RNA指导的DNA复制逆转录及病毒的复制

RNA指导的DNA复制逆转录及病毒的复制目前一页\总数四十二页\编于十六点逆转录酶（reversetranscription)

1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。目前二页\总数四十二页\编于十六点Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。目前三页\总数四十二页\编于十六点多功能酶：

1、RNA指导的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA杂交体上的RNA3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互补DNA。4、没有3`→5`外切酶活性。目前四页\总数四十二页\编于十六点特点：

含有Zn2+（是否有锌指结构、DNA结合功能？）DNA合成反应要求有模板和引物。需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+）5’→3’合成方向→目前五页\总数四十二页\编于十六点逆转录病毒的基因

组复制过程第一阶段：合成负股cDNA的大部分第二阶段：以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链。第三阶段：完成cDNA的全部复制。目前六页\总数四十二页\编于十六点目前七页\总数四十二页\编于十六点目前八页\总数四十二页\编于十六点目前九页\总数四十二页\编于十六点乙肝病毒基因组的复制其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。目前十页\总数四十二页\编于十六点目前十一页\总数四十二页\编于十六点逆转录病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA目前十二页\总数四十二页\编于十六点试管内cDNA的合成常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT；来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。目前十三页\总数四十二页\编于十六点目前十四页\总数四十二页\编于十六点病毒RNA复制的主要方式1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA（+）→蛋白质（酶）→RNA复制2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。RNA（-）→RNA（+）→蛋白质、复制病毒RNA（-）。3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤病毒。双链RNA→RNA（+）→蛋白质→RNA（-）→双链RNA4、逆转录病毒。目前十五页\总数四十二页\编于十六点讨论题如何知道DNA复制中先要有RNA引物的合成？(原料/新合成DNA序列分析/专一核酸酶水解)目前十六页\总数四十二页\编于十六点病毒的复制

病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装和释放四个连续步骤。目前十七页\总数四十二页\编于十六点复制周期目前十八页\总数四十二页\编于十六点病毒的一步生长曲线病毒的一步生长曲线：以感染时间为横坐标，病毒效价为纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。目前十九页\总数四十二页\编于十六点一、吸附和穿入（一）吸附(adsorption)分两个阶段：静电吸附：病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆。真正的吸附：病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。目前二十页\总数四十二页\编于十六点裸露病毒的吸附

目前二十一页\总数四十二页\编于十六点囊膜病毒的吸附

目前二十二页\总数四十二页\编于十六点（二）穿入(penetration)

病毒体吸附在宿主细胞膜上后，可通过数种穿入方式进入细胞：1.无囊膜的病毒

一般经过细胞膜吞入，称为病毒胞饮,如腺病毒、小RNA病毒等目前二十三页\总数四十二页\编于十六点病毒胞饮目前二十四页\总数四十二页\编于十六点2.有囊膜的病毒囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接进入细胞浆内病毒胞饮:细胞膜吞入目前二十五页\总数四十二页\编于十六点(1)膜融合后进入目前二十六页\总数四十二页\编于十六点(2)

病毒胞饮目前二十七页\总数四十二页\编于十六点二、脱壳(uncoating)

不同病毒脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳，释放出基因组核酸。目前二十八页\总数四十二页\编于十六点三、生物合成(biosynthesis)病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。早期，根据病毒基因组转录成mRNA、指令合成转录合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白；生物合成阶段，病毒处于隐蔽期病毒的生物合成过程可基本归为6大类：双股DNA病毒、单股DNA病毒、单正股RNA病毒、单负股RNA病毒、逆转录病毒和双股RNA病毒。

目前二十九页\总数四十二页\编于十六点目前三十页\总数四十二页\编于十六点病毒DNA早期mRNA早期蛋白（酶等）子代病毒DNA晚期mRNA病毒结构蛋白子代病毒子双股DNA病毒复制宿主细胞转录酶目前三十一页\总数四十二页\编于十六点单链正股RNA病毒（-）ssRNA亲代病毒（+）ssRNA早期蛋白（+）ssRNAdsRNA复制中间型（-）ssRNA（+）ssRNA大量子代（+）ssRNA晚期蛋白装配子代病毒目前三十二页\总数四十二页\编于十六点单股负股RNA病毒病毒自身携带依赖RNA的RNA多聚酶。亲代（-ssRNA）（+）mRNA蛋白质（+）ssRNA子代（-）sRNA子代病毒多聚酶目前三十三页\总数四十二页\编于十六点逆转录病毒病毒RNA逆转录酶双股DNA整合至宿主细胞（前病毒）mRNA病毒RNA结构蛋白装配子代病毒RNA:DNA转录酶聚合酶目前三十四页\总数四十二页\编于十六点四、组装病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。绝大多数DNA病毒均在细胞核内组装;RNA病毒和痘病毒在细胞浆内组装。目前三十五页\总数四十二页\编于十六点绝大多数无囊膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。绝大多数有囊膜病毒以出芽方式释出时包上细胞核膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡缓慢。五、释放目前三十六页\总数四十二页\编于十六点VirusObtainingItsEnvelopefromHostCellMembranebyBudding

目前三十七页\总数四十二页\编于十六点复制周期目前三十八页\总数四十二页\编于十六点思考题1某种病毒DNA的碱基组成（摩尔百分比）如下：

A=32；G=16；T=40；C=12

该病毒DNA的特点如何？目前三十九页\总数四十二页\编于十六点思考题2简要说明怎样进行构建cDNA文库？目前四十页\总数四十二页\编于十六点思考题3组织培养的哺乳动物细胞S期长达5小时，经放射自显影测定DNA复制的速度是0