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文档简介
DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100ml/孔)。将培育板放在培育箱预培育(在37℃,5%CO2的条件下)。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O.D值的读数)。3.将培育板在培育箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5.若是临时不测定O.D值,打算今后测定的话,能够向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液也许1%w/vSDS溶液,并掩盖培育板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配制100ml的细胞悬液。将培育板在培育箱预培育24小时(在37℃,5%CO2的条件下)。向培育板加入10ml不同浓度的待测物质。3.将培育板在培育箱孵育一段适合的时间(比方:6,12,24或48小时)。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O.D值的读数)。将培育板在培育箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。7.若是临时不测定O.D值,打算今后测定的话,能够向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液也许1%w/vSDS溶液,并掩盖培育板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。注意:若是待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8从前更换新鲜培育基,去掉药物的影响。自然药物影响比较小的状况能够不更换培育基,直接扣除培育基中加入药物后的空白吸取即可。制作标准曲线先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数目,尔后接种细胞。2.按比率(比方:1/2比率)挨次用培育基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。3.接种后培育2-4小时使细胞贴壁,尔后加CCK-8试剂培育一准时间后测定O.D值,制作出一条以细胞数目为横坐标(X轴),O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。依据此标准曲线能够测定出未知样品的细胞数目(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致,便于确立细胞的接种数目以及加入CCK-8后的培育时间)。优选DOJINDO检测步骤CCK-8检测步骤向各孔中加入100μl细胞悬液。a)在37℃下预孵育培育板。b)向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10μl。37℃下孵育。向各孔中加入10μl的CCK-8溶液d)。37℃下孵育1-4小时。e)测定450nm处的OD值。使用适合的培育基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。建议使用CO2培育箱过夜预培育。使用培育基或PBS来制备溶液。d)若是待测溶液有还原性,测定不含细胞,但含有CCK-8的待测溶液在450nm处的空白吸光度。若是该吸光度很小,则能够直接加入CCK-8,若是吸光度相对较大,则需要除去培育基,并用培育基冲洗细胞两次,尔后加入新的100μl培育基和10μlCCK-8进行检测。白细胞可能需要培育较长时间。活力计算细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100A(加药):拥有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度A(空白):拥有培育基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度A(0加药):拥有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力问答:1.一个孔中应接种多少个细胞?当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量最少为1,000个/孔(100μl培育基)。检测白细胞时的矫捷度相对较低,所以介绍接种量不低于2,500个/孔(100μl培育基)。若是要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并依据每孔培育基整体积的10%加入CCK-8溶液。2.可否用384孔板进行试验?能够。向各孔中加入培育基体积10%的CCK-8溶液,若是加入的CCK-8体积太少,能够先将CCK-8溶液稀释1倍,尔后加入培育基体积20%的量。3.可否用24孔板进行试验?优选能够。向各孔中加入培育基体积10%的CCK-8溶液。4.酚红会影响检测吗?不会。培育基中酚红的吸光度能够在计算时,经过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,所以不会对检测造成影响。5.CCK-8与胸苷结合检测之间可否有相关性?有。但是,请注意因为CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,所以结果可能不同。6.CCK-8可否检测细菌细胞?能够检测E.coli,但不能够检测酵母细胞。向100μlE.coli培育液中加入10μlCCK-8溶液,并培育1-4个小时或过夜。7.CCK-8牢固吗?CCK-8在0-5℃下能够保存最少6个月,在-20℃下避光能够保存1年。若是需要长久保存,我们介绍-20℃的积蓄条件。8.若是没有450nm的滤光片,还能够使用哪些其余滤光片?还可使用450nm到490nm之间的滤光片。9.怎样减少因为CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的偏差?能够在加样前用培育基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。10.CCK-8是什么颜色?应该是粉红色。若颜色不同样,有可能会影响测定。11.CCK8可否对活细胞进行染色?不能够。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST8),并经过电子载体1MethoxyPMS将活细胞中的电子交换到培育基中的WST8上。因为生成的甲ā也是高度水溶性的,所以CCK8不能够对细胞进行染色。12.CCK8检测溶液对细胞可否有毒?CCK8溶液自己因为高浓度的1MethoxyPMS的存在而拥有一点毒性。但是,加到培育基中的CCK8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。所以,长时间的培育,如过夜也许培育数天是可优选以的。同一个细胞培育液在CCK8检测后还能够用于其余细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测也许DNA荧光检测等。因为每种细胞对于CCK8的耐受力都不同,所以在需要进行长时间培育时,先检测一下细胞在加入CCK8培育后的活力。13.在做加药实验时,药物对测定可否有影响?怎样解决?有时会有影响。若是药物拥有还原性,会和CCK8发生显色反响,增添吸光度。解决方法:第一要确认药物可否有吸取,在含有药物的培育基中加入CCK8,测定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培育基(加CCK8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK8从前更换培育基,去掉药物的影响。14.每次测定的数值不同样,是什么原由?怎样解决?可能会有以下几个原由:1.当在培育箱内培育时,培育板最外一圈的孔最简单干燥挥发,因为体积不正确而增添偏差。一般状况下,最外一圈的孔只加培育基,不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK8沾在壁上而产生偏差,建议在加入CCK8后,轻轻敲击培育板以帮助混匀。3.每孔的细胞数目过多或过少。请早先在1,000100,000个/孔范围内探索条件。15.怎样设定空白比较?在不含细胞的培育基中加入CCK8,培育必然的时间,测定450nm的吸光度即为空白比较。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应试虑药物的吸取,可在不含细胞,加入药物的培育基中加入CCK8,培育必然的时间,测定450nm的吸光度作为空白比较。16.哪些物质会影响CCK8的测定?当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定,比方含有维生素C的Glucose等(一般培育基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的状况下,会增添空白吸取,但不影响测定,扣除空白吸取即可。17.在实验中吸光度值太高,若是不能够减少细胞数目,怎样解决?能够缩短加入CCK8后的培育时间。比方:能够把加入CCK8试剂后的培育时间由2小时缩短为1小时。18.设定参比波长的目的是什么?一定设定吗?不必然要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了拿出因为样品污浊所带来的吸取。19.说明书上仅写了96孔板的测定方法,若是使用24孔板货12孔板,应该加多少许CCK-8试剂?一般状况下建议加入CCK-8试剂的量是培育基体积的1/10。优选20.在CCK-8显色过程中,怎样停止反响?有一下几种方法(96孔板):1、在显色反响后,将培育板放置4℃冰箱内。2、每孔加10l0.1MHCL溶液。3、每孔加10μl1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反响停止后,应在24小时以内测定。21.一定预培育细胞吗?不必然。若是要向保持细胞的最好状态,建议预培育细胞。若是不做细胞预培育,细胞内的脱氢酶可能会不牢固。也有人不做细胞预培育,但在做标准曲线和检测时需要一致检测条件。22.若是加入的药物中含有金属,可否会有影响?金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会控制5%、15%、90%的显色反响,使矫捷度降级。若是终浓度是10Mm的话,将会100%控制。23.CCK-8试剂的保存条件?在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。若是需要保存较长时间的话,介绍在-20℃下保存。但是CCK-8若屡次解冻和冰冻将会增添空白吸取,进而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。24.预培育后,更换培育基需要细胞计数吗?一般状况下用胰蛋白酶办理对数增添久的细胞,用血球计数盘计数,制备成必然浓度的细胞悬液即可。若是想要精美计数细胞的话,能够预培育后取培育基用血球计数盘进行计数。25.CCK-8对于不同的细胞,矫捷度可否同样?不同样,悬浮细胞与贴壁细胞对照较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培育1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,能够经过延长CCK-8的加入时间或增添细胞数目来解决。26.悬浮细胞和贴壁细胞在数目上有何差别?悬浮细胞因为染色比较困那,一般需要增添细胞数目和延长培育时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数目过大,有时吸光度会高出酶标仪的读数。27.应该每次做标准曲线吗?建议每次做。固然细胞是同样的,但是细胞的状态不必然同样,对于状态不同样的细胞,建议每次做标准曲线。若是试剂的批号不同样,矫捷度可能会有稍微的差别,对于不同的批号建议分别做标准曲线。优选28.有时在药物作用状况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,可否能
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