《生物实验技术》第十章 电子显微镜的原理与结构

第三篇电子显微镜技术第十章电子显微镜的原理与结构第十一章电子显微镜生物样品的制备电镜分辨率0.2nm（原子间距）λ＝ｈ√2meV加速电压50~100ＫV，电子波长0.00536~0.00370nm

电子波长:扫描电镜（ScanningelectronMicroscope，SEM）电子流特性：波动性：V一定时，λ稳定

可折性：旋转对称电磁场中会聚于一点

透射电镜（TransmissionelectronMicroscope，TEM）第十章电子显微镜的原理与结构德布洛依假说能量守恒定律成纤维细胞吞噬淋巴囊肿病毒肺支气管粘膜杯状细胞一、电子显微镜的原理

光镜电镜电子透镜：1.静电浸没透镜：旋转对称的电场空间系统。2.磁透镜：旋转对称的磁场空间系统。二、透射电镜的结构（一）电子光学系统作用：成像和放大照明部分：作用：产生对样品照明的电子束2.成像部分：3.观察记录部分：荧光屏、照相室电子枪：照明孔径角：样品上的一点接受照明电子束的角度电子枪阴极与栅极间:100～500V阴极与阳极间:50～100KV阳极阴极栅极∠100µm（二）真空部分1.空气分子与电子碰撞产生散射，使电子不能自由运动。原因：2.电子枪的高加速电压，需要高真空。3.减少对灯丝的氧化、腐蚀，延长灯丝寿命。4.残余气体聚集在样品上会污染样品。镜筒真空度：10-4~10-5托（三）电源系统电压要稳定。高压电源：电流小，电压高。作用：加速电子。低压电源：电流大，电压低。作用：成像。复习题：1.电子显微镜原理2.什么是电子枪?3.照明孔径角?第十一章电子显微镜生物样品的制备第一节超薄切片的制备方法超薄切片的要求：切片厚度50nm左右，<100nm。2.细胞精细结构良好，没有明显的物质凝结。3.切片能耐受电子束的轰击；观察过程中，包埋介质不发生变形或升华；切片的支持膜不发生变形4.切片具有良好的电子反差。5.切片均匀，无褶皱、刀痕及染色剂沉淀等缺陷。

淋巴囊肿病毒包涵体超薄切片制备程序：固定冲洗脱水渗透包埋聚合修块切片捞片一、取材、固定2.固定：取材：(1)常用固定剂：四氧化锇：戊二醛：甲醛：高锰酸钾：

(2)常用缓冲液磷酸盐缓冲液

二甲胂酸钠缓冲液

加葡萄糖、蔗糖或氯化钠等调节缓冲液的渗透压，现用现配非凝结性固定剂渗透力弱，电子反差强。与醇、醛类反应会产生沉淀；是酶的钝化剂渗透力强，电子反差弱，可长时间固定醋酸-巴比妥钠缓冲液渗透快，对酶的保存优于戊二醛，对精细结构的保存不如戊二醛强氧化剂，脂蛋白的优良固定剂（3）固定液的配制P205（4）固定方法：戊二醛-锇酸双固定法4℃（5）影响固定效果的因素

固定液的pH：

固定液的浓度：

固定液的渗透压及离子组成：固定的温度和时间：固定方式：

组织块的大小：0.5mm3影响原生质组成、膜的选择性、酶活性等。接近所要固定组织的pH

大部分动物组织平均pH7.4，细胞精细结构pH7.2-7.4。原生动物、海产无脊椎动物及胚胎组织等pH8.0-8.4；胃粘膜pH8.5，植物细胞pH6.8-7.1。

戊二醛常用2-5%；锇酸1-2%钾、钠、钙盐等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质调节两价阳离子可以减少细胞内物质的抽提。二、脱水乙醇、丙酮30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%×2次，10-15min/次。三、渗透、包埋、聚合2.常用包埋剂甲基丙烯酸酯：良好切割性能、电子反差，不吸水；升华、图像结构不细致环氧树脂：细胞细微结构好、耐电子束轰击；易吸水、黏度大、电子反差、切割性能相对较差—C—C—O甘油多聚脂1.渗透脱水剂：包埋剂=1:1，1:2，1:3，每级2-3h；纯包埋剂几小时或过夜3.包埋、聚合操作聚合：35℃12h，45℃12h，60℃24h。或60℃24－36h。环氧树脂催化剂（DMP-30；DEA）（胺类）：固化剂（DDSA；MNA）（酸酐类）：促进末端相接起横桥连接作用增塑剂（DBP）：改善切割性能包埋剂4种成分的比例、聚合温度和时间等影响切割性能包埋操作：单体（液体)含聚酯和聚醚的抗热、抗溶的惰性高分子物质（固体）四、切片.制刀制刀机玻璃刀钻石刀2.铜网的清洗旧铜网：硫酸、超声波、火焰新铜网：丙酮、乙醇电镜免疫组化：银网或白金网2mm50目、100目、200目、300目火棉胶膜Formvar膜（聚乙烯缩甲醛膜）（1）膜厚度10~20nm；（2）透明无结构（3）与所载样品不起化学反应（4）能承受电子束的轰击3.制作支持膜2%火棉胶醋酸戊酯液0.3%Formvar二氯乙烷（或二氯乙烯或氯仿）溶液

蒸馏水蒸馏水50~60℃烘干4.修块解剖镜下修块，切面1mm2

超薄切片机5.切片超薄切片厚度的判断

干涉色

厚度

暗灰色＜40nm

灰色40nm～50nm

银色50nm～70nm

金色70nm～90nm

紫色80nm～150nm√√6.染色超薄切片的染色与光学切片染色的差别？醋酸双氧铀—柠檬酸铅双染色法：

醋酸双氧铀染30min(2-5%饱和液，50-70%酒精/丙酮/双蒸水配制）

柠檬酸铅染5-10min。高碱性，易与Co2生成沉淀自然干燥水洗3遍水洗切片面浸湿，载网背面干燥载网浮在液滴上电镜能否拍出彩色照片？蜡板第二节负染色法负染色法与超薄切片的染色的区别？负染色法（阴性反差染色）：高电子密度物质“包围”低电子密度的样品，增加背景对电子散射的作用，而生物样品结构相对较多地通过电子，在电子致密的灰黑背景中衬出低电子密度、白色样品形貌。应用：大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等特点：显示样品的大小、形状及表面结构特征Archaebacteria原始细菌埃博拉病毒（Ebola）样品制备：将样品制成适当浓度的悬浮液细菌等的悬浮液磷铵酸或其钾盐、钠盐；醋酸铀；钼酸铵；硅钨酸等的溶液1-2min第三节扫描电镜样品的制备保存好样品的表面结构；没有变形和污染；样品干燥；有良好的导电性能要求:样品制备程序：8mm8mm5mm酒精或丙酮醋酸异戊酯干燥：扫描电镜样品制备中最关键一环1.空气干燥法：用于表面较坚硬样品2.临界点干燥法:3.冷冻干燥法：醋酸异戊酯液态CO2CO2

临界状态（31℃，72.8大气压），再升高10℃冷冻样品在高真空中，水或脱水剂从固态气态临界状态下表面张力等于零。临界点干燥器导电处理（镀膜）：离子溅射镀膜法

原因：电子束轰击样品，会在表面产生电荷积累，形成充电与放电，影响图像观察兔成纤维细胞（培养细胞)免疫电子显微镜技术（Immuneel