肿瘤靶向治疗分子标靶应用进展

肿瘤靶向治疗分子标靶应用进展第一页，共79页。背景资料20世纪70年代前:肿瘤生物学研究：细胞和亚细胞水平肿瘤细胞生长失控而处在不断的周期性分裂中,导致肿瘤细胞分裂速度加快。传统化疗药：针对阻断有丝分裂中微管蛋白形成的细胞毒性药物和破坏DNA合成的抗代谢药物抗瘤谱较广，选择性不强，效果差别很大同时损害正常细胞，有严重不良反应第二页，共79页。20世纪70年代后:肿瘤生物学研究：分子水平肿瘤中癌基因扩增而激活，抑癌基因突变失活或丢失，基因转录和蛋白产物异常，信号转导通路异常活化，细胞周期调节失控，导致肿瘤细胞不受控制地增殖，细胞凋亡抑制，肿瘤新生血管形成。肿瘤分子生物学研究阐明了肿瘤发生发展中的分子机制，为肿瘤药物治疗提供了一种新的模式。第三页，共79页。肿瘤的靶向治疗

targetedtherapy第四页，共79页。依据已知肿瘤发生发展中涉及的异常分子和基因，设计和研制针对这些已知的特定分子和基因靶点的药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法。靶向药物只作用于特定靶点的肿瘤，特异性强，能选择性杀伤肿瘤细胞。第五页，共79页。肿瘤靶向药物

分类和特性第六页，共79页。单克隆抗体药物非结合型单抗结合型单抗小分子化合物酪氨酸激酶抑制剂血管生成抑制剂蛋白酶体抑制剂环氧化酶抑制剂雌激素受体抑制剂其它小分子化合物

凋亡诱导剂周期蛋白酶抑制剂端粒酶抑制剂第七页，共79页。一、单克隆抗体药物某些表面抗原主要存在于恶性细胞而不存在于周围正常细胞上，这些肿瘤相关抗原可成为特异性抗体结合的靶点。能结合到肿瘤细胞上引发特异性免疫反应而导致细胞死亡的单抗，称为抗肿瘤单抗药物。第八页，共79页。1.非结合型单抗这类药物能直接结合到肿瘤细胞上，触发宿主免疫反应，导致细胞死亡；或通过抗原抗体结合后，阻断或中和靶分子的生物学活性，干扰细胞间信号转导而发挥抗肿瘤作用。第九页，共79页。CD20-利妥昔单抗(rituxmab)商品名:美罗华1997年真正意义上第一个肿瘤靶向药物抗CD20的人鼠嵌合抗体主要治疗复发性或难治性低度恶性B细胞淋巴瘤；现也用于中、高度恶性B细胞淋巴瘤。第十页，共79页。CD52-阿仑单抗(alemtuzumab)抗CD52的人源化单抗用于治疗苯丙酸氮芥和氟达拉滨治疗失败的B淋巴细胞性白血病，某些T细胞淋巴瘤如蕈样霉菌病和Sezary综合征。第十一页，共79页。HER2-曲妥珠单抗(trastuzumab)商品名:赫赛汀(herceptin)抗EGFR2(Her2)的人源化单抗用于治疗Her2高表达的乳腺癌和其它恶性肿瘤(胃癌、卵巢癌等)。第十二页，共79页。EGFR--西妥昔单抗(cetuximab)抗EGFR(Her1)的人鼠嵌合抗体用于治疗标准化方案无效，且EGFR阳性的转移性结直肠癌。人源化的单克隆抗体－－帕尼单抗（Panitumumab）第十三页，共79页。VEGF-贝伐单抗(bevacizumab)抗VEGF的重组人源化单抗抗肿瘤内新生血管形成的作用用于治疗进展期或转移性结直肠癌，与标准化方案联合应用，能显著提高疗效并延长生存。第十四页，共79页。2.结合型单抗由能特异性识别肿瘤抗原的单抗偶联到放射性核素或细胞毒素上，以提高对肿瘤细胞的杀伤力。第十五页，共79页。替伊莫单抗(britumomab)第一个得到美国FDA批准的单抗—放射性核素偶联物商品名：Zevalin由90Y(钇)通过连接螯合剂tiuxetan偶联到鼠抗CD20抗体上的抗肿瘤单抗偶联物。用于利妥昔单抗治疗无效或复发的低度恶性B细胞淋巴瘤。第十六页，共79页。托西莫单抗(tositumomab)另一种单抗—放射性核素偶联物由131I(碘)偶联(bexxan)到鼠抗CD20抗体用于标准化疗方案治疗无效的低度恶性B细胞淋巴瘤。第十七页，共79页。吉姆单抗(gemtuzumab)商品名:Mylotarg第一个得到美国FDA批准的单抗—细胞毒素偶联物由抗CD33重组人源化单抗与细胞毒类抗肿瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)偶联而成。用于治疗标准化方案初治失败，CD33阳性急性髓性白血病(AML)的60岁以上的中老年患者，现也可与标准化疗方案联合治疗AML。第十八页，共79页。二、小分子化合物某些非细胞毒性小分子化合物具有明确的作用靶点，通过阻断治疗中异常活化的激酶、生长因子和信号转导通路等途径来抑制肿瘤的生长，从而达到治疗的目的。这些小分子化合物称为小分子肿瘤靶向治疗药物。第十九页，共79页。1.酪氨酸激酶抑制剂（TKI）第二十页，共79页。吉非替尼(gefitinib)商品名：易瑞沙(iressa)是一种针对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的口服小分子抑制剂用于治疗不能手术或复发的NSCLC。第二十一页，共79页。埃罗替尼(erlotinib)一种新的、选择性EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂可用于治疗对化疗耐药的NSCLC、卵巢癌和头颈部癌等。拉帕替尼（Lapatinib）是一种能同时抑制EGFR和HER-2，用于Herceptin耐药的乳腺癌。第二十二页，共79页。第二十三页，共79页。KIT阳性和可能阳性肿瘤GIST精原细胞瘤肥大细胞瘤黑色素瘤/透明细胞肉瘤ES/PNETKaposi肉瘤/血管肉瘤孤立性纤维瘤隆突性皮肤纤维肉瘤肌纤维母细胞瘤/纤维瘤病分化良好脂肪肉瘤转移性小细胞癌第二十四页，共79页。甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)商品名:格列卫(gleevec)能抑制BCR-ABL酪氨酸激酶及其下游信号转导通路，2001年FDA批准用于治疗慢粒（CML）；能抑制C-Kit和PEGFR酪氨酸激酶活性，2002年被批准用于治疗C-kit(CD117)或PDGFRa阳性的、不能手术或转移性胃肠间质瘤（GIST）。第二十五页，共79页。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂第二十六页，共79页。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂SU668、SU11248、ZD6474、PTK787/ZK222584等小分子化合物口服或腹腔注射抑制VEGFR酪氨酸激酶的活性，从而抑制血管内皮细胞生长。第二十七页，共79页。其它信号转导通路抑制剂法尼基转移酶(farnesyltransferase)，是RAS蛋白活化必不可少的关键酶，抑制法尼基转移酶活性，可阻断RAS蛋白在细胞内信号转导。临床试验阶段。第二十八页，共79页。第二十九页，共79页。多靶点酶抑制剂索拉菲尼(sorafenib，商品名Nexavar)：FDA10年来第一次批准治疗肾癌的药物，还可用于HCC,Melanoma,NSCLC。范得他尼(vandetanib，ZD6474，商品名Zactima):口服，NSCLCSunitinib：口服，治疗GIST和晚期肾癌第三十页，共79页。2.血管生成抑制剂主要针对肿瘤血管形成的某些因子及关键步骤进行干预。第三十一页，共79页。血管抑素(angiostatin)

内皮抑素(endostatin)抑制由碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱发的血管生长，特异性抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖，但不直接影响肿瘤细胞的增生。YH—16（Endostar，恩度)为我国生产的重组人血管内皮抑制素注射液，用于不能手术的NSCLC。第三十二页，共79页。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂抑制VEGFR酪氨酸激酶的活性，从而抑制血管内皮细胞生长。第三十三页，共79页。O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇(TNP-470)一种烟曲霉菌分泌的烟曲霉素的人工合成类似物，对血管内皮细胞增殖的抑制作用强，无明显毒副作用。第三十四页，共79页。金属蛋白酶抑制剂能与基质金属蛋白酶（MMPs）活性部位的锌结合，抑制血管生成。第三十五页，共79页。沙利度胺(thalisdomide)反应停抑制bFGF和VEGF介导的血管生成；也可抑制TNF-a合成，阻断NF-kB激活，下调细胞表面粘附分子和减少自由基生成。第三十六页，共79页。3.蛋白酶体抑制剂多酶复合体——蛋白酶体(proteasome)在调节细胞周期上起作用，促进细胞增殖。硼替佐米(bortezomib)，2003年FDA批准用于治疗复发性和难治性多发性骨髓瘤。第三十七页，共79页。4.环氧化酶抑制剂环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素合成过程中的催化酶，包括COX1和COX2。结肠腺瘤和结肠癌高表达COX2，肺癌、乳腺癌、前列腺癌及脑肿瘤也常过表达COX2。选择性COX2抑制剂西乐葆(celeoxib)用于治疗家族性多发性腺瘤性息肉(FAP)，可降低结肠癌的发生。第三十八页，共79页。5.雌激素受体抑制剂他莫西芬(tamoxifen)，能与雌二醇竞争雌激素受体，与胞质雌激素受体结合形成复合物，进入细胞后不能刺激RNA和蛋白质合成，从而抑制依赖雌激素才能生长的肿瘤。用于治疗绝经后乳腺癌患者的姑息治疗和手术后的辅助治疗，也可治疗子宫内膜样腺癌。阿那曲唑(anastrozole)，来曲唑(letrozole)和依西美坦(exemestane)等芳香化酶抑制剂，能与内源性底物竞争芳香化酶的活性部位，抑制酶的活性，明显降低雌激素水平，可用于治疗绝经妇女的晚期乳腺癌。第三十九页，共79页。6.其它小分子化合物

(正在临床试验阶段)凋亡诱导剂周期蛋白酶抑制剂端粒酶抑制剂反义核苷酸第四十页，共79页。肿瘤靶向治疗中

分子靶点的检测及结果判读第四十一页，共79页。分子靶点检测的常用技术免疫组织化学(IHC)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)荧光原位杂交(FISH)显色原位杂交(CISH)DNA测序(DNASequence)第四十二页，共79页。1.免疫组织化学技术(IHC)检测肿瘤分子靶点的蛋白产物表达情况。最常用和最简便。第四十三页，共79页。CD20正常B淋巴细胞从前体B细胞到前浆细胞，绝大多数B细胞淋巴瘤均表达；阳性反应定位于细胞膜上。第四十四页，共79页。C-KIT蛋白(CD117)非受体酪氨酸激酶绝大多数GIST存在C-KIT基因功能获得性突变，导致该基因不需与配体结合，即可发生自磷酸化而激活信号转导通路CD117的阳性反应定位于细胞膜或和胞浆。第四十五页，共79页。HER2蛋白具有受体酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体蛋白，在控制上皮细胞生长、分化、粘附和活动等细胞信号转导通路的活化上起重要作用。曲妥珠单抗能下调过度表达HER2蛋白的乳癌癌细胞表面HER2受体的数目。1998年FDA批准了单抗治疗前的标准检测程序检测对象为浸润性乳腺癌阳性反应定位于细胞膜第四十六页，共79页。第四十七页，共79页。ST.GALLEN2007HER2：乳腺癌危险因素的新定义RISKG1T≤2ER/PR+淋巴结-HER2-LVI无淋巴结1-3和HER2+,ER/PR-或淋巴结≥4年龄<35岁G2-3T>2淋巴结-,HER2+,ER/PR-或LVI侵润淋巴结1-3且HER2-,ER/PR+低中高RISK第四十八页，共79页。2007ASCO/CAPGuidelinesScore0Nostainingisobservedorcellmembranestainingisobservedinlessthan10%ofthetumorcells.Score1+Afaintperceptiblemembranestainingcanbedetectedinmorethan10%ofthetumorcells.Thecellsareonlystainedinpartoftheirmembrane.Score2+Aweaktomoderatecompletemembranestainingisobservedinmorethan10%ofthetumorcells.Score3+Astrongcompletemembranestainingisobservedinmorethan30%ofthetumorcells.JCO,25(1):2007第四十九页，共79页。2009版中国乳腺癌HER2指南0：无着色，或<10%浸润癌细胞呈现弱而不完整着色；1+：>10%的浸润癌细胞呈现弱或中度强度，且不完整的膜着色；2+：>10%浸润癌细胞呈现弱或中度强度，且完整的膜着色；或<30%浸润细胞呈现强且完整膜着色；3+：>30%癌细胞胞膜强染色，连续，环绕整个胞膜。第五十页，共79页。0,1+Negative2+equivocal3+Positive(曲妥珠治疗指征)第五十一页，共79页。第五十二页，共79页。EGFR/HER1蛋白位于7p的EGFR基因的蛋白产物，广泛分布于哺乳动物的上皮细胞中西妥昔单抗直接作用于EGFR的细胞外配体结合区，阻断EGF和TGFα等配体与EGFR结合，从而抑制细胞内酪氨酸激酶的活性，导致肿瘤细胞生长抑制和凋亡2004年FDA批准西妥昔单抗用于治疗EGFR阳性的转移性大肠癌第五十三页，共79页。EGFR/HER1蛋白阳性反应定位于细胞膜。反应强度分为1+、2+、3+。>1%癌细胞的胞膜染色超过背景细胞即为阳性，无论染色是否完整环绕胞膜。第五十四页，共79页。ER、PR蛋白阳性反应定位于细胞核。染色强度及百分比。2010ASCO/CAPguideline>1%Positive,<=1%Negative临床上，>10%确切的用药标准，1-10%，需综合考虑第五十五页，共79页。2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肿瘤分子靶点的mRNA表达情况。操作简单，灵敏度高，快速，高通量。仪器昂贵，最好需要标准PCR室。有替代测序应用于基因突变检测，如EGFR,K-ras检测。第五十六页，共79页。2-ΔΔct第五十七页，共79页。3.荧光原位杂交技术(FISH)是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下，于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。FISH检测基因扩增，准确性比其它检测技术高，可避免由于染色体的多体而呈现的假阳性，金标准。缺点：技术操作复杂，试剂及设备昂贵。第五十八页，共79页。样本预处理探针、样本变性探针＋样本杂交杂交后洗涤结果观察原理及实验操作第五十九页，共79页。HER2基因：FISHHER2试剂盒为双色荧光标记探针：HER-2基因，为橘红色荧光，该基因所在的17号染色体着丝点为绿色荧光作为内对照，用于判断HER-2基因的拷贝数增多是真正扩增，还是由于17号染色体的多体而导致HER2基因拷贝数相对增多。O/G>2.2，PostiveO/G<1.8，NegativeO/G1.8-2.2,Equivocal赫赛汀只对FISH检测HER2基因阳性者有效第六十页，共79页。HER2基因(FISH)第六十一页，共79页。EGFR基因：FISH转移性结直肠癌患者的EGFR基因状态：EGFR基因拷贝数增加(扩增)的患者对西妥昔单抗治疗有显著疗效，而EGFR基因拷贝数无增加的患者对该药无效。O/G>2.0orO>6PostiveO/G<=2.0，Negative基因扩增的有效率约40-50％第六十二页，共79页。4.显色原位杂交技术(CISH)用碱性磷酸酶标记的探针，在甲醛固定、石蜡包埋组织切片上进行杂交，再用鼠抗地高辛抗体和辣根过氧化物酶抗鼠抗体进行免疫组合，DAB显色，普通光镜观察有无基因扩增的异常信号的技术。缺乏内对照，无多种颜色信号，不能完全取代FISH。第六十三页，共79页。HER2基因：CISH无扩增：大于50%肿瘤细胞每个核内有1-5个信号点；低拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有6-10个信号点；高拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有多于10个信号点或者凝结成团块状、簇状信号颗粒。（若杂交信号在5-6个，难以判断的，应经FISH重新检测）第六十四页，共79页。CISH检测无HER2基因扩增样本Adiploid-triploidHER2copynumberisusuallyclear第六十五页，共79页。CISH检测低扩增样本第六十六页，共79页。CISH检测高拷贝扩增样本Genecopyclusters:100%evidenceofgeneamplification第六十七页，共79页。c-erbB2IHCvs.FISHc-erbB2scoreGeneamplificationbyFISH04%17%210-35%3>90%第六十八页，共79页。ConcordancebetweenFISHandIHCHER-2statusdeterminationusingthe30%criterionFISH-positiveFISH-negativeTotalIHC-positive(3+)1699178IHC-negative(0,1+,2+)12104116Total181113294ConcordanceEstimate95%CIкcoefficient0.8500.787to0.913Sensitivity93.4%89.9%to96.9%Specificity92.0%87.1%to96.9%Overall*92.9%90.0%to95.8%第六十九页，共79页。IHC,CISH,FISH符合率IHCCISH（％）FISH（％）GroupI0/1+,n=69无扩增，67/69（97）无扩增，69/69（100）GroupII3+,n=50扩增，47/50（94）扩增，46/50（92）GroupIII2+，n=135无扩增，89/135；（66）扩增，37/135；（27）第七十页，共79页。5.DNA测序技术将组织中DNA提取后行PCR扩增，然后用测序分析仪分析有无基因突变、突变位点和突变形式的方法。目前主要用于C-KIT、PDGFRα、K-ras、EGFR、BRAF等突变，为临床靶向药物治疗和疗效判断提供客观依据。第七十一页，共79页。基因序列分析PDGFRA