炭疽检验技术

炭疽检验技术炭疽检验技术第1页

炭疽是由炭疽杆菌引发人兽共患急性、热性、败血性传染病。其病理改变特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。炭疽（Anthrax）炭疽检验技术第2页发病、死亡污染环境形成芽胞经口食入食草动物经过直接接触、消化道、呼吸道等路径感染人类食肉动物偶然感染

炭疽检验技术第3页革兰氏染色阳性；长而直大杆菌，菌体两端平直；大小为1.0～1.5um×3～5um，致病菌中最大；无鞭毛，不能运动。一、病原——炭疽杆菌（Bacillusanthracis）炭疽检验技术第4页荚膜染色在碳酸盐培养基中、厌氧环境下生成荚膜。一、病原——炭疽杆菌（Bacillusanthracis）炭疽杆菌在病人、病畜体内多散在或呈2～3个短链排列，有荚膜（红色）炭疽检验技术第5页在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖尸体内，不形成芽胞。一旦体内炭疽杆菌暴露于空气中，接触了游离氧，在一定温度下(12--42℃)就会形成芽胞。芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。一、病原——炭疽杆菌（Bacillusanthracis）炭疽检验技术第6页A：炭疽芽孢薄片（透射电镜）有致密胞膜

B：炭疽芽孢（扫描电镜）收缩成椭圆形

C：炭疽繁殖体薄片（透射电镜）炭疽检验技术第7页

炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都能生长，最适生长温度为37℃。最适pH为7.3～7.6。在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连长链，低倍显微镜观察呈卷发状。在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠菌落，菌落周围不溶血。二、培养特征炭疽检验技术第8页光镜下炭疽杆菌菌落边缘呈卷发状炭疽检验技术第9页在血液琼脂平皿培养基上不溶血或微溶血炭疽检验技术第10页三、致病性与免疫性致病物质:主要有二种荚膜:由质粒编码,含有抗吞噬作用炭疽毒素:由质粒编码（致死主要原因）保护性抗原（protectiveantigen，PA）水肿因子（edemafactor，EF）致死因子(lethalfactor，LF)炭疽检验技术第11页四、抵抗力芽胞抵抗力强煮沸40min或干热140ºC3h灭活；在干燥土壤或皮毛中能存活数年至20年；对化学消毒剂抵抗力强(5%石炭酸5d杀死）；对碘及氧化剂较敏感；繁殖体抵抗力弱对青霉素、红霉素、氯霉素敏感

炭疽检验技术第12页炭疽病原学检验炭疽血清学检验五、炭疽试验室检验炭疽检验技术第13页炭疽病原学检验标本采集和样品处理细菌培养涂片、革兰染色、荚膜染色、光镜检验Ascoli试验动力检验噬菌体裂解和青霉素敏感性试验串珠试验生化试验炭疽PCR基因检测五、炭疽试验室检验炭疽检验技术第14页炭疽血清学检验标本采集和样品处理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平检测

（酶联免疫吸附试验ELISA）血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测五、炭疽试验室检验炭疽检验技术第15页《人间传染病原微生物名目》序号病原菌名称危害程度分类试验活动所需生物安全试验室等级学名汉字名大量活菌操作动物感染试验样本检测非感染性材料试验1Bacillusanthracis炭疽芽孢杆菌第二类BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-12Brucellaspp

布鲁氏菌属第二类BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-13Burkholderiamallei

鼻疽伯克菌

第二类BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-14Coxiellaburnetii

伯氏考克斯体

第二类BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-1

大量活菌操作：试验操作包括“大量”病原菌制备，或易产生气溶胶试验操作（如病原菌离心、冻干等）。动物感染试验：特指以活菌感染动物试验。

样本检测：包含样本病原菌分离纯化、药品敏感性试验、生化判定、免疫学试验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。非感染性材料试验：如不含致病性活菌材料分子生物学、免疫学等试验。炭疽检验技术第16页炭疽病原检验程序标本处理（方法依据标本情况选择）直接涂片、革兰染色、荚膜染色、光镜检验接种培养（可用选择性培养基、血培养基）37℃，16~48hAscoli试验基因检测可疑菌落（形态）初检培养性判定试验深入判定涂片、革兰染色、荚膜染色、光镜检验动力检验液体培养噬菌体裂解和青霉素敏感性试验产荚膜培养及光镜检验串珠试验生化试验基因检测酶免疫法测外毒素动物毒性测定炭疽检验技术第17页采取标本时必须遵照两条标准1、尽可能在抗生素治疗前采取标本；2、除必要时并在具备条件试验室内，不得用解剖方式获取标本，所需血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。（一）炭疽病原学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第18页1、血液标本全部疑似病例和病畜，都应采取血液标本5-10ml，标本量最少应满足以下检验需要：涂片进行显微镜检验；接种培养基进行细菌分离培养；分离血清检验抗体；常规血液检验。荧光定量PCR检测2、皮肤溃疡标本在皮肤炭疽病人溃疡边缘用棉拭子擦拭，沾取分泌物。（一）炭疽病原学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第19页3、粪便与呕吐物标本表现消化道症状可疑病人搜集粪便或呕吐物标本，尤其注意选取其中混有血液个别，置无菌容器中。4、痰与咳碟标本表现为呼吸道症状可疑病人应搜集其痰液标本，无痰液者，应取供细菌分离培养用培养基，打开平皿盖置病人口鼻10cm处；令病人对平皿咳嗽，然后快速盖上平皿。（一）炭疽病原学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第20页5、脑脊液标本表现为脑膜刺激症状病人，腰椎穿刺获取脑脊液。6、尸体标本食草动物死于炭疽时，通常会从口、鼻、肛门等腔道开口流出血液，这种血液应是首先采取标本。假如血液已渗透土壤，则应搜集混有血液土壤作为标本。没有血液流出，或已不可能获取血液标本时，可经过穿刺心脏取得血液或穿刺肝脏等实质性脏器取得组织标本。（一）炭疽病原学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第21页7、肉类标本假如怀疑罹患炭疽牲畜已被宰杀，或对商品肉类进行常规检验时，可剪取小块肉类标本。如有可能，尤其应剪取肝脏、脾脏等富含血以及含有淋巴组织标本。8、毛皮或其它可疑污染物品标本剪取小块毛皮或其它可疑物品，剪碎置无菌试管内，加适量无菌生理盐水浸泡。（一）炭疽病原学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第22页9、水标本检验水体污染时，用广口瓶搜集水样。10、土壤标本在牲畜死亡或宰杀地点，应取土壤标本以供检验。普通要采集表层土壤（10cm内），每份150g左右。（一）炭疽病原学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第23页全部来自病人、病畜、尸体标本都应首先进行直接涂片镜检。步骤：涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检验镜检：取末稍血液或其它材料制成涂片后，染色镜检，发觉有多量单在、成对或2～4个菌体相连短链排列、竹节状有荚膜粗大杆菌，即可确诊。（二）炭疽病原学检验——显微镜检验炭疽检验技术第24页革兰染色（二）炭疽病原学检验——显微镜检验炭疽检验技术第25页荚膜染色（二）炭疽病原学检验——显微镜检验炭疽检验技术第26页采集到标本均应进行细菌分离培养。培养基选取血琼脂平板、营养琼脂平板和选择性平板。（三）炭疽病原学检验——细菌分离培养炭疽检验技术第27页标本处理：无菌标本，如血液或脑脊液，直接涂布上述两种平板，每平板0.1ml，组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以白金耳涂开。污染或陈旧标本，均应首先制成悬液。依据标本中含菌量多少，可将悬液适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再10000rpm离心1分钟，取富集沉淀物。将所得悬液沸水浴15min，冷却后涂布上述两种平板，每平板0.1ml。（三）炭疽病原学检验——细菌分离培养炭疽检验技术第28页

以上平皿在37℃孵育过夜或24小时后，观察培养情况。粗糙不发光，比较扁平，有点儿象蜡样杆菌菌落但较小，卷发状。有菌体形态不规则，有彗星状拖尾，白或灰白色。（三）炭疽病原学检验——细菌分离培养炭疽检验技术第29页在血平皿上为白色菌落，较粘，不溶血或微溶血。（三）炭疽病原学检验——细菌分离培养炭疽检验技术第30页

在静止液体培养基中生长在上层和底部，培养基透明，拿起则呈丝絮状下垂，摇之均匀混浊，无菌膜和壁环。1、肉汤生长（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第31页诊疗炭疽简便而快速方法，其优点是培养失效时，仍可用于诊疗，因而适宜于腐败病料及动物皮张或风干、淹浸过肉品检验。但此法缺乏高度特异性，因为炭疽杆菌耐热抗原在其它腐生芽胞杆菌也共有。新鲜、陈旧和外环境标本都可采样20-50g，加水5-10倍，煮沸10分钟，用双层滤纸过滤后制成可溶性热沉淀抗原，用于热沉淀反应（Ascoli试验。2、Ascoli试验（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第32页

取一玻璃沉淀管（直径2-4mm，高20-40mm），将0.3ml炭疽菌沉淀血清加于小玻璃管底部，再缓缓加入采集处理可溶性热沉淀抗原约0.3ml于血清上层，注意勿使液面混合。置37℃5min，于两液面间出现白色沉淀环为阳性。本试验应有炭疽菌诊疗抗原作阳性对照。炭疽菌沉淀血清处理可溶性热沉淀抗原白色沉淀环（四）炭疽病原学检验——判定试验2、Ascoli试验炭疽检验技术第33页

在盖玻片周围涂凡士林，将待检菌液体培养物或固体培养物用生理盐水制成均匀悬液滴于中央，再将凹玻片盖于其上。快速翻过来使盖玻片在上，菌悬液悬成滴。置高倍镜下观察，细菌不应有运动。3、动力试验（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第34页4、噬菌体裂解和青霉素敏感性将挑取可疑菌落密集划线接种于平板上，在划线区内一处滴一诊疗用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片。37℃孵育8～24h后，在滴噬菌体处有透明噬菌体斑，青霉素纸片周围有显著抑菌环，廉价可断定接种物为炭疽芽胞杆菌。（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第35页4、噬菌体裂解和青霉素敏感性（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第36页

制备有牛肉消化液琼脂培养基载玻片，涂种待检菌，在一端加青霉素纸片或纸条。置平皿中于37℃培养4～6小时后，在低倍镜下观察。在有菌生长和抑菌区临界限处，应有显著经典串珠形态。5、串珠试验串珠试验时炭疽杆菌形态：串珠状或长链状（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第37页

葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖甘露醇水杨素MRVP石蕊牛乳+++—————产酸，液化迟缓产酸不产气

不产生靛基质和H2S6、生化试验API50CH/E判定条能够进行炭疽生化判定（四）炭疽病原学检验——判定试验炭疽检验技术第38页

待测模板制备：模板制备可直接从标本样品，也可从培养物制。标本将炭疽杆菌接种于固体培养基平板上，37℃培养18h，取培养物悬浮于1ml生理盐水，离心，弃上清，沉淀用ph7.8TE溶液洗起悬浮，于沸水浴中煮15min。离心，上清用0.22um滤器除菌过滤。滤液即为模板，可置4℃备用于PCR扩增。（五）炭疽病原学检验——PCR判定试验炭疽检验技术第39页cap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap外R：CGGATTGTATATGGAGTGGG产物大：1242bp

rpoB普1F：GTACGCCAATCGATATCATGrpoB普1R：GATCATCGTCATCTTCCGTA产物大小：618bp

pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA普R:AGACCGTGACAATGATGGAA产物大小：923bp引物序列：（五）炭疽病原学检验——PCR判定试验炭疽检验技术第40页

反应体系(50µl)10×反应缓冲液5µl4×dNTP混合物（每种2.5mM）4µl引物（上游）1µl引物（下游）1µl待测模板1µl无菌去离子水37µlTaqDNA聚合酶1µl

反应条件：预变性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；最终72℃5min。（五）炭疽病原学检验——PCR判定试验炭疽检验技术第41页标本采集和样品处理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平检测（酶联免疫吸附试验ELISA）血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测炭疽血清学检验炭疽检验技术第42页依据血清学检验结果能够对病人做出追溯诊疗，因为诊疗必须由双份血清做出，需要尤其强调急性期血清采取。首份血清应在检视病人时采取，通常应一次采取血液标本供涂片镜检，细菌分离培养，血清学检验及常规血液检验使用。血清分离后置4℃保留，待取得恢复期血清后，一同进行抗体检验。恢复期血清应在发病后15日左右采取。（一）炭疽血清学检验——标本采集和样品处理炭疽检验技术第43页（二）炭疽血清学检验——

抗炭疽芽胞和毒素IgG水平ELISA测定炭疽检验技术第44页抗炭疽芽胞和毒素IgG水平ELISA测定程序包被抗原：所用各孔加入检测用炭疽标准芽胞抗原液或检测用炭疽毒素抗原液100μl，酶标板贴上封口膜，置4℃过夜。次日，甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100μl，甩干，重复洗涤3次，每次3min。↓待检血清反应：每种待测血清使用两行，以增加测定结果可分析性。两行1~12孔各加生理氯化钠溶液100μl。在第1孔加待测血清100μl，从第1孔以倍比稀释法向后至第12孔进行稀释混匀。酶标板贴上封口膜，置37℃60min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100μl，甩干，重复洗涤3次，每次3min。(同时做空白、正常血清孔对照)↓酶标抗体反应：于各反应孔中加入新鲜稀释工作浓度辣根过氧化物酶标识羊（兔）抗人Ig