequentlyloopedthroughthePolIIIcomplex.Steps7-9areMeanwhile其间,PolIremovestheRNAprimerregionsoftheOkazakifragmentsvia5to3'exonucleaseactivitynicktranslationPolIexitsandligasejointstheDNAfragments(onlaggingstrand).EukaryoticDNAcellnuclearomereYeast(Saccharomycescerevisiae酵母:hasmuchsmallergenome(1.4X107bpin16chromosomes)andonly400replicons.SV40(simian 40猿猴40,5kb):isgoodm lianmodelsforreplicationfork.Cell-extract无细胞提取物preparedfromXenopuslaevis(非洲爪蟾)eggscontaininghighconcentrationofreplicationproteinsandcansupportinvitroreplication.cellcycle——细胞从一次有丝结束到下一次有丝完成所经历间期(interphaseG1phase，Sphase，G2phase，细胞可由G1期进入一Mphase:有丝期(Mitosis),胞质期细胞周期是通过多种蛋白激酶复合物催化的蛋白磷酸化来实施调控图Cyclin-dependentkinase(Cdk)OriginsandARS（自主序列Licensingfactorcontrolseukaryoticreplication（特许因子）DifferencesinDNAbetweeneukaryotesandprokaryotesEukaryoticgenomesaremuchReplicationineukaryotesoccursduringasmallportionofthecellDNAineukaryotesisboundbyEukaryoticchromosomesare图MultipleReplicationOnlyonceinonecellcycle(每个细胞周期只有一次Clustersofabout20-50replicons(子) initiatesimultaneouslyatdefinedtimesthroughoutS-phase（20-50个子在S期同时起始）Initiationofeachrepliconwithinaninitiationzonemayoccurat不同区域的染色质起始的时间不同EarlyS-phaseeuchromatin常染色质LateS-phaseheterochromatin异染色质Centromeric(着丝粒的)and omeric(端粒的)DNAreplicateatlastYeastorigin:theminimal11bpBoundbyoriginrecognitioncomplex(ORC起始识别复合体)activated激活byCDK.ARS:AutonomouslyReplicatingSequence（自主序列）。单细胞酵母的起点克隆进原核生物的质粒，由于这些起点序列允许质粒在酵母中而被称之为ARS。TheyeastLicensingfactorcontrolseukaryoticreplication（特许因子控制真核生物DNALicensingfactorcontrolseukaryoticrereplicationDNAThemachineryof–AdditionalfeaturesofeurkaryoticOnereplicationpercycle–Theoriginofreplication–passagethroughaseriesof»Originofreplicationboundby»Licensingfactorsbindassembletheprereplication»Licensingfactors–atleastsix–Mcm2-»Mcmproteinsmovewiththereplication»McmproteinsarethendiscedfromDNAbutremainin»Mcmproteinscannotreassociatewithanoriginofreplicationwhichhasalready‘fired’replicatonThemachineryofAdditionalfeaturesofeurkaryoticNucleosomesandthereplication–Histones–H3H4tetramers四聚体remainintactandaredistributedbetweenthedaughterduplexes–OldandnewH3H4tetramersfoundoneach–H2A/H2Bdimers–separateandbindrandomlytoH3H4tetramersalreadyinceReplicationof Whathappenstothenucleosomewhenthereplication replicationmachinery andopenuptheDNAdoublestrand?Nucleosomesarefoundproperlyspacedonboth strandsimmedia yafterpassageofreplicationfork.图Amodelfornucleosome图AmodelfornucleosomereplicationNucleosomeandReplicationforkNewnucleosomesareassembledtoDNAfromamixtureofoldandnewlysynthesizedhistonesaftertheforkpasses.EukaryoticDNADNAsynthesisisverysimilarinprokaryotesandManyofthesameenzymeactivitiesareNuclearMatrix（核基质Nuclearmatrix:Replicationisspatiallyorganizedbyaproteinscaffoldofinsoluble不溶的proteinfibers.Replicationfactoriesareimmobilized固定onthismatrixandtheDNAmovesthroughthem.Ascaffoldofinsolubleproteinfiberswhichactsasanorganizationalframeworkfornuclearprocessing,includingDNAreplication,omerereplication——TheproblemoflinearomereSolvingtheproblemoflaggingstrand--ChromosomalendsRegulation0fDNA大肠杆菌DNA的调大肠杆菌DNA的调–起始物位点编码调节蛋白质，起点与调节蛋白作用启动–编码的调节蛋白通过与复合物的相互作用确定起始频率和方式。细胞生活周期水平调控：限制点调控，真核细胞DNA的发生是起始调控，如酵母起始受时序调控。BacterialDNA–TerminationofDNAEukaryoticDNA–cell omereDNA聚合酶DNA聚合酶核酸酶DNA聚合酶快慢Regulation0fDNA Chapter DNAdamageand教学要求DNADNA(5.1.1Thereasonsof5.1.2Typesof5.1.3Mutagens诱变剂5.1.4mutagenesis诱变Mutation(突变）=Permanent,heritableal tionsinthebasesequenceofaDNAThereasonsofSpontaneouserrors(自发性错误):inDNAreplicationor Mutagen(诱变物): AconsequenceofthedamagingeffectsofphysicalorchemicalmutagensonDNAMutagen=mutationcausingEssentiallyallmutagensare 物MostcarcinogensareTypesof)-InvolvelargeregionsofDNAPointmutations（点突变-Involveonlyoneor few-AriseduringDNATypesofpointmutations ABCDEEF ABCD-F Typesofpointmutations 碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变Nonsensemutation（无义突变）: 为蛋白质合成的终止子(stopcodon，TAG,TAA,TGA)。 effect(silentmutation沉默突变)Readingframe（阅读框）isoneofthethreepossiblewaysinwhichanmRNAsequenceofnucleotidescanbereadasaseriesofbasetriplets三个一组tospecifytheaminoacidsinaproteinchain.ORFopenreadingframe开放性阅读框fromstartcodontostopWhatisthefirstdefenseagainstOntheonehand,theactualerrorrateofthepolymerase,beforeediting,isoftheorderof0.1%to1.0%.However,theoverallerrorrateforDNAreplicationis1errorin109to1010baseThisphenomenalfidelityisachievedinthreeways.Replicationfidelity（的保真度）First,Watson-CrickbaseSecond,DNApolymeraseshavetheabilitytoedit("proofread")theirwork(3’to5’exonucleaseactivityofthepolymerases).Third,post-replicationrepairofDNA（mismatch(High-energyionizingradiation(电离辐射）: X-raysandγ-raysstrandbreaks（断链），base/sugardestruction（碱基/核糖损伤）Nonionizingradiation（非电离辐射）UVlightpyrimidinedimers（嘧啶二聚体 ogs（碱基类似物）mispair，direct deaminatesCto (Directmutagenesis直接诱变)resultsfromthepresenceofstableunrepairedbasewithalteredbasepairingpropertiesintheDNA.Indirectmutagenesis()Themutationisintroducedasaresultofanerror-pronerepair（倾向差错的修复）. 损伤)DNAsynthesisInsertionofbasesoppositeunrepairedlesionregardlessoftheoriginalsequence（不顾原始序列如何，在未修复的损伤序列对面插入碱基--tomaintaintheDNAintegritybutnotthesequenceaccuracy（只保证DNA序列的完整性，不保证序列的精确性）.DNA bulkyadductsDNAlesions(DNA损伤）：Anal theDNA（DNA正常的化学或物理结构的改变）Alkylation烷基化作用Bulkyadducts聚化加合物Bulkylesionssuchaspyrimidinedimersandarylating芳基化agentadductsdistortthedoublehelixandcauselocalized局部denaturation.ThisdisruptsthenormalfunctioningoftheDNA.键，然后，又由3’-5’校对功能而将之水解。如此反复发生，而产生了一个空耗由于蛋白质仍在不断合成，而DNA不能，细胞也就不能，结果出现细丝状的所谓蛇形细胞，最后导致细胞。Direct(Exisionrepair切除修复Mismatchrepair错配修复Post-ReplicationRepair 后修复binationalrepair（重组修复SOSPhotoreactivation(活 E.coliPhotoreactivationofThymineProcessiscatalyzedinaprocesssimilartophotosynthesisharvestingenergyfromHumancellsdonotcontain(AlkylationofDNACanblockDNAreplicationbecauseofmodifiedbasesthatareSometimeusedinchemotherapy（化学疗法）toblockcellUsuallypurinesarealteredspectrumofproductsMosthighlymutagenicoftheseGuanine→O6–alkyl替换为烷基转移酶特异性地转移O6–甲基鸟嘌呤或O6–乙基鸟嘌呤上的甲基或乙团Exisionrepair切除修复–NucleotideExcisionRepair（NER，核苷酸切除修复 E.coliendonuclease Uracil-DNANglycosylaseIsaubiquitousmechanismrepairingavarietyoflesions.是修复多种损伤的普遍性机 核苷酸切除修复—ExcisionrepairsystemsinEuvrA和uvrB发现二聚体后，uvrA解离，uvrCuvrB和uvrCDNA被DNA螺旋酶(uvrD)DNADNAI和连接酶填补）核苷酸切除修复ExcisionrepairsystemsineukaryotesNucleotideexcisionrepairBaseexcisionrepairBER,碱基切除修复Mismatchrepair错配修复OccursjustafterMustdistinguishtheparentfromthedaughterbinational（重组修复PresentinprokaryoticandeukaryoticOnlypoorlyWeknowitexistsbecauseUvrA-andRecA-cellsaremuchmoresensitivetoUVthancellscontainingonlyonemutation.binationalDependsonRecAproteinimportantfor binationandrepair;itcatalyzesstrandSOSrepair（SOS修复UVreactivation（紫外激活反应）Wreactivation（W激活反应50年代J.Weigle发现，用经紫外线照射后的噬菌体用低剂量UV照射过的大肠杆菌时，噬菌体的存活率比未用低剂量UV照射的大肠杆菌明显增加，突（W激活反应）TheincreasedsurvivalintheUVirradiatedhostisduetotheinductionoftheSOS-repairsysteminthehost.（存活率上升是由于紫外线照射引起了寄主SOS修复Metabolicsystemthathelpsthecellsurviveinperiodsofpotentiallylethalstresses（在UVirradiation（紫外照射TreatmentwithDNAmodifyingenzymes（DNA修饰酶处理Inactivationofgenesessentialtoreplication（DNA必须的失活SOSrepairDiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesWernersyndromeprematureaging过早衰老beginningin20’slifeexp.Predisposition易患病的体质tomalignanciesDiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesBloomsyndromedwarfismimmunedeficiencybutterflyrash皮疹sunpredispositiontomalignanciesofalltypes(uptohighsisterchromatidexchange,other DiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesRothmund-Thomsonsyndromeskin,skeletalabnormalities骨骼畸形sunPredisposition易患病体质to somaticwholechromosomeaneuploidyDNA是遗传信息的载体，它需要有极高的保真度，这不仅依赖于 –Exisionrepair切除修复( binationalrepair（重组修复第6章RNA细菌的转 1956年E.Volkin和 这种“信使”Jacob和Monod将它定名为:信使RNAMessengerRNA)或mRNA1. 1963J.Marmur和DotySpiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8SP8DNA双链有“轻”、“重”’-利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli6.1.4RNA合成和DNA的区转录的底物是rNTP，的底物是细菌的转1.全酶(HoloEnzyme)和酶(Core(1)全酶（Holo依靠空间结构与DNA模板结合(σ 半衰期：数小时 转录效率低，速度缓慢（σ的结合（2）酶（Core作用于转录的延伸过程（终止依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA半衰期：60 RNApolcoreσ Enzyme识别启动子的 tamaBox(－35区), •酶的组建因促使RNApol与DNAEditing(排斥与模板链不互补的碱基与Rho（ρ）因子竞争RNA构成Holoenzyme后,β因子含有两个位点Isite siteRifs):该位点专一性地结合(Esite(elongationsiteRifR):对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能β’ 有义DNA链结合位点（β’亚基提供双链DNA解链位点（α亚基提供原核生物RNApolCore)RNApol物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。CAP-cAMP（表达调控的正控制位点CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物活化蛋白，环腺苷RNApol的进入（结合） 2、RNA聚合酶的进入位点（1）tama框（tama Pribonow框（Pribonow-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点——结合位点（B位点一致序列 4转录起始位点一、终止子的种类1ρ因子的终止子(内在终止子)1ρ因子的终止子(强终止子结构特征☻发夹结构的突变可转录的终 二是6~8个连续的U串(发夹结构末端2ρ结 IR序列中的G／C对含量较 造成高度延宕（典型的有60秒左右RNApol6~8个连续的U串可能为RNApol与模板的RNA－DNA之间的rU－dA结合力较弱于是：RNA－DNA解离 三元复合体RNApolU2ρ通读（readthrough）：ρ因子的转录终止过程中，RNApolIR序列之后，虽发生一定时间的延宕，但如果没有ρ因子存在，则RNApol会继续促进转录终止的活性，NTPasea、ρ因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5’c、ρRNApolRNAPol转录ρ因子跟在RNAPol后沿RNA转录终止,释放出RNAPolρ子和RNADNARNA值，才能配合ρ因子与RNApol的作用序列不同的终止子→不同的终止程度 编码链 转录方向都是5’→（1）全酶（2）酶(coreα2ββ’DNA启动子概念原核生物启动子的特点②-10bp处-TATAAT- ③-35bp处- (tama封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinary开放的启动子二元复合体（openedbinarycomplex）真核生物的6.3.1真核生物的RNApolⅠ核 活性所占比例最大转录rRNA（6.8S、18S、RNApolhnRNA、snRNAhnRNA（mRNA前体，核不均一 heterogeneousnuclearsnRNA（核内小分子RNA，small 表6-2真核生物的三种RNA 28S,18S,6.8S感 表6-34RNApol分子量500KDa,7~12大亚基中有C末端结构域(carboxy C端重复七肽，不同生物中重复数目不一样（酶活性RNApol→三种启动子→三类，Ⅰ Ⅱ Ⅲ1、RNApolⅡ的启动子——2、RNApolⅠ的启动子——3、RNApolⅢ的启动子——位于转录起始点的上游,通用型启动子（无组织特异性siteTATA框（HognessGoldberg-Hogness框位于－30一致序列为定位转录起始点的功 CAAT框（CAAT增强子GC（GC序列为八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件） B元 一致序列为 一致序列为,启动子（corepromoter）或元件（coreelement），位于-45到+20，负责转,可增 5SRNAtRNAb、上游启动 最早发现于非洲爪蟾的5S★非洲爪蟾的细胞提取液作为体外转录体系，进行缺失试★以不同长度的5SrRNA为模板进行转录。结果★5SrRNA的启动子位于内第一类：含A框和C框（5SrRNA）第二类：含A框和B框（tRNA、VARNA）☻RNApol图6-23真核RNAPolⅢ的内启动子和外启动

♫转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与, 成复合物，协助RNApol定位于转录起始点。RNApolⅡ的转录起始RNARNApol单制

需要二种辅助因子：UBF1、表6-6RNApol TBPRNApol的转录起始都需要RNApolⅠ的转录起始过程中,TBP是SL1的组份，起定位RNApolⅠ的作RNApolⅡ的转录起始由TBP识别TATARNApolⅢ的转录起始过程中,TBP起定位RNApol TBP起定位作用,所以又称定位因子 Transcription1、起始时，σ因子有利于ββDNA专一性结合所要求的构起始后,σ因子解离,ββ’2、Euk.多种辅助因子的共同作用来保证这一转变二、延伸过程RNANTP不断加到RNA3’-OH★形成一个磷酸二酯键后，酶向前滑☻1RNApol结合和转录的DNA模板区域，有17bp胰脏RNAase——其长度10bp（确2 拓扑学问RNApolRNApol…..DNAΦ超缠问题的解决靠DNA旋转酶ΦRNA-DNA3RNA30~50个核苷酸／秒,与蛋白质的合成速度相近（15模板DNA中G／C（G／C8~10）转录的终止 RNAProk.和Euk.都具有－－一种表达调控了解很少（3’末端） 发夹结 2RNApolⅢ的终止子类似原核生物（发夹结构U串且保守性很强（酵母→人1、真核生物RNApol：3、RNApolI第6章RNA细菌的转转录后的加工(posttranscriptional是指将各种前体RNA分子加工成成各种RNA。加工（processing）有三种形式表6-10RNA加工反应的分类一.原核的tRNArRNA的加工tRNArRNAtRNA①串联的tRNA分子都是相同的，如在27’的tRNATyr-少数的tRNA前体为单顺反子图6tRNA去尾，形成3’-OH末端；RNaseF，RNaseD(4tu),D臂的2甲基鸟苷(2mG)，TψC臂的假尿苷(ψ)和反子环上的2异戊腺苷(2ipA)图6-三种tRNA前体的剪切图6tRNArRNA在E.coli中rRNA有7个转录单位,名为rrnA-rRNA序列是保守的,每个转录单位都含有等比例的16S、23S、5SRNA及一个或几个tRNA每个转录单位转录成单个的RNA前体分子，经剪切后变成为成RNA的分子rRNA前体的加工是由RNase(一)tRNA真核tRNA的和原核不同 簇排列，间有间隔区 真核tRNA一般都比原核tRNA得多，如酵母约有400个tRNA③)都要加CCA酵母tRNA在未处理前先进行凝胶电泳，结果只显示一条带，且跑得较慢，表明此为tRNA图6-酵母tRNA在体外的剪切真核tRNA内含子切除的特点 没有交界序列，也没有内部引导序列；酵母tRNA前体内含子3’和5’端的剪切是由内切酶的不同亚基催化的。亚基Sen34,真核tRNA的加工和原核的区 真核tRNA 真核生物的18S，5.8S和28SrRNA 体，5SRNA是和它们分开转录的，这和原核的rRNA不同。切除5′端的前导序列,即外部的转录间隔序列转录间隔序列（ITS），产物分别为20S（含18SrRN段）和32S。mRNA个单个的多顺反子mRNA，然后经RNaseⅢ将其切开，四个两两分开，最后再各自进行E.coli90’/100’T7噬菌体早期区转录单条前体RNA，经RNaseⅢ剪切成5条成RNaseⅢ在T7茎环上的典型切割位点(GENESVIFig 、真核mRNA前体的加(一)核内不均一RNA（heterogenousnuclear 3′端有poly（A）尾巴； (4) 茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；15′23′3如呼肠，如疱 在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子在次末端核苷酸的核糖上的2′-0位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-0）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontdenucleotidestructure）。图mRNA53’端约长200bp(大多数Euk.的mRNA) 最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有3’添加poly(A)E.coli的poly(A)聚合酶早 年就已发poly(A)与mRNA的有b、胚胎发育中，poly(A)mRNA（非poly(A)cpoly(A)mRNApoly(A)剪切因子(CF)AAUAAA下游11－30nt二．I类内含子的剪接1、RNA拼接（RNA 5’拼接点或左拼接点（内元上游1982Davies 结构（centralcorestructure）:在有些内元中，含有4个重复的保守序列，长度为10~20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用 ★Ⅰ类内元（groupⅠ）:含有中部结构的细胞器核★Ⅱ类内元（groupⅡ）:不含有中部结构的细胞器线粒体核★Ⅲ类内元（groupⅢ）:具有GU－AG特征的边界序列，核mRNA前★tRNA的内元均位于tRNA的