植物生理学实验

植物生理学实验..植物生理是实践性很强的学科，学生必需通过实验、实习才能加深对理论课的理解，并为后续专业课的学习打好基础，同时，通过实验、实践可以提高学员观察问题和解决问题的能力，提高学员的动手能力及独立思考、分析问题的能力；在实验课中要通过实例论述论证，让学生认识到实验的重要性，培养学生对实验课的兴趣；系统介绍植物生理的一般研究方法和基本技术；一、植物生理学实验的基本要求

重视培养学生的实际操作技能，不片面追求实验数据的准确性，培养学生实事求是的科学态度。对一些不能开设的实验，通过演示实验的方式，拓宽学生视野，完善实验内容。学生都应参加实验实习环节，选作部分实验，了解植物生理的主要测试技术，在教师的指导下，独立或团队操作，完成实验内容并用所学的知识，综合分析，写出实验报告，解释有关现象并讨论实验结果。实验课程单独考核，单独记成绩。一、植物生理学实验的基本要求二、植物生理学实验的目录实验一种子生活力的快速测定--------------------------4学时实验二小蓝子法测定植物的呼吸速率-------------------4学时实验三叶绿素a、b含量的测定---------------------------4学时实验四植物抗逆性的鉴定（电导仪法、丙二醛含量的测定、植物根系POD活性的测定）------------------------------------12学时实验五改良半叶法测定植物光合速率（选做）--------4学时实验六谷类种子萌发时淀粉酶活性的测定（选做）--4学时实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)种子生活力：是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。没有生活力的种子是死亡的种子，不能萌发。种子寿命：种子从发育成熟到丧失生活力所经历的时间。种子寿命既与植物种类有关，也与贮藏条件（种子含水量、贮藏温度）有关。正常性种子：水稻、玉米、小麦等种子（1-3年）短寿命：柳树种子（12h）长寿命：莲子（400年）贮存条件：低温、低湿，保存时间长实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[种子生活力检测评估方法](1)还原力：呼吸→NADH→还原TTC，胚呈红色。(2)原生质着色：活种子不易着色，原生质膜具有选择透性。(3)呼吸释放CO2，pH下降，酸碱指示剂显色。(4)细胞中的荧光物质：紫外照射发蓝、蓝紫色荧光。(5)外观目测法：用肉眼观察玉米种胚形状和色泽。凡种胚凸出或皱缩、显黑暗无光泽的，则种子新鲜，生活力强，可作生产用种。(6)浸种催芽法先将100粒种子用水浸约两小时吸胀，放于湿润草纸上，盖以湿润草纸，置于氧气充足，室温10-20℃环境中，让种子充分发芽；再以发芽的种子粒数除以100，乘以100%，求得发芽率。这种测定方法虽然准确，但需要8天时间。实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[实验目的]了解种子活力测定生产意义掌握重要种子活力测定方法和评价标准理解TTC/染料法测定种子活力的原理[实验原理]TTC法当TTC溶液渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH或NADPH）还原时，可产生红色的三苯甲腙（TTF），胚染成红色；如果种胚死亡则不能染色，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色。染料染色法有生命力种子胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，胚部不染色；而丧失生命力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可以自由进入细胞内，使胚部染色。实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[实验材料及药品]不同活力的玉米和小麦种子0.5%氯化三苯四氮唑法（TTC法）红墨水（稀释20倍）刀片培养皿实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[实验步骤]一、氯化三苯四氮唑法（TTC法）1、原理凡是生活细胞，就有新陈代谢。渗入生活细胞的无色的TTC能被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原成红色产物（TTF），肉眼可辨。2、材料：玉米、小麦（吸胀种子）3、方法：100粒种子，沿中心线纵切为二，做如下处理：

100半粒

+0.5%TTC→30℃，60min→

检查

100半粒,煮沸5min

注意：胚为红色的为具活力种子。4、作业：计数活种子数，计算活种子的百分率。实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[实验步骤]二、红墨水染色法1、原理生活细胞的原生质膜对物质吸收有选择性，而死细胞的无此功能，红墨水颗粒可以进入。2、材料：玉米、小麦（吸胀种子）3、方法种子100粒，沿中心线纵切为二，做如下处理：

100半粒

+5%红墨水→室温,60min→检查

100半粒煮沸5min

注意：胚部着色（红色）很浅或不着色者为生活种子，胚与胚乳着色程度相当者为死种子。4、作业：计数活种子数，计算活种子的百分率。实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[实验要点]

1、种子要先软化；

2、种子要沿种胚纵切为两半；

3、显色时要使漂浮的种子全部浸入试剂中；

4、TTC见光易分解，需在暗条件下保温染色；

5、结果观察主要是看胚部的颜色变化。实验一植物种子生活力的快速测定

(TTC法、染料染色法)[实验结果分析]比较两种种子活力的高低比较分析两种方法测定结果的差异植物种子活力测定的其它方法实验二植物呼吸速率的测定——小篮子法一、实验目的与要求掌握小篮子法测定植物种子呼吸速率的原理与步骤；比较活种子与死种子的呼吸速率。二、实验原理1、植物的呼吸作用定义：是植物体吸收氧气，将有机物转化成二氧化碳和水并释放能量的过程。葡萄糖+6O26CO2

+6H2O+能量意义：代谢的中心有机物转化的枢纽能量的主要供应渠道

2、测定呼吸速率的常用方法红外线CO2气体分析仪(IRGA)CO2可以吸收特定波段的红外辐射。当被检CO2气体通过IRGA的气室时，可使红外辐射减少或增加，且变化幅度取决于CO2的浓度。这种变化可被IRGA的检测器所检定，且以电讯号的形式输出，由记录仪所记录。氧电极法3、小篮子法密闭容器中加入一定量碱液[一般用Ba(OH)2]，并悬挂植物材料，则植物材料呼吸放出的CO2可为容器中Ba(OH)2所吸收，然后用草酸滴定剩余的Ba(OH)2，从空白和样品二者消耗的草酸溶液之差，可计算出呼吸释放的CO2量具体反应式：Ba(OH)2+CO2

BaCO3

+H2OBa(OH)2+H2C2O4

BaC2O4

+2H2O以酚酞指示滴定终点。1mL的1/44mol/L草酸溶液中的草酸与1mg的CO2等摩尔数。空白和样品二者消耗的草酸溶液的mL数差值

=Ba(OH)2溶液吸收的CO2

mg数

=

种子呼吸作用释放的CO2mg数三、实验材料与试剂材料

小麦种子（浸种）和煮死的种子的小麦或绿豆种子；试剂的Ba(OH)2；

1/44mol/L的草酸；酚酞指示剂。1#种子2#实验装置图四、实验步骤取具玻璃塞和橡皮塞的500mL广口瓶各1只，分别编号1#、2#；2.分别称取10g煮死种子和浸种活种子，以纱布包裹，悬挂在橡皮塞下方；3.向两瓶内各加入Ba(OH)2溶液20mL，立即封口，室温放置。1#种子2#实验装置图不时轻摇两瓶，1h后，拔除瓶塞，各加酚酞指示剂2滴，立即以塑料袋（保鲜膜）分别封口；将滴定管下端插入瓶中，以草酸滴定Ba(OH)2，记录所用草酸体积V1和V2。五、计算呼吸速率(mgCO2/gFW.h)

=(V1-V2)/(W×t)六、思考题在本实验呼吸测定怎样排除不应有的干扰因素？在实验过程中为什么要轻摇广口瓶数次？就计算公式而言，为什么草酸的用量可代表种子呼吸放出的CO2的量？草酸（1/44mol/L）滴定Ba(OH)2(0.05mol/L)，酚酞作指示剂，溶液由紫色变成无色，滴定至终点后，马上颜色又由无色变成紫色，原因是什么？白天在实验室测定植物茎叶的呼吸速率会受到什么影响？如何解决？如果实验材料选择的是不同萌发阶段的小麦种子及幼芽，哪一阶段的呼吸速率最大？（结合实验1进行分析）实验三

叶绿体色素的提取、分离、性质及含量测定一、实验目的掌握叶绿体色素的提取原理及方法；掌握叶绿体色素的部分理化性质；掌握叶绿体色素定量分析方法及步骤。二、实验原理2.类胡萝卜素（一）叶绿体色素：胡萝卜素叶黄素

叶绿素a叶绿素b1.叶绿素（二）四种色素的化学性质均为亲脂性>亲水性：

均不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。极性大小：

叶绿素b>叶绿素a>叶黄素>胡萝卜素

根据相似相溶原理，在有机溶液中的溶解度：

叶绿素b<叶绿素a<叶黄素<胡萝卜素叶绿素的卟啉环叶绿素分子头部的金属卟啉环中心均为Mg2+。在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁可被H+

取代而形成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则可形成绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制做植物的原色标本。（三）叶绿素的光学性质

叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素的荧光现象叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。三、实验材料与试剂实验材料：绿色植物叶片实验仪器及试剂：UV-1700分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；95%乙醇；石英砂；CaCO3；醋酸铜四、实验步骤1、叶绿体色素提取将植物叶片擦净，去中脉后取5g剪碎，加少许碳酸钙和石英砂，再分次加入10mL酒精研磨，过滤，定容至50ml，分装于5个试管内，容量分别为10ml。23451

2.水研磨匀浆（光破坏对照）取2g剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水20ml，搅均，不过滤，分装在2个试管内。四、实验步骤光对叶绿素的破坏操作太阳光下：水（1）、乙醇（1）暗处（实验台）：水（2）、乙醇（2）两组（四管）3.光对叶绿素的破坏作用30分钟后观察各试管颜色的变化，并记录，解释现象

水研磨匀浆暗光

乙醇提取液暗光

注意：乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，稀释倍数视提取液的浓度确定，浓度不要过大，否则在短时间之内效果不明显。4、叶绿素提取液荧光现象观察取试管3：从与入射光垂直的方向观察；再在透射光方向观察叶绿体色素溶液的颜色；记录叶绿素体色素溶液颜色有何不同，分析原因。5、铜代叶绿素反应向试管4中逐滴加入浓盐酸，并不断摇匀，至颜色变化，观察并记录现象；向变色后的叶绿素溶液中加入少量醋酸铜，并在酒精灯上缓缓加热，观察并记录颜色的变化。分析原因。6、叶绿素定量测定稀释叶绿素取5号试管醇提取液5ml转入50ml容量瓶中（或更大，视浓度而定），再加入乙醇定容至50ml。测量光吸收

利用722分光光度计或UV1700分光光度计，分别测定叶绿素提取液在645nm和663nm下的吸光度。

实验原理

叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。A663ab（1）A645ab（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cma和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和。实验原理

将上式整理，可以得到下式：Ca663645（3）Cb645663（4）将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为：Ca663645（5）Cb645663（6）CT=Ca+Cb663645（7）CT为叶绿素的总浓度实验原理

定量测定结果分析

将测得的数值代入到公式（5）（6）（7）中，计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。最后要计算出单位叶片鲜重中叶绿素的含量：叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝Ca×500ml（总体积数）×1ml/1000ml/L÷5g=a叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝0.1Cb总叶绿素含量(mg/g鲜重)＝0.1CT五、思考题：

1、用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取干燥材料中的叶绿体色素，结果会如何？为什么？２、研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？

3、铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用，这有何实用意义？4、计算叶绿素a与叶绿素b含量的比值，可以得到什么结论？

实验四植物组织逆境伤害程度的测定

（提前20min-20ºC速冻材料）电导法【实验原理】植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破坏，而使其透性增大，细胞内各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，将植物组织浸入无离子水中，水的电导将因电解质的外渗而加大，伤害愈重，外渗愈多，电导度的增加也愈大。故可用电导仪测定外液的电导度增加值，从而得知伤害程度。校园中任意一种植物叶片电导法【实验材料】电导法【实验方法】1实验分两个处理：对照：正常植物叶片低温：低温（-20℃）处理20min的叶片2冲洗叶片，用滤纸吸干，打取叶圆片。每个试管10片叶，加入15ml蒸馏水后放入塑料沙网（距液面1cm）统一抽气20min。3抽完气后，平衡20-30min，其间不断摇动。4电导仪测定初电导值S1。5沸水浴10min，自来水冷却（杀死植物组织），平衡10min（其间不断摇动）后即可测定终电导S2。【实验方法】

取材各3片叶打取叶圆片

10片/管，15mL蒸馏水/管抽气20min平衡20-30min测量S1煮沸15min冷却平衡10min

测量S2【实验步骤示意图】相对电导度：L=（S1-空白电导）/（S2-空白电导）伤害度（%）：(Lt-Lck/1-Lck)*100【结果计算】1蒸馏水中加吐温(可用洗衣粉代替），洗仪器时出现泡沫。吐温作用：表面活性剂，促进细胞间隙水分与外界交换。2抽气作用：抽出细胞间隙空气，保证水分充分进入细胞间隙。3纱网作用：防止抽气时叶圆片被抽出。【注意事项】测定电解质外渗液时，为何要对材料进行真空渗入？测定过程中为何进行震荡？【思考题】

一原理

植物器官在逆境条件下或衰老时,往往发生膜脂过氧化作用,丙二醛(MDA)是其中产物之一,通常将其作为脂质过氧化指标,用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。植物组织中丙二醛含量的测定丙二醛(MDA)硫代巴比妥酸(TBA)高温酸性三甲基复合物(3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮)(红棕色)上述反应在532nm处有最大吸收波长但此反应受可溶性糖的极大干扰：糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收(糖与TBA反应产物的最大吸收波长在450nm处)＋所以，测定MDA含量时需排除可溶性糖的干扰根据Lambert-Beer定律，对最大吸收光谱不同的两个组分的混合液,代入数值，计算得出混合液中两种组分的浓度公式：可溶性糖：C1/(mmol/L)=11.71OD450MDA：C2/(μmol/L)=6.45OD532－0.56OD450

二材料、仪器设备及试剂(一)材料植物叶片(常温和低温两种状态)(二)仪器设备研钵,试管,移液管,恒温水浴锅,离心机,分光光度计

(三)试剂

10%三氯乙酸(TCA)0.6%硫代巴比妥酸(TBA)

三实验步骤(1)MDA的提取取叶片剪碎，加10%TCA2ml和少量石英砂，研磨，进一步加入3mlTCA充分研磨，匀浆液以4000r/min下离心10min，上清液即为提取液，定容至10ml。(2)显色反应及测定吸取上清液2ml，加2ml0.6%TBA，混匀，在沸水浴中煮沸15min，迅速冷却，在4000r/min下离心5min。取上清液测定532nm和450nm下的OD值。对照以2mlTCA代替提取液。四结果计算以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。分别计算衰老和对照组的值。MDA浓度

MDA含量(μmol/gFW)＝

D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。五注意事项％的三氯乙酸对MDA-TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。思考题1.通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？2.说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。3.TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？4.为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？5.丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？6.如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？7.植物正常叶片与低温冻害叶片相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。过氧化物酶活性的测定——愈创木酚比色法一、实验目的1.学习比较植物根系或叶片过氧化物酶的制备方法2.掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法。

二、实验原理什么是过氧化物酶?

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。酶活力表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量(g)或体积(ml)。因为酶是一种生物催化剂。酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应的能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大。二、实验原理酶促反应速度酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T)酶催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈慢，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就是酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度(用v表示)。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。单位：浓度/单位时间常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明显。酶促反应随时间增加，产物增加。二、实验原理酶促反应的速度曲线Vmax时间产物的生成量斜率＝浓度/时间＝V从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。因此研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切线斜率(v)=浓度/时间二、实验原理测定原理RH2+H2O2→2H2O+R在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470