疫苗制造基本程序

疫苗制造基本程序葛俊伟项目一细菌性灭活疫苗制造项目二细菌性活疫苗制造项目三病毒疫苗的制造内容项目一细菌性灭活疫苗制造灭活细菌疫苗通用制造程序

菌种的选择菌液培养灭活

配苗浓缩

菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多，但制造的基本程序差别不大。

一、细菌性灭活疫苗制造基本流程菌液佐剂+乳化分装和保存原料配置灭活菌液灭活一、细菌性灭活疫苗制造（一）菌种与种子

1.菌种

制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。2.种子培养将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗（二）菌液培养

大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。

菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗（三）灭活

灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表所示。表几种灭活菌苗的灭活方法

一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗（四）浓缩

为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法离心沉降法羧甲基纤维沉淀法

以上方法可使菌液浓缩一倍以上。此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸—食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗

（五）配苗与分装

由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。

氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。

配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗项目二细菌性活疫苗制造弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。种子液通常在0～4C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。

细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌种与种子二、细菌性活疫苗制造菌种的选择菌液培养浓缩配苗按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液菌液于0～4C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格后使用。（二）菌液培养二、细菌性活疫苗制造菌种的选择菌液培养浓缩配苗经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。（四）配苗与冻干为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2%～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。（三）浓缩二、细菌性活疫苗制造菌种的选择菌液培养浓缩配苗流程西图1—啄—细菌厅疫苗糟制造疫工艺园流程蛋白质、肉浸液等原料培养基细菌分离菌种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒检验配制灭菌检验配制灭菌原料佐剂灭活菌液配苗、乳化灭活疫苗培养菌苗原液配苗活疫苗保护剂菌液分装、冻干分装灭活原料活化种子项目三病毒翠疫苗轰制造病毒循性禽扒胚培辆养疫蒙苗制迁造病毒监性细扫胞培浸养疫至苗制狮造病毒姐性动君物组喇织疫忽苗制皆造一、农病毒隐性禽滚胚培不养疫代苗制捆造受精捐卵应柿来自SP啄F鸡群，至面少源山于未敢用抗触生素胳药物笑的非呆免疫违鸡群像，以咏免受首母源镜抗体柳的干倒扰和局残留床抗生铜素的荒影响控。从受锯精卵亦入孵困开始绑至培每养全厌过程弓都应酿保持无菌，要衬求一旅定的锁温度闪和湿晋度，岭且需堆不断惨翻动孟，然类后选窃择。环选择渴一定植日龄运、发属育正卸常的侄胚用僻于接渗毒培咏养。痘病南毒、跪正粘吩病毒往、副侵粘病骨毒和塑疱疹坝病毒欠等一阴类生眼物制公品，天目前古仍然愤利用减禽胚遵特别歇是鸡屈胚制绪备，耐如鸡甲新城惨疫苗捷、禽叉流感瓶疫苗公、犬助瘟热萝鸡胚味弱毒魂疫苗饰等。禽胚乖疫苗恳生产植的原足材料辣来源贸方便帖、质更量比沃较容浑易控挨制，陆制造别程序季简单滴，不出需要简过高乖的设诉备条棒件，毕生产债的疫春苗质伏量可毕靠。（一冲）鸡林胚选帅择鸡胚选择种毒与毒种继代接毒与收获配苗（二欲）种闸毒与毅毒种胖继代目前泛适应磁于鸡怖胚的呼种毒失多系清弱毒田，包冲括自阿然弱雅毒与容人工数培育说的弱稍毒两醉类。打各种竟制苗荡用的富种毒牌多数川由国粉家菌侄毒种晌保藏驼部门程或指推定单备位保止存，碎保存校的种画毒多愿为冻随干毒债。冻干已毒种晴需按希规定确要求农在鸡挡胚继步代复絮壮，虽通常客继代3代以恼上，狭经检披定符件合标璃准后咽方可紫作力滥生产横疫苗警的毒摩种，映毒种贷检定足内容坟包括套无菌序检验事、毒带价测索定和鹿其他钞项目勾的检言定等不。一、枪病毒誓性禽梁胚培移养疫枝苗制溪造种毒脆与毒桃种继仇代鸡胚选择接毒与收获配苗（三认）接恭毒与慎收获鸡胚距接毒取涉及啦接毒举途径夕和接傍毒量浆两方训面。范根据忧不同渐的病炭毒与隆不同太疫苗毙生产彩程序楚，选奔择最葵佳接恐种途涂径和坏接种裕量。接种顺途径贱：绒聚毛尿献囊膜烂接种11~12日龄培胚尿囊触腔接倒种9~11日龄届胚羊膜食腔接电种10~12日龄萌胚卵黄门囊接透种5~8日龄依胚如鸡包新城涝疫I系和II系毒不采取卷尿囊币腔接凭毒，上前者掏接种10-3稀释誉毒种0.渗1m策l，后县者接鞭种10-4稀释苏毒种0.隆1m融l。鸭促瘟鸡距胚化障弱毒洪疫苗木采用枪绒毛幸尿囊氧膜接率种50年-1扶00倍稀巾释毒0.触2m突l。1.接毒一、巴病毒稼性禽夫胚培仍养疫净苗制酒造接毒径与收才获鸡胚选择种毒与毒种继代配苗鸡胚惠接毒筑后培偏养增升殖的钢时间泛和温垫度、智湿度议以及沟收获器的标蝇准与等内容早物依购不同粥的病铸毒和验不同嘱的疫捉苗而支异。如鸡糕新城鲁疫I系疫命苗，乐接毒窑后于38婚.5~39C、相藏对湿循度60授%~间70涝%条件哲培养狼增殖瘦，收鸽集接匆毒后24概~4截8h内死阔亡胚升，置0~鸣10更C冷却4~姑24紧h，收姥获胚傲液，西进行射无菌包检验肿，供扶制备句湿苗赤用。也可维收获纺胚液渐、胎晌儿及谢绒毛仆尿囊滴膜混仍合制拳成乳鞋剂制吸备冻绝干苗慌。鸭瘟椒鸡胚尝化弱征毒疫择苗，享则收蛛集接贼毒后48扬~1脱20靠h内死批亡的稻鸡胚前，冷姓却后位采取什绒毛场尿囊浆膜、牲尿囊辞液、奇胎儿动制造猎冻干员苗用鉴。2.培养葱收获按规持定收墨获的丹胚液蒙、胎内儿和个绒毛呼尿囊爬膜乳叹剂经昆无菌泪检验汪合格图后即周可进赤行配谨苗。1.湿苗通常脊于鸡宪胚液奴内，肺按每建毫升瓶加入逐青霉丽素和差链霉窃素50厕0~10呼00而U，放悉置0~10C冷暗躬处处天理后值分装食。2.冻干追苗经无晌菌检涛验后酿合格副的胚赏液或家胚液奖、胎救儿、饶绒毛置尿囊搅膜乳愧剂，悉按比心例加堤入保府护剂避，充紧分混喊合后昨滤过像，于妈滤液饥内按汪每毫误升加致入青杯、链款霉素50惭0~逮10钥00始U，混签合后归分装捏冻干禽。3.灭活梨苗收获争鸡胚哄液经慕无菌镇检验蜂及毒林价测险定合呼格后婚，按梢规定累比例挽加入忆平衡氏液，月按不元同病练毒的镜灭活搂温度状、时剂间进冲行灭足活，默加入李相应版的佐刚剂，殃制备赴成灭倘活疫冈苗，甚放置4-捷10C保存。（四特）配炕苗一、扯病毒秀性禽指胚培府养疫嗽苗制磁造配苗鸡胚选择种毒与毒种继代接毒与收获流程液图2—理—病毒管性禽昼胚疫跳苗制典造工阵艺流需程受精显卵禽街胚毒率株种律毒灭活凶病毒钥液鉴定培育检验检验配制原步料佐杂剂配苗使、乳康化灭活眠疫苗含病稳毒尿伞囊液退或禽怪胚组猪织含病趋毒悬绪液配巧苗活疫伞苗保护兵剂分装困、冻粥干分纯装灭活原队料种真子扩增收获配制纯化始病毒昂悬液接种二、白病毒府性细叛胞培睬养疫毫苗制捆造用于童制苗毁用的锹种毒家应经沟毒力删、最辣小免翅疫量讯、安坐全性蚀、无蔽菌检载定合格，通绵常为捐冻干步品，梨由国额家指蛮定的嘴苗毒益种保岂藏部捕门检嚷定分难发。领取裕的种怜毒应熊按规姐定在坟细胞姻继代护培养匆适应旗后用塑作毒章种，上制苗改用毒排种应心按规患定控承制在一定雄代数牺以内，或炉为湿剖毒毒歌种，奖或为聪冻干房诚毒种掀。细胞咳培养己疫苗谨有细鸭胞培绢养灭活疫苗谜和细宇胞培廊养活疫苗臭两类亚，前敞者多佩以强息毒毒遥株培段养增足殖制兆造，节后者获则用究弱毒扛毒株谷增殖求生产惜，两跑者的技制造掌程序社既有序相同袭之处沸，又鞠有区稠别。等由于踏病毒撕不同堡与疫强苗性鼻质不邪同，稿所采圆用的脉细胞吩及细锅胞培晋养方掏法也概有所萄不同（一霸）种他毒与歇毒种鲜继代接毒阿与收凭获种毒饮与毒龙种继杂代配苗细胞礼制备制造透疫苗今用的吐细胞遍大体畜为原玩代细幼胞和毫传代页细胞拼两类蚁，根石据病妖毒种宏类、话疫苗草性质阁与工千艺流裕程选欧择不蛾同的催细胞检。选择诵的依烘据包明括：脾病毒丑的适纳应性乌高、它毒价母高、绪细胞带来源冤方便称、制样备简童单、昌生命退力强植。如猪争瘟兔逃化弱渠毒牛成睾丸宰细胞盆疫苗翠采用价犊牛抹睾丸古原代葡细胞嘴；脊领髓灰婶质炎闪活疫俊苗选配择ve航ro细胞福；狂渐犬病撕弱毒梅细胞外适应法疫苗苍采取BH志K2烂1细胞饥增殖凭病毒曲等。（三艘）细煮胞制巨备接毒乱与收焰获种毒歇与毒梳种继看代配苗细胞研制备二、带病毒浙性细凝胞培胆养疫荡苗制慰造培养邻细胞旗和增驶殖病肾毒用乌的营偶养液陷又称掌培养捞液，陆通常奸分为投细胞陪培养退用的押生长越液和盛病毒医增殖荣用的旦维持阶液，坛两者语不同厦的之闲处通否常只炉是生钳长液蔬内含递有5%蜜-1誓0%的血构清；帆维持结液血愤清浓责度为2%扫-5拥%。不同生细胞狭所需缸的营俗养成姨分和抬生长快条件快不尽吐相同望。目前鸡常用浩的细侄胞培铺养方花法为嗓静止增培养草和转徐瓶培越养，挨至于暑微载层体培雅养和竭悬浮怜培养插在我坐国尚怒处于夸试验柳之中倍。（四尺）接带毒与掠收获病毒捞接种树培养胸有同步之与异倒步之分升，前辱者在见细胞炕分装喝同时冤或不浴久接堂种毒糊种，牙进行亲培养照，如染猫、挎犬传程染性趋肠炎姓疫苗(细小释病毒)；后酒者在拍细胞届形成静单层枪后接顶种毒螺种，纺如流今行性符乙型缎脑炎横细胞楚培养渣疫苗欧。通戏常在惊细胞尚形成价单层革后倾仁去培遇养液腹，按1%皮-2序%量接虚种毒街种，岔经吸良附后爬加入彻维持炒液继杆续进胖行培助养，剂待出甜现70盼%-娱85丝式%以上共细胞叹病变版时即黎可收子获。病毒丢培养墨液收挎获时间惩和方滥法依疫剑苗性览质而闷定，愁可将寺培养拍瓶冻互融数搜次后算收集轻；或丽加入ED核TA灰-胰蛋能白酶姨液消受化分符散收洋取；食或在男病毒目增殖艇培养亚过程擦中可寺收获5-座7次毒羽液，倒细胞摊毒液杜经无轰菌检在验、尖毒价络测定喉合格压后供汉配苗匆用。接毒粉与收顽获种毒袜与毒朗种继残代配苗细胞产制备二、宅病毒共性细泪胞培行养疫筒苗制挠造（五脆）配合苗1．灭笼活疫狠苗不同约灭活傻剂对刺不同绕病毒踩的作革用也尼不同江。向亦细胞僻毒液针内按汉规定仆加入命灭活逃剂，援在一埋定的赴温度裕下作散用一述定的阵时间传，有聪的灭穗活剂厉还需霸加入机阻断上剂中赤止灭务活。菜灭活蓬疫苗受配置高通常盲都需椒加入炮佐剂线，充梳分混泰合、要分装恼，制诱成灭篇活疫津苗。2．冻战干苗细胞太毒液抖内按吨比例钓加入保护眠剂或甲稳定舞剂，充属分混趁合、往分装冻，进觉行冷辫冻真滑空干陶燥制抗成冻鸡于疫财苗。接毒坐与收或获种毒粮与毒演种继盟代配苗细胞潮制备二、纵病毒统性细帖胞培崖养疫橡苗制察造流程眠图3—盼—病毒投性细幻玉胞疫铺苗制牲造工闹艺流变程动物骄或胚智胎组球织毒吊株种财毒灭活莫病毒消化鉴定培育培养检验检验配制原尊料佐粥剂传代托细胞配什苗（混群匀、春乳化凝）灭活届疫苗细胞凤悬液生长油细胞配仍苗活疫钉苗保护腊剂原比苗分装凡、冻肉干分拳装灭活原扮料原炉料细胞壁培养蔬液配制剪碎种约子鉴定扩增收获配制灭菌三、塑病毒恐性动营物组锁织疫搅苗制名造病毒俭在易抛感动母物体恩内可蛛大量渔增殖肆，但依在各果器官瓦组织望、部秋位中贼增殖关病毒迎的量西却有投很大愧的差弯异，勾利用颠病毒欺增殖熊迅速虑、含帆毒量或高的至组织蒸制造挪的疫游苗称闭为组口织疫铸苗(t弓is赖su生e杰va粘cc折in想e)。动物恼组织迁疫苗年包括爽动物周组织梨灭活旋疫苗露和动穷物组畅织弱爹毒活食苗两波类，迅前者吸多数精由强蕉毒株驼制造梁，如经猪瘟济结晶讨紫疫捡苗、叨狂犬讯病羊尊脑组贷织疫役苗；具后者彻均以秧弱毒型株生负产，桨如猪惠瘟兔年化弱侄毒乳影兔组爷织疫牵苗、态牛瘟抹兔化析弱毒谜组织聪疫苗创等。动物粮质量枯直接贿影响及到组跟织疫犬苗的犹质量音，特星别是案对疫婚苗的膀安全涉性和盲效力株有着毯决定碑性的桨作用肃，动纳物必揭须符滑合下忆列标屈准：(1两)应该列是清法洁级(二级)以上已的等彻级实酷验动凭物，旋即无宫规定钩的人鹊兽共御患性伙病原且体动何物；(2拌)应是呼对所对接种絮病毒斤易感豆性高淘的动壮物，戚即在独品种兽、年改龄和同体重貌方面燃合乎贸要求破的实凯验动卡物。（一歉）动蜘物选报择观察贱与收情获动物扬选择配苗种毒剖与接勉种种毒誉既可勉用抗芒原性肠优良俩、致族死力捉强的望自然绩毒株甚脏器列组织单毒或听强毒克株增究殖培府养物碰，也片可用追弱毒房诚株组将织毒秃种。透无论气何种佳种毒嫩都须按经纯惜粹、央抗原阳性和攻免疫艳原性谣检查仿合格茧后使继用。接种迫途径赛依病蜂毒性钞质和经目的刃而异伍，例挡如猪蜓瘟结棵晶紫脸苗，纲采取责猪肌李肉注响射血押液毒抹种；蛮牛瘟瓣兔化叙弱毒赴疫苗究，以异兔耳徒静脉凤注射铁脾淋栽毒种热；狂衣犬病系疫苗刺，用债兔脑础毒种列接种聚绵羊错脑内期途径且感染践。几种厨动物份常用善的接夺种途亲径如竞下：1.脑内膜注射女：颅钩前后殃中线5m本m平行让线与们瞳孔澡横线以交叉祸处。2.静脉璃注射璃：家概兔由愉耳静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