生物大分子分离纯化技术

第二章

生物大分子分离纯化技术12.4.生物大分子的色谱分离纯化技术22.4.1高效毛细管电泳

高效毛细管电泳(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)是荷电粒子在直流高压的作用下，在毛细管中迁移，从而进行高效、快速分离的一种电泳新技术。其分离是基于带电离子在电场中的不同的电泳淌度。它的基本原理与常规凝胶电泳或自由电泳并无本质的差别。所以，HPCE可以看成是一种仪器化程度比较高的电泳方式。3由于毛细管具有良好的散热性能，从而可以在毛细管两端加上高达30000V的高压、分离可以在很短时间内完成，分离效率非常高。这种方法所需样品体积只有L-nL级。所以，HPEC法的特点为：高效、快速、微量、易于实现自动化，而且溶剂消耗少、环境污染小等等。4仪器

HPCE仪器的基本组成如图所示，它由毛细管，带电极的容器，高压直流电源，进样系统，检测器及数据采集和记录系统组成。比较先进的HPCE仪器还配有毛细管恒温设备，自动采样器，微制备组分收集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。561．毛细管HPCE在毛细管中进行，管内径一般在25~100m之间，外径在100—400m之间．长度为0.1~1m。除了石英毛细管外，玻璃、聚四氟乙烯(PTPE)及聚氟乙烯-丙烯毛细管也有使用。72．进样系统为了保证HPCE分离的高效性，进样系统应尽量把nL-pL级的样品以最短的样品区带引入到毛细管中。一般可采用电动法或流体力学法。83．高压直流电源高压电源需提供高达30kV的直流电压。检测器位于毛细管的接地端，电流在3~300A之间。电源应能以恒电压或恒电流(ITP)或恒功率的方式工作，其稳定件应达到设置值的0.1%。另外，电源的正负极应可以切换，以适应带不同电荷的样品的分离。94．检测HPEC这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测器的高灵敏度，实际已经采用的检测器类型有多种。10HPEC中的主要检测技术检测原理最低检出浓度(mol/L)最低检出量适用范围紫外－可见吸收法10-6－10-410-15－10-13通用/特殊情况基于一般光源的荧光法10-8－10-510-18－10-13特殊情况基于激光的荧光法10-12－10-910-21－10-18特殊情况热光吸收法10-8－10-510-17－10-14通用/特殊情况折射率法10-7－10-510-16－10-14通用电导法10-8－10-610-19－10-17特殊情况安培法10-8－10-610-19－10-17特殊情况质谱法10-9－10-510-17－10-15通用放射测定法10-9－10-710-19－10-17特殊情况11分离模式

HPCE的操作模式有多种，如毛细管区带电泳(CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)；毛细管等速电泳(CapillaryIsotachophoresis，CITP)，毛细管胶束电动色谱(CapillaryMicellarElectrokineticChromatography，CEKC)；毛细管凝胶电泳(CapillaryGelElectrophoresis，CGE)和毛细管等电聚焦法(CapillaryIsoelectricFocusing，CIEF)等。12CZE是基于溶质在自由溶液中淌度差异的电泳分离方法，是目前应用最广泛的一种，如氨基酸、多肽及无机离子的分析，手性对映体分离，蛋白质纯度鉴定及构型研究等。13CGE主要在生物学上用于大分子的分离分析，如蛋白质和核酸。它是基于分子的尺寸，让样品在合适的起分子筛作用的聚合物网孔内进行电泳分离。CGE可用于DNA序列分析，蛋白质分析。14pBR332DNA的MSPI酶解片段混合物的CGE分离(峰(bP)：1，26；2，34；3,67；4,76；5,90；6,110；7,123；8、9,147,10,11，160；12，180；13，190；14，201；15，2I7；16，238；17，242。缓冲液：TEB。进样：3s，30mW。TEB组成：89mmol/LTris,89mmol/L硼酸盐及2mmol/LEDTA)。200V/cm，毛细管有效长度：7cm，EB的浓度为1g/ml15标准苦蛋白鼓质的埋分离162.驼4.烤2液相鉴色谱裂法液相飘色谱归是目驾前对割生物阿大分非子的亩分离茶纯化半能力狮最强齿、效漂率最控高、排使用塔最广芳泛的旧手段寸之一梯。液献相色辞谱大机都在遗室温絮下操辜作，财所用因流动唯相可括以用昆与生轰理液跌相近醉的缓尾冲水梢溶液心。所委用固健定相稼的表躲面经蜡过化贩学修博饰和序覆盖肺，为鼻生物主大分偏子的幕分离喷分析加提供竖了温川和的傅条件听，有脾利于况保持莲生物办大分匀子的欢构象素和活川性。17在生炉物大无分子陪分离昌分析亡及纯璃化中部最常翻用的迹色谱痛方法平是空甩间排迫阻色倚谱法抛、离督子交琴换色灵谱法电、反即相色耕谱法厌、疏旺水作钞用色灵谱法栏、亲叹和色尸谱法浴、羟酿基磷愧灰石(用于妄单链鉴和双岩链DN堡A的纯旱化和纪鉴定)及液—液分伍配色稍谱法犯。18核酸威的色食谱分您离法19酶及回蛋白语质的锈各种碑分离救纯化磨方法单的比咸较201排阻糊色谱排阻贞色谱(S谊iz尚e猴Ex哪cl堆us茂io坏n刺Ch奇ro同ma侍to功gr咐ap画hy返,纯SE物C)也被闸称之便为凝填胶过住滤色坊谱是20世纪60年代屑发展总起来欣的一妹种特吴别适眯合于焦生物槐大分音子分厉离和孩纯化壳的技蠢术。21基本书原理排阻狱色谱讽是依袜据分伏离样膜品物镜质分垮子大坡小而遍进行刚分离青的一复种方鹅法，烟其固股定相喊由一铁种惰腰性的仇凝胶现颗粒案构成予，颗锯粒内舟部有哭许多嘉网孔穴。颗产粒和鹅网孔漆的大贸小都吨可以踏人为均地去闪控制萄和选醉择。阁在分价离过昂程中射，比将网孔然大的思分子陵不能铅进入碗网孔枣的内神部，泛它们氧只限跌于在奴凝胶掠颗粒何之间草的流纱动相俘空间怒里向飞下流督动，作其流奖程短慎．流疾动速世度快津，而套比网垦孔小梦的分谢子能叫扩散猫到网推孔的菜内部吗，因求而向法下移香动时警所经反历的绸流程饿长，养下行苦速度铜慢。而最终狂所产靠生的涛结果贫是：胡分子毅越大光移动骨的越凯快，露从而颗达到慨大小峰不同左分子冻间的紫分离骗。2223凝胶倚色谱熊的物查理特恐性1．凝抛胶颗纤粒的亮大小掏和形政状层析衫用凝丙胶的影形状弱均为广球形菜，内溉部具痛有高软密度杜网孔尽，并戚能形恐成均庙一的郑柱床番。2．排例阻极杂限(E狠xc砍lu验si冠on拔L按im塑it陪)排阻济极限秋指不浪能扩旋散进铺入凝镰胶颗剃粒网蜡孔内轿部的曾最小软溶质废分子爬的分独子量锅大小蜓。排底阻极偶限的壮涵义漫是能汁有效刮分离饭一定鹊形状肺分子阔的分手子量陶最大侮极限抓。大涌于这渣一极症限的凡所有糕分子轨，都亲在同舒一区屡带内才被快盏速洗林脱出绝。典向型的鸣葡聚粘糖凝哀胶Se谦ph糕ad吗exG-岩50永(G－50惕)排阻倦极限考为3.涝0×有104243．分轧级分近离范身围(F速ra舞ct耳io歉na酷ti储on哗R陪an配ge镰)该物坏理性郑质表做示某酸种凝绕胶．垃允许德溶质幅分子选量在折多大镰范围翻内能室得到陡线性扣分离肾。如上饼所述帮的G－50的分交级分由离范秒围为1.合5×非103－3.少0×椒104。4.得水乔率(W站at柏er猫R碍eg喉ai倡n,Wr)每1g干凝逆胶吸岁收水兆的克袭数就厌叫得取水率焰。对G－50凝胶恼，其岗得水样率为5.露00均.38，这率个数僻值只救表示慨吸进你凝胶刚颗粒应内部嚼的水东分，栽不包晒括凝弓胶周针围的箩水分听。255．床旨体积(B寨ed迹V报ol再um飞e)每1g干凝疗胶吸姻水膨钱化后臣的最塑后体揭积就窑叫床命体积车。6．外笔水体歇积(V呆oi兔d训Vo勇lu转me贩,鸦V0脚)凝胶荡装柱柏以后衬，凝触胶周元围所宵有空仁间的遗总体妻积就杰叫外些水体象积。7．洗泡脱体钻积(E公lu矛ti室on筒V废ol采um挺e,Vc)指从酷柱床敬上将谷样品夜中某迟一物弱质洗玻脱下摄来所腹需洗然脱液储的总妖体积惠。26在凝哈胶层不析中擦，最递常用锅的四级种凝蛛胶是裕：葡聚端糖凝凶胶(De关xt办ra爬n)、聚丙糖烯酰周胺凝常胶(Po部ly们ac耕ry洁la昌mi借ne)、琼脂珠糖凝生胶(Ag首ar偶os泪e)以及寸后两颗者的裁复合歪凝胶贞。27凝胶思排阻哪层析蔬的应印用凝胶数排阻遭层折纯的用认途非着常多墨，主恼要有括以下架两个租方面范：(1叼)脱盐在生录物大泄分子赏纯化僻过程涝中，驳常要鉴除去炊无机梳盐、惭有机堆溶剂程及其给它小无分子甩杂质凑，利识用凝牧胶排迹阻分杰离是睬一种净廉价火、简须便又次快速闸的方艺法；(2僵)生物向大分武子纯夕化凝胶策层析鱼应用星最为像广泛香的一控个方拿面是独生物矿大分投子的狠分离且和纯乖化，腾因为马凝胶转具有抄根据瓣分子住量的汉大小芹而分您级分谣离生除物大店分子么的能饿力。282亲和匀层析(A天ff丽in达it株y厕Ch测ro泉ma却to莫gr洗ap责hy喂)常规芽层析宋的不坑足大多男数层年析法乏都是竹依据著样品废物质晌和固鼓定相脸之间山的非羽特异旷性相录互作世用，徒如根其据样痛品物刑质的尾电荷舱性质肢、大蛮小、桥极性掘、分纯配系处数、件吸附输等作妙用的桨差别棒进行切分离筛的。样由于露选择不性不交够强死，故洪分离扰效率治不高哭。29近年挡来又愈发展眯了一烧种新小的层恩析法排－“昂亲和顿层析荐法”拾，又填称‘帝特异翅配基转层析主法”蛙。一些个生物质大分型子能衬和高贪分子柜化合樱物发民生特驰异性搅的化迫学反幅应，醉这些惧反应的是可吵逆的易、特钥异的网。根拿据这掉一性捏质所百进行深的分旁离就受叫亲塌和层国析。休与生肆物大斥分子卵可逆局而又追特异协性结樱合的德分子村就叫馆配基阵。30基本搏原理亲和隶层析恰的原烤理可恳用一约个亲督和对乖来说特明。寻如生坡物大愉分子蔽抗体请可以帐与其管对应符的抗山原发袍生如木上所旱述的袖亲和日作用耽。若剪把抗饰原固嚼定在抬类似鞭于凝仍胶的料固相拌载体到上得孔到亲花和固葬定相竹，在办进行唉层析我分离墓时，斩抗体埋与抗浴原间攀发生尸特异崖性的嫌亲和既作用访，而芳其他让的物冈质不览能与躲固定趣相结肥合。镇因而福被洗冷脱出进。然客后用迫一种匪特殊误的洗士脱剂牲把抗摇体从封亲和冒柱上搂洗脱烫下来炕．也性可以后固相腾抗体甩来提径纯、桃分离脸抗原描。亲代和层葛析已景被广筛泛地觉用于宏酶类蜂、运爷输蛋冷白、忽抗体迅、激舌素受拌体蛋乏白、抹药物薯结合丈蛋白必、核蹦酸、差神经塌递质削蛋白北以及询其它起生物常大分倦子物附质的躁分离魂分析川。3132抗体熄亲和顿层析稻纯化诱示意清图33亲和佛层析头的成残败取疑决于寻精细黄的实王验条瓦件的瞎选择鉴，其抵中最篮主要伙的是约制备姥带有塔共价被结合雅配基掀的固佛定相查以及柿洗脱欺条件坏的优并化。34亲和吃层析策的固翻定相要载体挣必须箱符合纵以下跳要求(1近)在实切验条池件下宵具有狭化学文及物劫理稳糖定性(2酱)非特神异性蛛吸附鸭要尽苏可能腹小；(3衬)具有剂均匀搭的网必状空挨隙结报构；(4日)具有旧和配愁基结神合的脚活性捕基团隶。35亲和斯色谱远的应胀用基于做羟基吩磷灰原石固责定相扛的亲不和色座谱可啦用于暮单链诸和双刻链DN侨A的纯饮化和但鉴定龄。DN垮A与羟侮基磷东灰石毅的相壤互作逢用基讽于DN喂A磷酸岗酯骨承架与北羟基怀磷灰品石中骑的钙柄离子佩间的肯相互份作用瓜。洗顽脱时锻用磷疗酸缓途冲液球，核声酸分盯子的亲亲和照性受饥其分解子中戚磷酸哀基团炼的控来制。蚊单链DN时A分子懂的结乖构可派变无视序，耕它与锹刚性妈有序申的双术链DN胀A分子便相比猎，其肃亲和每性要凭小。根杂交料的双随链DN甩A及部遮分变山性的DN冠A分子注的亲云和性面适中凡。因梢此，扬单链DN俭A分子宽的结宿合弱学，结赤合的替双链DN短A分子绩可以跃通过柿增加泥磷酸杆洗脱饮缓冲咐液的逮浓度易使之怎解离绕。363离子赠交换隆色谱离子疤交换睛色谱(I感on增E大xc释ha割ng昼e锡Ch壤ro迁ma柜to冲gr叔ap蔽hy紧,洋IE摔C)是生铺物大兔分子组分级黑分离掀的最巩可靠絮的方右法之危一，罢它分迎离蛋菊白质练、核匠酸等园是依祸据生割物大降分子悔的电此荷特祖性，索因而与依赖备于系询统的pH及分桂离物盐质的氏等电火点(pI)。当含缓冲薪溶液行的pH高于速生物佣分子尸的pI时，犯应采会用阴奔离子薪交换首树脂漠，反铸之，蚕应采厉用阳暂离子御交换狡树脂扒。生物稠大分朴子非班常小烈的电掘荷差枯异都甚可以速用IE摆C法分瓜离开胞。374反相巨疏水家作用碌色谱倡法反相屯色谱(R熟ev哈er搁se侄-p发ha擦se季C魔hr骆om片at捷og光ra付ph在y,州R握PC补)及疏踢水作诉用色帖谱(H桶yd范ro龙ph疯ob路ic宏I锁nt屠er饭ac决ti是on赖C马hr滥om杀at瓶og站ra猴ph思y,皇H驴IC密)法依闪据的这是生再物大放分子垄表面颈疏水蜜性。反相括色谱矛是基徒于溶贿质、拜极性吃流动虾相和摔非极五性固午定相迅表面合之间数的疏絮水作还用建纽奉立的同一种井色谱垒模式填。而锄疏水鄙作用篮色谱录与反抢相色合谱的蠢原理涛相同块，只苏是填鲜料表浊面疏该水性倡弱一接些。38蛋白塔质及丝式多肽当的疏疮水基斑因一有般包职埋在铸分子捕的内黄部．里许多眠生物捆大分蜡子尽许管是站亲水附性的赠，但肯它们欧也有钳足够妙多的妄疏水独基团反暴露种在分昆子的侵表面援，因凯而可洞以与仔载体阶表面伍的疏狮水基介团发程生相石互作芹用。春在上止述两定种技磨术中副固定肢相都骄由具垃有疏仅水表枯面的治色谱扎基质没所组朗成，扣但与避反相厘色谱精相比留，