毛细管电泳课件

毛细管电泳

CapillaryElectrophoresis第一节毛细管电泳概述第二节毛细管电泳基础理论第三节毛细管电泳仪第四节毛细管电泳类型第五节毛细管电泳的应用和进展第一节毛细管电泳概述毛细管电泳（CE），又称高效毛细管电泳，是近年来发展最快的高效分离分析技术之一。该技术是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物，是气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等常用分离技术的重要补充，在诸多研究领域得到了人们广泛的接受和认可。一、毛细管电泳发展历程1808年，俄国物理学家Pence发现电泳现象。1937年，瑞典Tiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定,第一次从人血清提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白，但分离效率低；1981年，Jorgenson在75μm毛细管内施加300V/cm的高强度电场，获得了理论塔板数超过400,000plates/m的高分离效率，轰动了整个分离界，成为CE划时代里程碑1989年，毛细管电泳仪问世。

1989年，第一届CE国际会议的召开，标志着一门新的分析技术的产生。二、毛细管电泳的特点(1)高效：每米理论塔扳数低则十几万，高则几百万甚至上千万；(2)快速：可在十几分钟甚至几十秒内完成分离；(3)低样品消耗：只需纳升甚至皮升级样品量；(4)低成本分析：只需低廉的分离毛细管和少量的运行缓冲液；

CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物，具有较HPLC和平板凝胶电泳更多的优点：(5)高度自动化：CE是目前自动化程度最高的分离分析方法之一；(6)洁净：通常用水溶性缓冲液，对人体和环境无害；(7)多分离模式：可根据需要在同一仪器上选用不同的样品分离模式；(8)应用范围广：具有“万能”分析的功能和潜力，既可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子，又可以分析蛋白质等生物大分子,甚至整个细胞。第二节毛细管电泳基础理论+—一、电泳流电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。电泳时，不同离子在电场中具有不同的定向迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？淌度(μ）：单位电场下的电泳速度。绝对淌度：在无限稀释溶液中测得的淌度。有效电泳淌度：在实际溶液中测得的淌度。+—电场强度：与所施加的电压成正比，与两电极间的距离（L）成反比

E=V/L电场力：在溶液中，电场对带电离子作用力（F）的大小等于带电离子所带的净电荷（q）与电场强度的乘积：F=q·E在电泳迁移过程中，介质粘滞力（F’）必然会阻碍离子的迁移。粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系，与带电离子的移动速度更是直接相关。对于球形分子F’的大小服从Stokes定律：F’=6πηrνefη：缓冲液粘度；r：球形分子的半径；νef：离子在电场中的迁移速度。当带电离子以速度v在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场驱动力和移动摩擦阻力的作用，此时F=F’故：q·E=6πηrνef则离子在电场中的迁移速度：即带电离子的电泳迁移速率（或称电泳淌度）:由此可知，球形带电离子的迁移率，主要取决于自身状态，即与其所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。电泳过程中正是利用带电离子电泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。

二、电渗流在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗流。石英毛细管柱，内壁大约有8.31mol/m2的硅醇基（Si-OH），其等电点约为1.5，内充液pH>3时，表面电离成SiO-，管内壁带负电荷，形成双电层。1.CE中电渗流的大小与方向

电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。（1）电渗流的大小电渗流的大小与电场强度、Zata电势及缓冲液介电常数有关，某一电泳体系内电渗流的具体数值可以用Helmholtz-Smoluchowski公式计算：式中，为电渗速度；为电渗淌度（EOFmobility）；为双电层的Zeta电位；为缓冲液介电常数；η为电解液粘度；V为所施加的电压；为毛细管总长度。在具体实验中，可根据需要选用不同的中性组分作为标记物（N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等），测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间，按下述公式计算出电渗率：其中，t：中性标记物的迁移时间，ldet为毛细管电泳有效长度，ltot为毛细管电泳有效长度。

（2）CE中电渗流的方向石英毛细管带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：毛细管改性：表面键合阳离子基团；加电渗流反转剂:

内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷，电渗流流向阳极。2.CE中电渗流的流形液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速最慢，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。在毛细管电泳中，电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（区带展宽很小），故柱效较高。3.CE中电割渗流剃的作置用电渗袄流的受速度遵一般庸约等长于离睡子电乔泳速吓度的5～7倍；各种的电性房诚粒子坦在毛门细管业柱中栗的迁帆移速息度为听：阳离雹子迁驻移速串度=电渗泊流+电泳江流，敞阳离飞子运柏动速臂度快馒于电库渗流论；阴离北子迁冒移速混度=电渗咱流–电泳短流，悄阴离名子运耻动速舌度慢混于电聚渗流柿；中性露粒子找迁移捡速度=电渗缠流，关中性辉粒子寇运动职速度割与电转渗流秘一致个。CE中电补渗流凝的作资用：可一粪次完自成阳贡离子烦、阴普离子义、中兔性粒皇子的泻分离夜；改变孩电渗跪流的沉大小郑和方掠向可疗改变铁分离啄效率督和选镇择性电渗饲流的拿微小习变化停影响老结果摊的重迹现性坐；在CE中，茅控制味电渗并流非昂常重凭要。+—4.夕CE中影银响电蓝渗流至的因惜素（1）电轰场强铁度的霞影响电渗沈流速威度和驻电场幅强度骗成正女比，吨当毛蛋细管渗长度炭一定卖时，胜电渗芦流速武度正诊比于汉工作障电压色。（2）毛汇细管傲材料警的影咱响不同告材料复毛细城管的泼表面律电荷肾特性偏不同迫，产扬生的顿电渗欢流大剃小不熔同。（3）电乌解质屋溶液浊性质强的影泳响①溶液pH的影忌响对于筋石英担毛细伟管，吧溶液pH增高设时，敢表面挎电离凑多，笔电荷宴密度星增加粒，管水壁ze交ta电势冤增大果，电拳渗流幻玉增大栋。pH在4-所7之间绳，电批渗流虚增大辅显著；pH君>8时电火渗流锤增大占速度栗渐缓匀。当pH菊<3，毛刊细管晨内壁黑离解董的硅耻醇基滨被氢错离子滤中和宴，表既面接现近电港中性浓，电英渗流港接近阵零。惊分析虾时，赛可采男用缓闹冲溶适液来犹稳定货并调骡控pH。②阴离吨子的烤影响在其或它条四件相恒同，因缓冲毁液浓蜘度相锦同而迎阴离涌子不安同时击，毛到细管痛中的奔电流够有较戏大差醒别，甲产生吸的电锐渗流衬不同醋。（4）温帮度的浇影响毛细夺管内预温度碧升高更，使共溶液顽的黏古度下小降，庆电渗驴流增吹大。温度器变化套来自床于“吼焦耳吩热”息；焦耳饥热：毛址细管楚溶液炸中有恭电流朵通过据时，饭产生雕的热练量；CE中的忽焦耳许热与奔背景潮电解萄质的诊摩尔禾电导浇、浓腹度及晨电场牙强度市成正毙比。温度闲每变期化1度，海将引坐起背饭景电皱解质鉴溶液浇黏度冤变化2%～3%；（5）添总加剂质的影须响加入糊浓度鸣较大施的中猪性盐扔，如K2SO4，溶搭液离锻子强颂度增渴大，那使溶卡液的蚕黏度昼增大呢，电锈渗流吊减小蛋。加入级表面扶活性保剂，味可改蜻变电橡渗流晶的大眠小和闹方向夏；加入诵不同运阳离借子表礼面活愚性剂闻来控斧制电头渗流塞。加入编阴离秧子表称面活明性剂马，如符十二响烷基魂硫酸采钠（SD退S），采可以密使壁知表面出负电洪荷增怎加，ze竞ta电势励增大驳，电冬渗流巧增大卫；加入绩有机洗溶剂注如甲讨醇、戏乙腈趟，使冷电渗中流增驳大。三、CE中的级参数数与关刑系式1.迁移每时间向（保骄留时决间）CE兼具坊有电狗化学阻的特鼓性和捏色谱什分析枪的特熄性。敏有关鬼色谱焰理论考也适羽用。Vap是表尚观迁户移速使度；μap是表预观淌你度；lde翠t是毛皱细管肯有效井长度肢；lto悔t是毛灶细管奋总长翁度2.分离腔效率准（塔怕板数拒）在CE中，掘仅存挺在纵蚂向扩场散，σ2=2Dt扩散绳系数帖小的洞溶质盘比扩因散系份数大鞋的分土离效足率高埋，这宝是分冬离生倒物大铜分子吧的依旨据。3.分离组度四、终影响保分离航效率压的因拆素—区带垄展宽1.纵向柜扩散意的影巧响在CE中，阔纵向窜扩散陷引起协的峰徐展宽您：σ2=2Dt由扩闸散系塌数和卸迁移奖时间席决定丧。大向分子薄的扩毫散系恋数小吧，可获得趣更高利的分辫离效央率。2.进样厨的影寄响当进隶样塞事长度锣太大葛时，欢引起勉的峰父展宽雷大于珍纵向墙扩散赢。分冤离效虹率明辰显下狮降；俘理想林情况皆下，丽进样给塞长流度：Win鞭j=删(2采4D适t)1/膜2实际膛操作朗时进叠样塞摘长度映小于梨或等躲于毛袜细管洁总长车度的1%～2%。3.焦耳驰热与端温度辞梯度脖的影骆响电泳炎过程化产生罢的焦叼耳热剑可由酸下式顾计算掠：m：电解盘质溶恰液的量摩尔宵电导故；I：工候作电投流：cm：电仇解质质浓度琴；散热堵过程红中，报在毛杏细管脖内形涨成温祖度梯论度（伟中心器温度巧高）克，破辰坏了秒塞流攀，导算致区规带展携宽。改善焰方法流：（1）减焦小毛糊细管宿内径验；（2）控悉制散气热；4.溶质奇与管钟壁间蜘的相德互作努用蛋白浴质、弹多肽呈带电角荷数陶多，仆吸附腊问题良特别尺严重茎，是颈目前凑分离奇分析株该类负物质仁的一苹大难题。细内仅径毛颈细管塑柱，暂一方塘面有骂利于兼散热泳，另瞒一方得面比鉴表面蒸积大皇，又姓增加贱了溶统质吸奥附的迷机会捕。减小击吸附你的方瞒法和筐途径：加入寇两性谷离子海代替鹊强电郑解质室，两福性离篇子一局端带撞正电及，另气一端优带负棉电，宝带正征电一私端与卷管壁草负电鸣中心慌作用柜，浓罩度约硬为溶被质的10视0-胀10楼00倍时敏，抑法制对磨蛋白阵质吸蹈附，匀又不觉增加午溶液荡电导磨，对缘瑞电渗台流影粒响不幅大。第三疗节术毛细摸管电斤泳仪一、劝仪器傍主要歇部件1.高压鼓电源（1）0～30kV稳定处、连梨续可昌调的饲直流洽电源烈；（2）具知有恒熊压、郑恒流躲、恒清功率睁输出秆；（3）电扔场强剪度程沈序控科制系革统；（4）电餐压稳茄定性款：0.兆1队%；（5）电破源极盼性易米转换；2.毛细喜管毛细纵管是CE分离伍的心慕脏。液理想借的毛潮细管碗必须就是电串绝缘抬、紫谢外/可见错光透吩明且桃富有弟弹性窜的，引目前点可以晒使用往的有古玻璃既、熔湖融石另英或残聚四旋氟乙犯烯塑蛮料等形。毛锤细管制内径芦一般差为20～10朵0μm。3.缓冲夸液池化学痒惰性摸，机苗械稳约定性富好；4.检测沃器要求缘瑞：具踪蝶有极胶高灵碗敏度用，可浑柱端衫检测堡；检测策器、飞数据店采集积与计泊算机沫数据泰处理紫一体喇化；类型专检测巡寿限/m散ol特点紫外-可见10-1果3～10-1齐5加二烤极管爹阵列致，光徒谱信壮息荧光10-1深5～10-1掘7灵敏愉度高虏，样抛品需敌衍生激光牙诱导瓶荧光10-1膨8～10-2等0灵敏缘瑞度极飘高，灰样品剖需衍税生电导10-1桌8～10-1妨9离子势灵敏券，需练专用典的装陆置；二、族毛细椒管电筋泳的给进样游方式进样线量：嚷毛细买管长颂度的1-西2%；纳静升级恩、非敞常小蚕；1.流体痛力学俯进样托方式（1）进感样端绑加压（2）出芹口端涂抽真纵空（3）虹律吸进腔样毛细暗管一痛端插灯入样日品瓶积，加色电压腔；2.电动盒进样荒方式进样旁不均：电改歧视头现象其，淌匪度大狼的离贩子比宝淌度切小的旦进样抚量大够；离子吩丢失：淌捏度大忍且与与电渗勿流方券向相宾反的市离子告可能个进不降去；特别深适合推黏度搂大的含试样地。3.扩散雷进样试样搏通过矩扩散研作用爆进入通分离宰柱端班口处厕。第四能节誉毛细甘管电栽泳类邮型常用贸的六李种电闭泳分形离模丝式式；根据锅试样任性质俯不同纽奉，采填用不场同的捐分离隙类型秧；每种蛛机理嚼的选屑择性躁不同型；一、俱毛细题管区县带电缎泳（Ca女pi判ll名ar宇y势zo朴ne优e拼le会ct笔ro河ph缺or辅es妥is驰,丸C柱ZE）带电抄粒子匙的迁尿移速叛度=电泳却和电太渗流堤速度拴的矢枯量和尺。正离宝子：两事种效偏应的汉运动牢方向致一致喜，在员负极县最先使流出默；中性驶粒子：无因电泳察现象旺，受惑电渗惯流影咬响，喝在阳步离子农后流谷出；阴离属子：两殊种效颂应的柄运动挣方向键相反终；ν电渗丹流>ν电泳时,阴离联子在占负极厨最后桃流出,在这涂种情扭况下,不但榆可以云按类墓分离,同种窄类离蠢子由挤于差速挤迁移被相初互分经离。CZ结E是最狐基本绣、应樱用广援的分凝离模伞式；二、付毛细框管凝挤胶电示泳Ca受pi王ll乓ar顶y鹿ge野l虚el屠ec牌tr哀op罗ho渠re修si勿s，CG贤E将聚器丙烯我酰胺滔等在粒毛细宁管柱窃内交话联生闭成凝烧胶。其具袜有多戏孔性芦，类弱似分胶子筛知的作允用，水试样动分子已按大公小分寸离。所能够遮有效械减小用组分塞扩散狐，所讨得峰阔型尖猎锐，逆分离设效率栽高。蛋白害质、DN聚A等的庆电荷/质量室比与些分子黄大小毛无关勾，CZ羽E模式抵很难继分离毙，采俊用CG榜E能获嘉得良怠好分繁离，DN号A排序册的重躁要手仁段。特点：抗对穗流性渔好，持散热专性好率，分躲离度走极高猎。无胶要筛分皂技术：采用膜低粘维度的匆线性情聚合清物溶梢液代牧替高逢粘度合交联政聚丙左烯酰问胺，番柱便雷宜、延易制泪备。1.缓冲锡溶液评中加舒入离召子型合表面昆活性毁剂，御其浓捎度达阻到临零界浓撞度，纪形成化一疏没水内粉核、袭外部突带负羊电的悲胶束黎。三、姥胶梯束电悠动毛凤细管欺色谱树（ME抖CC，ME毕KC）Mi闯ce区ll踏ar泳e庆le柔ct汉ro悄ki厌ne足ti览c视ca坦pi看ll牌ar味y片ch诸ro悄ma邪to移gr香ap敞hy量,恨ME庙KC在电介场力踏的作蝇用下尼，胶简束在形柱中萝移动罗。2.电泳蔽流和睡电渗出流的长方向砍相反赛，且ν电渗榜流>ν电泳，负奖电胶漠束以齐较慢皮的速听度向染负极风移动漫；5.色谱谈与电诊泳分扣离模椅式的忍结合姿。3.中性慈分子枝在胶打束相符和溶恳液（买水相捡）间后分配退，疏塑水性衔强的辨组分神与胶慢束结迈合的斑较牢讽，流俭出时吹间长绞；4.可用锡来分轻离中薯性物躁质，寺扩展旧了高坝效毛屑细管胶电泳缩慧的应厕用范仇围；根据素等电朗点差传别分悬离生今物大朴分子绒的高夜分辨寻率电电泳技北术；2.毛细伪管内谜充有预两性牌电解阻质（呀合成待的具叹有不柜同等觉电点逐范围饮的脂吊肪族哑多胺偷基多冻羧酸景混合鲜物）凳，当帮施加增直流主电压弯（6～8.0箩k蛋V）时拍，管所内将槐建立皂一个荐由阳穷极到框阴极猜逐步并升高政的pH梯度馅；3.氨基行酸、敢蛋白袍质、惯多肽截等的粒所带猎电荷英与溶档液pH有关煌，在院酸性颂溶液坛中带甩正电锈荷，记反之扁带负德电荷大。在址其等燥电点饼时，狸呈电尽中性植，淌退度为尊零；四、袋毛细软管等竖电聚殖焦Ca衔pi瞧ll商ar也y胃is听oe如le向ct机ri徒c命fo冲cu虹si把ng映,象CI胜EF4.聚焦德：具耳有不提同等冻电点您的生弹物试洲样在火电场岁力的芝作用挽下迁粉移，葛分别巡寿到达繁满足情其等桂电点pH的位吼置时致，呈者电中巧性，脊停止系移动遮，形特成窄师溶质碗带而本相互矩分离颂；5.阳极肥端装脸稀磷您酸溶谋液，童阴极恼端装刷稀Na聋OH溶液赖；6.加压篇将毛界细管赤内分誉离后埋的溶哨液推卡出经腿过检阳测器年检测功；7.电渗背流在CI书EF中不拳利，柱应消僻除或取减小敢。1.将两支种淌句度差塔别很摘大的淹缓冲蹄液分详别作性为前凝导离索子(充满肿毛细呜管)和尾豆随离善子，剃试样服离子蝴的淌坝度全果部位勤于两辞者之租间，会并以掀同一球速度犁移动秘。2.负离肥子分倘析时澡，前趋导电融解质全的淌竟度大较于试男样中堡所有给负离馋子的始。所遇有试温样都蓬按前晴导离赞子的优速度对等速芹向阳洁极前并进，支逐渐塑形成吓各自胃独立隶的区运带而阀分离诞。阴陪极进仅样，炭阳极态检测膏。五、誉毛细陶管等谱速电虽泳Ca闷pi形ll巡寿ar冬y刑is屡ot音ac满ho计ph渐or会es每is，CI孝TP3.不同缎离子巴的淌轧度不稼同，隶所形娘成区般带的址电场趟强度朱不同(ν=尽μE)，淌尺度大恋的离肺子区贴带电反场强难度小轿。沿出晌口到钞进口糠，将聚不同呆区带胞依次伏排序1、2、3、4证啊睛电场西强度演依次职增大羞。假浓设“2”号中拐离子析扩散副到“3”号，上该区汗电场碎强度振大，庄离子立被加央速，愚返回懂到“2”区；车当“2”号中岗离子禽跑到怕“1”号区偷，离查子被计减速铁使之晴归队堂；4.特点稍：界拒面明迁显，杂富集秒、浓梢缩作惕用。在毛禁细管锁壁上件键合库或涂喝渍高绘效液羞相色腰谱的皱固定赛液，勺以含呢有机袄物的骄缓冲肥液为靠流动风相，啊以电凡渗流剪为驱颤动力垮，试换样组滋分在蛙两相更间的溉分配畜为分俗离机窗理的捡电动晕色谱礼过程命；六、她毛细扫管电棋色谱Ca返pi怒ll川ar努y绿el纸ec邀tr池oo炸sm备os让ti茎c继ch澡ro英ma比to奸gr梦ap锈hy，CE而C一、蹄离子扶分析阳离难子分咏析迁移柜方向奇和电疾渗流锦方向乌一致吧；4.府5网mi毅n内分炸离了24种金灯属离圣子；阳极懒进样殊，阴灭极检文测；具有拥很高韵的灵碰敏度什。第五福节静毛细绑管电古泳的匠应用往与进绑展阴离傅子分笛析阴离驳子电产泳方脂向和功电渗苍流方暑向相无反、奶速度说接近没，分足析时凝间长帅、效衬率低肢；质量需小、替电荷衡密度巷大的我离子本如：SO42-、Cl-、F-等，敲电泳惧速率歪大于移电渗抚流，字阳极不端流佣出，榴在阴准极端遇无法天检测资；加入蹦电渗乒流改匪性剂心，十剩六烷冲基三禽甲基伟溴化乎胺等抗，使弹电泳港方向休和电慢渗流胜方向纱一致然，可岸在3.退1母mi肚n内分字离36种阴次离子元；阴退极进纳样，责阳极遍检测羊；离子谣价态胃及存壮在形咽态分蔑析；二、伞药物局分析检测毕体液岭或细希胞中只某些何代谢聋产物括的分验析；尿液队中的饰氨基揉酸含书量作呈为临盈床诊立断糖盏尿病邮