Promega双萤光素酶报告基因演示文稿

Promega双萤光素酶报告基因演示文稿目前一页\总数六十九页\编于十六点

自然界的萤光

发光海星 发光甲壳虫发光真菌发光节虫目前二页\总数六十九页\编于十六点

自然界的萤光发光鱼 发光甲虫目前三页\总数六十九页\编于十六点

自然界的萤光萤火虫目前四页\总数六十九页\编于十六点报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或”效果”目前五页\总数六十九页\编于十六点荧光

-Fluorescence萤光

-LuminescenceFireWormLuminescencevs.Fluorescence目前六页\总数六十九页\编于十六点萤光（Bioluminescence）荧光（Fluorescence）是化学发光（Chemilumi-nescence）的一种，激发能量来自化学反应吸收来自光源的光，再发射另一光子萤光发光计（Luminometer）荧光计（Fluorometer）液闪仪（ScintilationCounter）

电荷耦合装置光学成像系统（CCDopiticalimagingsystem）荧光显微镜目前七页\总数六十九页\编于十六点各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶优越的灵敏度高信号值无内源活性需要底物ß-gal灵敏度好细菌，血清等内源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）灵敏度好植物中内源活性低90%的E.coli,人／动物细胞中有内源活性酶的扩散可引起“过度报告”需要底物SEAP（分泌性碱性磷酸酶）分泌性报告基因(不需裂解)在HeLa,癌和其它细胞类型中有高的内源活性需要底物CAT（氯霉素转乙酰基酶）-真核细胞没有背景表达-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)放射性的灵敏度底50ｈ半衰期GFP（绿色荧光蛋白）显微镜:亚细胞定位不需底物背景可能高折叠“情形”可导致信号差别目前八页\总数六十九页\编于十六点萤光素酶报告基因的主要优点非放射性检测快（比CAT等）灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）线形范围广

（在10-16

M(10pg/L)至10-8

M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）一般比显微镜检测的荧光更灵敏

(对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力目前九页\总数六十九页\编于十六点萤光素酶报告基因的使用原理:制备含有luc/Rluc的DNA转染提供刺激测量萤光调节序列Luc２目前十页\总数六十九页\编于十六点在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调节序列加工转录转录因子信号转导翻译反义RNA受体蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制目前十一页\总数六十九页\编于十六点启动子/增强子分析“碰撞启动子”:全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+目前十二页\总数六十九页\编于十六点FireflyandRenilla目前十三页\总数六十九页\编于十六点

萤火虫生物萤光的化学萤光素+ATP+O2萤光素酶Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+Light萤光素酶:单体,61,000Daltons辅-底物: ATP.Mg2+

萤光素:Mg2+目前十四页\总数六十九页\编于十六点海肾萤光素酶反应Coelenterazine+O2萤光素酶Coelenteramide+CO2+Light萤光素酶: 单体,36,000Daltons萤光素:(Coelenterazine)目前十五页\总数六十九页\编于十六点EnzymestructuresFireflyRenilla目前十六页\总数六十九页\编于十六点为什么要使用双报告基因报告基因A(首要信号)报告基因B(第二信号)特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果比较首要与第二信号确定特异生物学反馈目前十七页\总数六十九页\编于十六点细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal或GUS活性.

CAT,-Gal和GUS检测是终点检测.

不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速．传统的双报告基因的缺点目前十八页\总数六十九页\编于十六点双萤光素酶报告基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照的优点速度样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成灵敏两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低方便一管完成检测，样品不必分份目前十九页\总数六十九页\编于十六点实验质粒对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=对照的（海肾萤光素酶)实验的(萤火虫萤光素酶)萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）目前二十页\总数六十九页\编于十六点数据处理举例第一天 萤光素酶活性(RLU) 比率 归一的活性样品处理重复 Ｆ Ｒ （F:R)变化倍数对照１ 5,1282,511２ 7,5533,815３ 10,5555,413

7,7453,913 1.98 1.00处理Ａ１ 5,13764,467２ 40,7123,57488,7877,654

6,02925,232 11.52 5.82处理B1 587,6355,144988,3478,8323 409,8813,564

661,9545,847 113.21 57.18第二天对照１ 15,52920,433 0.76２ 21,89730,841 0.7110,76013,620 0.79

16,06221,631 0.74 1.00处理Ｃ１ 850,23920,843

２ 578,95114,830３ 943,87321,788

791,02119,15441,30 55,81处理D1 14,86519,3-058,96712,28413,76720,246

12,53317,278 0.73 0.99

Δ活性倍数 (F/R)样品=

F/R)对照

第二天处理Ｃ计算如下：

Δ活性倍数 (791,021/19,154)=

（16,062/21,631)

=55.81目前二十一页\总数六十九页\编于十六点GloMax™20/20

Singletubeluminometer目前二十二页\总数六十九页\编于十六点GloMax™96luminometer目前二十三页\总数六十九页\编于十六点Whitemicroplatesforluminescence目前二十四页\总数六十九页\编于十六点Promega公司出品的双报告基因实验产品质粒萤火虫萤光素酶质粒海肾萤光素酶质粒叩头虫萤光素酶质粒检测系统非均质双报告基因检测系统（通量较低）均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）目前二十五页\总数六十九页\编于十六点载体-萤火虫萤光素酶载体pGL3家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter目前二十六页\总数六十九页\编于十六点pGL3-BasicMap目前二十七页\总数六十九页\编于十六点pGL3-ControlMap目前二十八页\总数六十九页\编于十六点pGL3-EnhancerMap目前二十九页\总数六十九页\编于十六点pGL3-PromoterMap目前三十页\总数六十九页\编于十六点辅助报告基因的相对萤光单位(RLU)启动子交叉交谈或互相干扰

实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节

内对照载体可能存在的问题目前三十一页\总数六十九页\编于十六点载体

-海肾萤光素酶报告基因载体第二代第一代phRL-nullpRL-nullphRL-TKpRL-TKphRL-TK(int-)phRL-SV40pRL-SV40phRL-CMVpRL-CMVphRG-BphRG-TK目前三十二页\总数六十九页\编于十六点Renilla

萤光素酶载体系列内含子T7启动子CMV即时早期增强子/启动子phRL-CMV

HSVTK启动子phRL-TKSV40晚poly(A)

SV40早期增强子/启动子phRL-SV40MCSphRL-nullhRL基因目前三十三页\总数六十九页\编于十六点

TK启动子phRL-TK(Int-)MCSphRG-B合成poly(A)信号转录停止位点三个读码框的终止密码子phRG-TK合成poly(A)信号转录停止位点三个读码框的终止密码子TK启动子hRL基因SV40晚poly(A)Renilla

萤光素酶载体系列目前三十四页\总数六十九页\编于十六点用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因系统（非均质检测）E1910，100次E1960，E1980，1000次Dual-GloTM萤光素酶检测系统（均质检测）E2920，10mlE2940，100mlEE2980，10X100ml目前三十五页\总数六十九页\编于十六点均质检测与非均质检测发光细胞+培养基添加试剂细胞+培养基除去培养基发光清洗细胞裂解细胞添加试剂均质检测非均质检测目前三十六页\总数六十九页\编于十六点Dual-Luciferase®报告基因检测系统组分检测缓冲液II底物（冻干粉）Stop&Glo®缓冲液Stop&Glo®底物,50X被动裂解液,5X目前三十七页\总数六十九页\编于十六点Dual-Luciferase®报告基因检测步骤裂解细胞被动裂解除去培养基..PBS洗..加1XPLB,振荡15分钟..检测主动裂解除去培养基..PBS洗..在1XPLB中刮下细胞..细胞转移到试管或小瓶中..1-2次冻融..检测检测目前三十八页\总数六十九页\编于十六点双萤光素酶检测方案 1支试管2步检测30秒钟LuciferaseAssayReagentIIPassivelysisbufferStop&GloReagent目前三十九页\总数六十九页\编于十六点DLRTMForHTS目前四十页\总数六十九页\编于十六点

DLR™双报告基因检测系统应用举例

α－黑色素刺激激素(α-MSH)对由人酪氨酸酶启动子／增强子控制的萤光素酶的表达的诱导(PromegaeNotes)目的：监测细胞对α-MSH诱导的应答材料： 实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子／增强子＋Luc(+)

阳性对照：pGL3-Control

阴性对照：pGL3-Basic

内对照：pRL-SV40

B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR™双萤光素酶检测试剂盒 目前四十一页\总数六十九页\编于十六点步骤 前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组）

pGL3-Control和pRL-SV40

pGL3-Basic和pRL-SV40 裂解细胞，测量萤光

目前四十二页\总数六十九页\编于十六点Dual-Glo™萤光素酶检测系统检测特点均质检测，为高通量检测而设计萤光信号稳定，2hrs内检测自发萤光低于检测水平目前四十三页\总数六十九页\编于十六点Dual-GloAssay:同一样品中检测两种萤光信号Stableluminescencesignalsforbothreporters

(t1/2~3.5hrs.)>10,000-foldsignalseparationbetweenthe

fireflyandRenillabioluminescencePrimaryreporter:FireflybioluminescenceSecondaryreporter:RenillabioluminescenceCellsinculturemediumAddfirefly

assayreagentAddcombinationfireflyquenchreagent

&Renillaassayreagent目前四十四页\总数六十九页\编于十六点Dual-Gloassay-选择性淬灭萤火虫萤光Selectivequenchoffireflyluminescence目前四十五页\总数六十九页\编于十六点Dual-Glo™萤光素酶检测系统试剂盒组成Dual-Glo™萤光素酶缓冲液Dual-Glo™萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo™Stop-Glo®缓冲液Dual-Glo™Stop-Glo®底物目前四十六页\总数六十九页\编于十六点操作步骤试剂制备简单将Dual-Glo™萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo™萤光素酶底物中用Dual-Glo™Stop&Glo®缓冲液按1:100稀释Dual-Glo™Stop&Glo®底物

所有的缓冲液存于室温,所有的底物存于–20°C两步加入试剂:加,读,加,读>10,000倍信号分离(淬灭)目前四十七页\总数六十九页\编于十六点

用两个萤光素酶做报告基因

Chroma-LucTM载体

Chroma-Glo®检测试剂

目前四十八页\总数六十九页\编于十六点E.Coli

表达的Chroma-LucTM

基因目前四十九页\总数六十九页\编于十六点Chroma-LucTM

基因和载体三个基因: 1.CBRluc–发红光的萤光素酶 2.CBG99luc–发绿光的萤光素酶 99.0%DNA相同于CBRluc

3.CBG68luc-发绿光的萤光素酶 68.9%DNA相同于

CBRluc两种载体骨架: 1.对照

–置换了pGL3-Control的luc+

(pCBR-Control,pCBG68-Control,andpCBG99-Control) 2.Basic–置换了pGL3-Basic的luc+

(pCBR-Basic,pCBG68-Basic,andpCBG99-Basic)目前五十页\总数六十九页\编于十六点合成的Chroma-LucTM

萤光素酶载体骨架ControlBasicEnhancerChroma-LucTM

基因SV40启动子SV40增强子SV40增强子(合成的或天然的基因)Chroma-LucTM

基因Chroma-LucTM

基因目前五十一页\总数六十九页\编于十六点Chroma-Glo™检测的化学Luciferin+ATP+O2LuciferaseOxyluciferin+AMP+PPi+CO2+LightLuciferase:Monomeric,61,000DaltonsCo-substrates:ATP.Mg2+

Luciferin:目前五十二页\总数六十九页\编于十六点不同颜色，同样试剂？C2´C2旋转，较少能量，红光不旋转，较多能量,黄绿光

目前五十三页\总数六十九页\编于十六点Chroma-LucTM

萤光素酶滤光片选择510/60nm610nmLongpass目前五十四页\总数六十九页\编于十六点Chroma-Glo™检测的特点为高通量检测设计，检测96-、384-孔板均质检测需要带滤光片的萤光发光计目前五十五页\总数六十九页\编于十六点pGL4:ANewFamilyofReporterVectors目前五十六页\总数六十九页\编于十六点Nextgenerationreportervectors(pGL4)ImprovedReporterPerformance目前五十七页\总数六十九页\编于十六点ImprovedExpressionofluc2Provides5-10xhigherexpressionthanluc+

inmammaliancellsLargereductionofconsensussiteswhereinappropriateinteractionswithhostmayoccur目前五十八页\总数六十九页\编于十六点Sitesremovedfromvector,reportergenes,andselectablemarkers:RestrictionsitesVertebrateTFbindingsitesPromotermodulesEukaryoticspliceacceptorand

donorsitesEukaryoticpolyAsitesKozaksequencesReductioninConsensusBindingSites目前五十九页\总数六十九页\编于十六点IncreasedResponseUsing

RapidResponseLuciferasesComparedtoregularluciferase,RapidResponse™luciferasesgavehigherinductioninshortertime.Inductionat3h19279150目前六十页\总数六十九页\编于十六点为什么需要快速反应萤光素酶基因？

（现存报告基因的缺点）研究者想要报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联需要更强的应答较长的敷育时间可能导致检测到次级效应(假阳性)RapidResponseTM

报告基因技术(不稳定的萤光素酶基因)目前六十一页\总数六十九页\编于十六点细胞内报告基因池信号新表达的报告基因为什么快速应答的报告基因应答性更强?快速应答非-快速应答新表达的报告基因信号目前六十二页\总数六十九页\编于十六点基于报告基因稳定性的动力学模型目前六十三页\总数六十九页\编于十六点pGL4RapidResponseReportersGeneDesignVector

Gene

DesignpGL4.10[luc2] luc2pGL4.11[luc2P] luc2PpGL4.12[luc2CP] luc2CPpGL4.70[hRluc] hRlucpGL4.71[hRlucP] hRlucPpGL4.72[hRlucCP] hRlucCP

luc2hRlucluc2hPESTluc2hCL1hPESThRluchPESThRluchCL1hPEST目前六十四页\总数六十九页\编于十六点

快速应答报告基因的设计蛋白降解序列