柠檬酸生产工艺简介

柠檬酸生产工艺简介第一节概述一、柠檬酸的用途（一） 在食品工业的应用疗戳酸被秫为第一食用酸味剂.在食品7：业上概广泛地用作酸味剂、增榕剂、缓律制、抗氧化剂、除曜脱臭剂、整合制等、其具体用途，不胜枚莘°1、 饮料据统计75%〜80%的柠檬酸用于饮料工业。2、 果酱与果冻3、 糖果4、 冷冻食品5、 酿造酒6、 冰淇淋和酸奶7、 脂肪与油柠檬酸作为抗氧化剂.并能餐合微■元素使脂肪，油和含脂肪食品不易查扇在精燎植物油和动物油中添M0.005%-0.02%柠株酸，有较明显效果日8、 腌制品9、 罐头食品和水果加工10、 豆制品和调味品（二） 柠檬酸在药物、美容品、化妆品上应用1、 药物“999胃泰”柠橡酸蛇挪即枸格酸镶钾是一韩有效的育药和收敛刑。•柠檬酸蜓是泻下剂,用于X光透视前的清肠，使老人缓解便秘俯苫■=在日本已列为常用的泻踌而牛一产“它与小苏打、柠糠酸、精浆混合使用具有起泡性。拧檬酸普遍应用F各种营养口眼液等，缰障pH3.5-45,维持治性配料的稳定性.加强防腐割的效果.罟株酸与水果香精合用，赋予K们喜爱的香酸口感顷柢盖药物的苦味，尤其是中药制制,在液态配料中加入。.02%柠檬酸可形成微童供和铜的络合物.硒缓清性配料的降解作用*在口嘴药片中采用0.1知~03%帝檬酸能改善药片的风味，使其具有柠檬风味.2、 发蜡与化妆品在配制发蜻过程中用柠模酸调节pH,在抗氧化剂体系中，作为食属离子薯合剂，都需要柠槌酸作为标准配料.在酸性染发液和电烫发中和被中也都含有疗檬醴〔视头发需要而定）,柠檬酸与柠株酸钠配成缓冲液保持pH4.5、5E之间可增强发靖的防腐剂作用，采用0,2^~1,8%柠概酸制成低pH（4.0-5.0）洗发剂和大头皮屑洗发制，洗头时可增加头发的光泽.恢复头发弹性必通过柠株酸与碳酸钠或碳酸狙钠相结合提供g的气溶胶喷射器喷射药物与化妆品已迅速发届°例如：在国外普遍使用泡牌型牙卤清洁荆、（三） 柠檬酸在工业上应用1、金属净化柠糠酸是高效饕合清洗剖.对钙、镁、铁、格、铜等污垢有效，广泛用于各种金属表面的潸洗，洗后废水可生物降解不污染环境普2、 去垢剂柠裱酸钠能增M去污性能，在许多家用去垢剂产品中可加快生物阵解，可作为磷酸款的代用品，大量随用于洗衣粉、去污剂之中，拧椽酸钠与铝硅酸盐一起增强洗净剂的3、 无土栽培农艺4、 矿物5、 ……二、 乳酸的用途L-乳酸聚合成聚乳酸（PLA）利用PLA可生产溶匝薄膜、定向薄膛顶湖薄膜.食品保鲜薄膜.,纤维、无纺组织、硬质容器、纸和板涂房、食品包装材料、手术缝台线、修夏骨折的骨片、人造皮肤、无毒透明的儿童玩具，并可望在混坊蛆物中取代聚防等,，乳酸在低脂食品市场用氐也在增加.而且新三、 L-苹果酸的用途据报道，1988年苹果酸在美国酸味削市场上占有率为4%,1901年上升到4.5%。但由于苹果酸的价格太高，故只用于特殊食品，■步发酵造一旦大规模投产’L一苹果酸的价楷将会有大幅度地下降“1997年Bayer*司称，美国和欧洲软饮料使用的酸味荆中，将成少柠檬酸用量，增加L苹果酸用量，尤其在使用二肽甜味剂时更能突出】.•早果酸网.昧，改善口感.提高产品质三、 葡萄糖酸的用途诫萄糖酸是灰拳有机酸中唯一的双歧杆菌增殖因子■.作为朴钙剂的葡黝情酸钙和作为豆腐凝固剂的荷萄糖酸•&内酯已在许多国家生产并应用，以日木最为普遍■:,葡萄慵酸的口感也相当好,应是软依料种食品裁理想的酸味剂.四、 琥珀酸的用途琥珀酸有贝类特有的鲜味，广泛应用于清酒、黄酒等酒类和酱油、发酵俊品和各种调味料&日本年产1.0万吨左右，生产厂商有川崎化成公司、日本触媒化学工业研究所、武田制药公司和理研化学公司u日本’花王浴皂”每年使用琥珀酸2000-25000我国柠檬酸发展简史1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。同期，天津工微所开展了以适合我国国情的薯干原料深层发酵柠檬酸的研究工作。之后，上海工微所用该所的“东酒2号”黑曲霉为出发菌株，用薯干粉做培养基，很快选出了我国第一代深层发酵柠檬酸生产菌种AL558，由原轻工业部立项，组织上海、天津两个工微所、上海复旦大学生物系、上海新型发酵厂（筹）、上海酵母厂、天津柠檬酸厂（筹）、南通油洒厂（南通发酵厂前身）等单位，在南通油酒厂展开了善于深层发酵、全离交提取工艺的中、大型试验工作，并取得了成功，因而推动了我国柠檬酸工业于20世纪70年代初形成了工业体系。70年代中期到80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后选育出5代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、糖蜜等原料的优良菌株。上海、天津两工微所和上海复旦大学生物系为此做出了很大贡献。各生产厂的广大科技人员和生产工人通过不懈地努力，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别在缩短发酵周期、提高单产方面成绩突出，使我国柠檬酸发酵技术处于世界领先地位。无锡轻工业学院和天津轻工业学院为柠檬酸行业培养了一大批科技力量，已成为行业发展的骨干。1995年金其荣与蚌埠柠檬酸厂共同开发了玉米去渣发酵新工艺。同年黑龙江甘南柠檬酸厂于脱胚玉米去渣发酵工艺也成功投产。玉米新工艺的成功，使我国的柠檬酸工业进入一个

新时期。新时期。柠檬酸的命名骨縻酸(cirricacid)又名枸格酸、学名2-羟基丙烷三接酸C2-hydroxytricarboxylicacid)、2-羟基丙烷-l.2,3-三按酸(l-hydroxypropant-l.2.3-tricrtrJxjxylicEicid)^分子式：QHsOr相对分子质量：192,13商品拧糅酸有一水物和无水物之分，水物的分子式为GHfiO-H’O,相Xj分子敏量为210.140无水柠椽酸的英文名称1Anhydrouscitricacido”水柠榛酸的英文名称:Munohydratecitricacid^柠燃酸的分手结枸式：C^-COOHHO—C—COOH

fC^-COOHHO—C—COOH

fCH，—COOHHD—HC—C8HLTIC—CCK1TTICH2—OOOH异荷檬酸第二节柠檬酸发酵机制与代谢调控黑曲霉柠檬酸生物合成途径EMP11HMP生接时EMP/HMP^Z：1产1WEMP/HMP=*：1碑琳溜尊式祠肩哦S2-3-5疗探酸生物合成途径黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。（1） 生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP：HMP=2：1，后者EMP：HMP=4一步证实Ckknd和珀hnsm（1954）研究提出的结论#黑曲霉柠檬酸产生菌在生提期,葡砧糖的降解是由酵解（EMP）和戊糖磷酸途径（HMP）共同完成的。其比率为EMP/HMP=2：h在柠檬酸产酸期，也存在HMP途径的酶，其比率为EMP/HMP=4：1,即的％的葡萄糖由酵耕（EMP）途径代激的。HMP途径主要存在于陶子形成阶段，因为它提供合成核酸所需的前体物质.因此酵解（EMP）途径在黑曲霉柠榛酸产生菌中起主要作用’（2） 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。（3） 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个。02固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。柠檬酸生物合成的理想途径逸小15逸小15由葡督暗发酷程概藏的建坦途径由图2-3-5所示，册蜀精生成柠鳏酸的全过程中,在碳平街方面没有碳原子的损失，在乙酰CoA和草酰乙酸郊•合时还从水中引进一个轼原于.总反应式为：可见拧椽酸发酵对情的理论转化率.为1如一7%.以食一个结晶水的拧檬酸计为Em黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控

A13-13 柠生物舍成有关I*的谟节性做a鹰物亲利方激活剂抑IH刑蹴酸果精氟酵E^.7.1J1^■fi-Pt5心=i*7mmcVL■■4NH；AMPPi忡柴睽】Kb=0.25mnwl/LPEP：J(,j=0-25mnw4/I-ATF(法度睡高时〉丙■毗漱牌EC2.7,1.40ATFiKttEOSnunol/LPEP^KZ.OMiwnd/LMELK.q&mmdFLK*：Kft-20mmoi/L丙期映励北曹Ea.，LLADPrK11=fl.n5mmdl/LPYP:K■项胡nuiwl/LOQtjKa=KSSmmol/LATP：Ke-0.2Smmol/LKqASP；E=L9mnwl/LPiK,40-UOmmol/L柠鼻髅合成ItECLL37乙蛛CaA*Km-0.01innkcl/L覃咪乙跳」KD=O.0O45nu™VLK-NH；CcA；K,=0-25mmot/LATP-Mfl；K产6mmDl/L «««i落-日戳杲■I「：AMPPi虫匚二二M6二琳隆果IfNH； I牌岫藩IIII碑MH*尊式丙■・^JKCoA尊果瞄HlIHlIIII碑MH*尊式丙■・^JKCoA尊果瞄HlIHl富笋|；lA11版珀酸JK乌头IftI㊀反mw«i©童活耳拧■嗽I一i J图236黑曲件柠檬酸积累的代谢调节（一）柠檬酸积累的调节1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节（1）磷酸果糖激酶<FFK酶）调节黑曲霉柠橡酸产生肯的PFKB&是酵解途径中第-个调节酶，也是决定EMP途径代谢流量的最重要的美罹酶，此能受正常的生理浓度范圈的柠檬酸和ATP的抑制,为AMP.Pi.四田所激活’还能有效地解除柠檬酸和庄TP对PFK醴的抑制,如表2-3-15所示中NFV在细胞内的生理浓度水平下，PFK酶对柠裸酸不敏感（见表2316"考察柠檬酸发酵时•PFK#的这些致应物在细胞内的浓度表明，鼓离子揪度与柠椎酸生产速率有密切关系，并且显示在铉映乏和充足条件下的显著差别.可以认为，镭的救由是通过按高子浓度升高耐减弱了柠檬酸对PFK酶的抑制o哀2-5-UIM于套足和话高于缺乏下黑曲毒PFK活力因于搓菌毛•'（mmcWL）活知u4KLA槌足13KO（3）丙■酸裁化酶的调节丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点，而明酸既可以由丙耐酸脱套酶催化脱樱生成乙BfcC^Af也可以由丙,酸斐化酶催化经CQ固定反应生成草酰之酸，皿固定反应的强度对柠探酸积累非常重要=保持丙丽酸这两个反应的平衡是莪得柠檬酸高产率的-』重要条件'如上所述黑曲霉柠檬酸产生菌中存在磷酸烯醇式丙酮酸瘦化酶和丙丽酸梭化88,以丙酮懿峻化S8为主,此酶已被提纯，其酶学性质已清楚，其活性不受代谢产物的调节。2、三羧酸循环的调节（1） 柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶是TCA环中的第一个酶，但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。（2） 顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节顺乌头酸水合酶、NAD、NAD-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7。并发现在柠檬酸发酵中，无论培养基中是否存在铁离子，顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧，保证柠檬酸得到充分积累。一旦柠檬酸积累到一定水平.细胞内的PH下降，就能抑制顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种：一种NAD异柠檬酸脱氢酶.活力很低。两种NAD异柠檬酸脱氢酶，其一在细胞质中，不受柠檬酸抑制，其二在线粒体中.与TCA循环有关，它受生理浓度的柠檬酸抑制，所以当柠檬酸积累到一定水平时，就抑制此酶的活力，从而更加促进柠檬酸的积累。NAD异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性pH和30mmol/L锰离子时被解除，这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故之一。（3） a-酮戊二酸脱氢酶酌调节在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是。a-酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生长期，菌体内不存在a-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。a-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是了TCA循环中唯一不可逆反应，一旦a-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：⑦TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②a-酮戊二酸又抑制NM一异柠檬酸脱氢酶的活性。（二） Mn2+调节比较Mn2+丰富和Mn2+缺乏的分批培养时发现，当黑曲霉在缺Mn2+的产柠橡酸培养基中，菌体的组成代谢（戊糖磷酸途径，生糖途径）的酶和三羧酸循环的脱氢酶活力显著降低。不论锰丰富或缺乏，都未检出a-酮戊二酸脱氢酶。乙醛酸循环的脱氢酶也几乎无活力。当缺锰时，HMP和TCA循环水平低，生长期菌丝的蛋白质、核酸和脂肪含量明显减少，而氨基酸和铵离子水平升高，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。当黑曲霉生长在缺锰的高浓度糖培养基中，细胞内铵离子异常高，达25mmol/L，随之出现谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨政和Y一氨基丁酸的积累和分泌，使铵离子对细胞毒性被解除。这些氨基酸的积累是由于测报蛋白质合成受到干扰，导致蛋白质分解增加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。当锰离子充足时，添加环己酰亚胺，可促进铵离子和氨基酸积累，由此可知，铵离子积累是由于蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白质的再合成受损伤引起的。锰离子是催化核糖核酸形成聚合阶段第一步反应酶所需的，若猛离于缺乏，核酸、蛋白质合成受阻，而使细胞内的铵离子水平升高。铵离子水平升高解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制.从而增加EMP代谢流量，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，而使柠檬酸大量积累，这就是锰离子的调节效应。（三） 氧对柠檬酸积累的调节乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：（1）从图2—3—7可知氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化的氢受体。〔2〕近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链，如图2—3—7所示。响神、 | *X 0现辩映/ 翻诲*b 1一华略膏。一触雌*台航图2-3-7黑曲毒的昧准呼吸链和侧系呼吸情此侧系呼吸链对水杨酸酰异肟酸（SHAM）敏感，在黑曲霉生长期，此侧链不受水杨酸酰异肟酸的抑制。在柠檬酸发酵产酸期受SHAM的强烈抑制。通过标准呼吸链氧化时产生ATP,会反馈抑制PFK酶，而通过侧系呼吸链不产生ATP,而当缺氧时.只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，从而导致柠檬酸产酸急剧下降。一旦恢复供氧，标准呼吸链复活，而不影响菌的生长；但侧系呼吸链却不能恢复，故对产酸速率有很大影响。所以柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定要充足氧的供给，以保证更多的NHDH2通过侧系呼吸链将H2交给O2生成CO2和H20，使呼吸产生的ATP减少，解除ATP对PFK酶的反馈抑制。使EMP代谢流增大，丙酮酸和草配乙酸生成水平提高，柠檬酸产率提高。三、黑曲霉柠檬酸发酵机制由于严格限制供给话离子等金属离子，或筛选耐高浓度锰离于、锌离子、铁离子等金属离子的菌株，降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力，使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大；存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但不产生ATP,这样使细胞内的ATP浓度下降。因而减轻了ATP对PFK酶、CS酶的反馈抑制，促进了EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成；丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定反应取平衡，保证前体物乙酰CoA和草酰乙酸的提供，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力；a-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏.使黑曲霉中的TcA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TcA循环，降低细跑内ATP浓度，另外使，a-酮戊二酸浓度升高。反过来.又反馈抑制异柠檬政脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解；顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬政分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进柠檬酸自身积累，pH降至2.o以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸积累并排出体外。第三节柠檬酸发酵生产菌种黑曲霉(Asp.niger一、 黑曲霉柠檬酸的形态特征在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起.边缘整齐，菌落较小，带皱折。在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生较密。菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。孢子柄(14—15)^(1.5—2)Uo⑸顶囊球形d直径为50一72Umo小梗分二层，初生小梗和次生小梗区别明显，初生小梗(30〜31)X7Um，次生小便大多是3根，也有2根的，大小为(9〜13)pmX3.8pm。分生孢子串珠状着生，黑褐色，表面组糙且有明显的刺状突起，4.7—5.2pm，成熟后遇振动易散落。二、 生活周期黑曲霉属半知菌纲，一般只进行无性繁殖，由孢子发芽开始到新孢子形成、成熟，为一个生活周期。图2—3-1所示是黑曲霉发芽和抱子形成过程。孢子在液体培养基中培养6—8h开始萌发出芽，长出多根芽，逐渐形成菌丝，

菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育细胞称为足细胞。由足细胞长出分生孢子梗，分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融合，使顶端膨大形成顶囊，上面退生二层小梗，小梗上长出成链的孢子。这样一个生活周期约50h，但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢子也逐渐不断地产生，直至营养枯竭为止。®2-3-1黑曲尊生活周期二径美苴—、培养基

«133 国外爵曲零拧椭觑生产菌的培界基生科皓菲基/(ff/10•14014(120QAS以LO2-S她so厂阳心U.25(1.25(J.(KM4&O.OMJOt0.0038O.OOW2S*0.l>022。一时0+00i0,001国内Ifllcoer. 的晴养基垮残基组质牛推皓器基挖■均养是⑴粉面给养基麦.汁!»~im2%2%⑵簌曲时基灼？血部狭理IdOOmLlfe⑴事千粉16%-20%13^-14%4%-5ft四、 黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征能耐高浓度的柠檬酸(15%以上)，而不利用和分解柠檬酸。耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性a-淀粉酶和酸性糖化酶。其a淀粉酶在pH2.0仍能保持原活力的80%以上。在PH2.5,40°C下作用30min尚不失活。其糖化酶最适作用PH在4.O一4.6,最适温度为60一65C。在柠檬酸发酵条件下，当培养pH下降至2.o以下时，仍能保持大部分活力。能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的Mn2+、Zn2+、Cu2+。在深层液体发酵培养时，能形成大量的细小菌球体，菌球体直径为o.1mm，菌球量达104个/mL以上。在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上，生长不好，生成小菌落，孢子形成能力弱。在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+，即NH4+库水平高。菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯。细胞壁几丁质含量高，但B葡聚糖和聚半乳糖含量低。在生长和产酸期，细胞内蛋白质、核酸水平低。具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP。五、 黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育

柠檬酸生产菌的分离筛选与其他微生物相同，一是收集相当数量的现有菌种，经分离纯化，从中挑选出合适的菌株；二是采集大量的含菌样品，分离筛选出优良菌种。若收集现有菌种则可直接活化、分离、纯化，并测定每个菌株的性能，从中选出最优良的菌株；若是通过采集含菌样品来分离选育，可根据糖质发酵柠檬酸高产菌主要是黑曲霉，它们具有强大的分解淀粉、蛋白质、果胶、脂肪等物质的酶系特征，可从腐烂植物、水果表皮，也可从含有腐烂未热水果的酸性土壤中分离。一般将采集的含菌样品经适当的增殖培养，或将样品浸出稀释液100mL和10%薯干粉、10%柠檬酸混合.在振荡摇床上于33—35°C下“富集”培养3—5d，然后进行分离筛选。1、分离筛选培养基«136 分■孰化黑签李疗槌度生产菌的常用培养基培雅基成用途麦芽汁球留2田露等仲程切酒琼脂适用于零菌，酵毋的分高素曲汁踱脂曲汁噩加卫％球厨疑用于毒蔺、薜理的分藏马铃再琼脂马锐菖顾ft此成小块，加1顺mL水质沸lh,用衣屋外•布滤也青奄.海通中加藏概2勉、琼服ZUk,定容1岫mL适用于掉菌、尊形的分宣旗氏,筝氏琼脂MaNCK0.J%iKGI0-115*,K2HP(\(L1hMg^t■7H*0。一僧知PeSD.-TH^O.OOl%.琳。£嘛适用于所有4B.催妙■高段多的U株嵯性定愉能精15暮.NHWb0,3^,KlhPOj。一,妹.MeSOj,7H/J025%,〔mVL益酸「7%.«!«2%抑制不耐眠的号慝，击用于耐岐的熙曲■令高繇化院性事干森干液化袂湖魅，柠«R10%,原脂肯■直接利用暮干粉的耐酸异曲■雌性淀粉r&海物渣化藏m%.柠■藏m%,敢唐wit分高宣授利用淀鞘的耐髅原曲株酸性无卷■平密玉米粉灌化禳0脱- 京庙2%分再直接利射玉术粉的可酸2、分离筛选方法#237 常用的点的尊柠蒙尊生产■的分需纯化方法打法忧映点打法用天毯瓯普京上连”*巢“塔卷康于盛有豪凿水及液辑球的三朔瓶中.置于摇推机上族访知血，航■悬浮于水申，符搂伸环经火爆井冷即后格一环上述悬序带于已无甜的lOfLfBjc直芽汁（或半曲汁＞如£嫁照册子根上，成其他驶性第脂平板上,加图JK样制蝶i不创破墙舞基）后,倒量于35-3H：摭粗确中.堵雅40~4伯.携甲适当的单一■葬，移接到是芽汁〔米曲汗】斜而试管靖养基上，持检周尊、快速、易行、理如的单南蒂获得率平标划鲤牙寓姓化培靠1一扇形荆线擅 W--分区划城法3—方帖划蜩雄 4—连埃加巍怯取己亚幽的装有无■水试管救玄，依好踪另Ml无■嗫瞥吸取上蔑蛭玻JK珠的尊洋撒小许.注入1号域管内.充分摇匀.使曹均勺地悬裸在无■水中.眼戢此悬浮波JmLiT入茉二支试管中,取此类推,麻呈最后一范试IT104 10' 10-6ff«tM化养•管，•必颈更换一吏无菊童骨.烙最后点试管中登别用无器吸凿版弟imL悬#MitA2~3+5eM«#it中.再函入iBHt冷却至缠-4ST；的耄芽汗r104 10' 10-6ff«tM化养筒甲•.易手分府的曹蕃为均匀、单-幌曹赛播率*3、摇瓶筛选与性能测定采用上述的分离培养基和分离筛选方法.参考高产菌的形态特征，从分离筛选平板上，挑出单一菌落，移接于麦芽汁琼脂斜面上，于33r培养6—7d。孢子长好后，分别接入三角瓶，摇瓶发酵试验（初筛、复筛），从中筛选出产柠檬酸高、糖转化率高、且产酸稳定性强的菌种，作为生产用菌株。六、高产柠檬酸菌种选育实例HQL-601菌种是无锡轻工业大学以黑曲霉H—142为出发茁株，通过Y一射线、硫酸二乙酯、高温、单独或复合诱变处理，通过高温、高酸及高渗培养条件的加压定向筛选，从600多株突变株中筛选出来的。它的发酵温度为40〜41°C，周期60—64h，20%薯干粉摇瓶产酸13%，其产酸纯度明显优于现有生产菌。诱变过程如下：黑曲4H-142实验室保地菌株，产麒7%［的心T射雄和DES夏什姓理.家氏-虞申翰嫁指示墙养诚.4耳1□埼养5由黑曲9HIM5产醪8-5强QES谜变处蹲没DES御高■舰会it理,高怜概毂氐墙洋基.4ZC堵舞3~5d携珀畿琼脂墙养基，墙菲3~W.察氏斜面上,40P培葬9-1M黑曲«HQ44产馥LL3%早DES和富温蒙台谴变,高柠株■.高律*氏平板于42。K增葬F~5d黑曲#HQL-36产酸口.5%［度夏分离纯化黑曲琴Ha“&01产酸13.0%］连■怡10代黑曲萼HQL-WI七、 黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏（一）斜面低温保藏法此法是生产中普遍采用的一种保藏法。菌种孢子移接于麦芽汁琼脂斜面后，于35°C下培养7—8d，待长满黑褐色孢子后，放在2-4^冰箱中保藏，此法可保藏1—2个月。（二载体吸附保藏法载体吸附保藏的原理是将菌种吸附固定在适当的载体上，进行干燥保藏，通常使用的载体有砂土、夫皮、谷粒或麦粒、硅胶、粒状活性炭、滤纸等。这些载体对菌种起着一定的保护作用。（三） 真空冷冻干燥保藏法此法的优点是利用有利于菌种保藏的一切因素，使黑曲霉柠檬破产生菌的孢子始终处于低温、干燥、缺氧的条件下。保存期可达I年至10年之久，因而它是目前广泛采用的有效菌种保藏法之一。其缺点是手续麻烦，需要一定的设备。在冷冻过程中，为避免孢子在冻结和干燥过程中死亡，常添加保护剂。黑曲霉孢子的保护剂一般采用牛、马、羊血清或者用脱脂牛奶加1%谷氨酸钠。据报道黑曲霉用此法可保藏10—15年。［四］ 液氮超低温（一196C）保藏法此法适用于菌种的长期保藏，1965年以来在ATcc作为常规保存方法而普遍应用这是因为液氮的温度可达一196C，远远低于微生物新陈代谢作用停止温度（—130C）所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用也随之消失。八、 黑曲霉柠檬酸生产菌的扩大培养一级 二级 三级原种一鲜面墙罪 三厢厢歌曲堵弄一种「窣堵养 岌:酵H发酵I ————■-直孩接入发酵醯一、菌种的扩大培养（一）斜面培养菌种的斜面培养必须有利菌种的生长和孢子的着生，而且不产酸，并要求斜面菌种要纯，不得混有任何杂菌和耐酸的其他霉菌和酵母菌。培养条件应有利于菌种的繁殖和孢子生长，培养基以多含碳源、少含氮源为原则。1.斜面培养基⑴察氏一多氏琼脂培养基（2）察氏琼脂培养基为防止因培养基营养过于丰富，而影响孢子的着生和质量，目前有的工厂采用2/3大麦芽加1/3大米，按1：4比例加水，置60C下糖化4h至碘液显示无色，然后离心15min获得麦芽汁。调整浓度至5Be，添加25g/L琼脂。空白斜面需放置3—4d，待斜面培养基表面干固后（水分全消失）才能使用，否则接种后菌苔长的薄，菌丝细长，而孢子着生稀少。（二）麸曲三角瓶培养1，麸曲培养取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，以减少淀粉含量。按麸皮：水=1：1.0〜1.3比例加入水，拌匀至无干粉又无结团现象。拌匀后，分装入1000mL或2000mL三角瓶中，每只l000mL三角瓶装湿麸皮约40g，2000mL三角瓶装湿麸皮约100g或用水洗麸皮表面，挤去水分，至手抓有水而不下滴为宜，按适当量装瓶。用8层纱布封扎瓶口，在o.1MPa表压下灭菌40〜60min，趁热摇散，冷却至35°C,培养1d。末发现气味异常或染菌，即可使用。在无菌室中，于无菌操作条件下，每一个三角瓶中接入1—2环已活化好的斜面菌种孢子，或2mL斜面菌种的孢子悬浮液，于30—32C下培养16—20h后，白色小菌落已盖满曲层表面，这时应摇瓶一次，使培养基疏松、铺平、继续培养。再经4—6h，即约培养24h后，可看到培养基结成块状，白色菌丝生长旺盛，但未产生孢子。培养基品温控制在(35±1)C.每隔12—24h摇瓶一次，孢子长出后停止。摇瓶时必须充分摇匀，使结块的培养基疏散，铺平后，继续培养。待长出的黑色孢子布满丰盛后，即可使用。此麸曲可直接作为种子罐种子，也可以作为二级种子，再扩大培养，扩大量为200倍，即一瓶歌曲可接种200只相同的三角瓶。〔三〕孢子悬浮液的制备将上述符合质量要求的三角瓶麸曲，在无菌操作下，每瓶加入500〜600ml无无菌水，摇匀，切勿将棉塞打湿，在火焰下并瓶或并入接种瓶中。种子罐扩大培养(1)种子培养基裹I3-11 种子峰韩子焙辨基配方:昭醉骨檬酸所成用原料种子堆神‘F培养裕配一方.怒情25-5UkK,NhLNO, MkSJ•7氏。。门3虹.(J3心，lmo[/LIICIWmL,加术是容至】00虬水解糖还原#50—2.1「了1士t.，(J, 0. 加水建睿至i000Lt用HCI调pHS.O黄血盐世珅过〔含煎箫MS ftXk6.N瓦卜01一7g一思5.小或44虹oow-0.13kg,ZnSCt,Lkx.7选。0，成H舟0调pH^fl.8-70薯干粉■干勒W.h-13,.〔村氏血龄网门新-Q・5餐喉畿皮I，-3%.用自蟋淀励淀精牛翌一14器，-3%或(村晦上龄网，；甄-项，5牌，pH自雄王米畅玉米破化沌｛■对■蜡)11%-15*,裁度2%-3驻或福Nd4%―%*pH自蝶(2)接种量根据发酵罐容积不同所用麸曲孢子量不同。一般5000L种子罐接入20瓶麸曲种子(70g麸皮/1000mL三角瓶)。(3)培养温度(35±1)C。⑷供氧对C0827菌种来说，搅拌转速150r/min通风量为0.3—0.4m3/(m3.min)。⑸种龄以薯干粉为原料，控制在18〜20h，此时糖化活力相当高，一般取20h。(6)种子质量要求①镜检菌丝粗壮，结成像菊花状的小菌球体。菌球直径不超过100Am，1mL种子液达1—2万个，无异味，元杂菌.无异常菌丝opH2.0〜2.50酸度0.5%〜2.0%。柠檬酸含量0.58g/dL左右。第四节发酵原料的预处理参考通论部分。柠檬酸工业用的喷射液化工艺用玉米粉发酵柠檬酸，采用HYW喷射液化器，二次加酶液化工艺，取得了较好效果，其工艺流程如图2—4—6所示。此法的具体操作是：用温水将玉米粉调成17°Be的浆乳，加稀石灰水调整pH至6.4〜7.0，加需要酶量的2/3,备用。通蒸汽进喷射器、保温系统，待出口温度达90^以上时.打开浆料回流阀，开始将浆料泵入喷射器进行液化，出口料温达到95—97°C时，关小回流阀，料液进入层流罐，在90〜95°C条件下，维持30—60min，然后进行二次喷射，料温达到140—145C，进入维持罐维持3—5min后，经闪冷器迅速降温后落入二次液化罐中，加余下之1/3，a淀粉酶，在90C左右维持30min，碘检查无蓝色反应，然后用稀HCI或稀H2SO4调pH至4.8—5.2，趁热过滤去渣。调整好氮源之后，经连消或实消后发酵。二次高温喷射有利于蛋白质类杂质进一步凝固，并可使玉米皮松软，附着其中的淀粉大部分可在二次液化时被利用。司引1d皂％担反国五米村院薜符愫整二队碗射液化工苫旅也冷第五节柠檬酸发酵培养基灭菌参考通论部分。培养基灭菌基本上可分为“实消”和“连消”两种。柠檬酸工业因用薯干原料，纤维较多，习惯用罐液化和罐内实消相结合的工艺，这种工艺虽简便，但大容量发酵罐升温和降温时间较长，高峰蒸汽负荷太大，发酵罐利用率偏低，耗热量大。“连消”即连续灭菌工艺，它采用高温瞬间灭菌方法.能使培养基中的营养成分的破坏减少到最低限度，蒸汽高蜂负荷低且均衡，热耗相对较少，灭菌质量好，总灭菌时间短，发酵罐利用率高，适用于大容量发酵罐和连续自控操作，连续灭菌系统是由调浆罐、连消泵、连消器（或用喷射器）、维持罐（或管道）和冷却器所组成（见图2—4—10）。其具体操作可参考喷射液化工艺。连消之前要进行空罐灭菌。冷却器有板式、螺旋板式和喷淋式。曜样■ 喷淋辟却A图2-4-10连续五函工艺流榨第六节无菌空气的制备参考通论部分。目前在我国发酵工业中具有代表性的无菌空气制备系统的设备流程如图2-4-15所示。当然这并不是标准流程。现在空气干燥的新型设备不断出现体积小、效率高的除菌装置更加完善，因此无菌空气制备系统流程也在发展，工艺更加简化。由于棉花活性炭总过滤器有较多的缺陷，特别一旦空气系统染菌.将被迫全面停产，损失较大，故新的设计流程改为每台发酵罐设置预过滤器、蒸汽过滤器和精过滤器方式的单向流程，更加合理和方便而且除菌效率高。有的厂家在保留棉花总过滤器的基础上设两级过滤器，用意是让棉花过滤器作为粗过滤器使用，也不需灭菌。但棉花受潮后易繁殖霉菌，因此这种使用方法有害无益，而且加大了压力降。概括地说，空气净化系统的设备功能，在过滤器之前是脱油、除湿，保证洁净干燥的空气进入过滤器油层之后除去了空气中的杂菌。只有保持滤层的干燥和完好，才能达到除菌的目的，因此除湿、脱油设备是不可缺少的。尽管拧檬酸发酵产酸快，抗杆菌污染能力强，但酵母、霉菌等耐酸杂菌，仍能给柠檬酸发酵造成极大的威胁甚至导致发酵失败。E2-4-15两级冷却，加热除菌源皂示耄田I一帆过掳器之一压缩机 4,伯-冷却器5-统底样商器■7—丝国分高器8—加热器母一杜滤嚣第七节柠檬酸深层发酵工艺一、黑曲霉柠檬酸发酵条件控制（一）营养要求黑曲霉柠檬酸产生菌是化能异养微生物，只能利用有机碳源。为了满足黑曲霉菌的生长、繁殖，必须提供足量的碳源、氮源和无机盐.使培养基中的化学物质元素组成和菌体物质元素组成相当。但要使黑曲霉柠檬酸产生菌大量生成和积累柠檬酸，必须控制营养物质的供给，使菌体生长受限制，处于半“饥饿”和代谢失调状态。依据柠檬酸发酵机制，黑曲霉大量生成和积累柠檬酸的基本条件，是提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，而对磷、锰、铁、锌等无机盐物质的要求则处于低水平。1、 碳源目前都认为高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征。我国采用薯干粉的深层发酵，粉浆浓度为16%〜20%，若采用淀粉质的深层发酵粉浆浓度可达25%。2、 氮源氮源的作用是合成细胞物质（蛋白质、氨基酸、核酸、维生素等）和调节代谢，这是因为细胞中铵离子浓度的升高，能解除ATP和柠檬酸对关键酶磷酸果糖激酶的反馈抑制.使EMP代谢流增强.有利于柠檬酸生成与积累。生理酸性氮：（NH4）2SO4，（NH4）3PO4， （NH4）2HPO4生理碱性氮：NaNO3.KN03两性氮：nh4no3有机氮： 麸皮、米糠、蛋白陈、氨基酸、尿素等。经试验证明，黑曲霉偏好于无机氮，当有机氮和无机氮同时存在时，它首先利用无机氮。在无机氮中，生理酸性氮比碱性氮好，这是因为生理酸性氮中的铵离子被利用后，使培养基变酸，可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束，转入产酸阶段，PH下降到较低水平有利于柠檬酸的积累。所以铵盐既可以调节代谢，也可以控制PH。简单的有机氮比复杂的好，例如，尿素比氨基酸好，氨基酸比蛋白胨好。在蔗糖合成培养基上，NH4NO3是最好的氮源。黑曲霉以同样的速度消耗两种氮，所以培养基酸度不变。若原料中有机氮含量过分丰富，菌生长代谢加快，对缩短发酵周期有利。但是不利于柠檬酸积累，产酸率不高。这就是我们不能利用含蛋白质丰富的粗玉米粉直接发酵的原因。另据报道，在拧核酸发酵中途添加铵盐，尤其是当发酵中柠檬酸生成速率开始下降时，添加铵离子最为有利，它对菌体无影响。这种效应可能与铵离子对柠檬酸积累调节作用有关。近年来，我国采用高浓度薯干粉发酵，为缩短发酵周期，提高柠檬酸产酸速率，有时也添加0.01%〜0.05%的（NH4）2SO4。3、无机盐无机盐是构成微生物生命活动不可缺少的物质.在柠檬酸发酵中，有的构成菌体有的促进代谢，有的促进产酸等，因此对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵具有重要的作用。我国采用诱变方法改良的菌种能耐很高的金属离子，因此原料和水不经任何处理就可用于发酵。采用薯于粉、马铃薯、木薯和糖蜜等原料发酵，原料中所含仔、K、Mg、S量已足够黑曲霉生长，不需专门添加。（二）温度控制黑曲霉属嗜热微生物，最适生长温度33-37^，一般认为深层液体发酵中，温度低于28r，导致长菌和产酸缓慢。而高于37r，导致菌体和杂酸形成过量.呼吸作用加强，影响糖酸转化率。我国采用淀粉质原料的浓醪发酵，由于培养基中固形物较多，对菌起保护作用，一般温度控制为（35±1）r。若采用孢子接种的发酵过程中，在孢子发芽和菌球体形成阶段，可采用40r高温培养，促进其发育，进入产酸期时再降到35r左右。（三）pH控制黑曲霉柠檬酸生产菌生长发育适宜PH3〜7。在含糖合成培养基中，分生孢子在PH6.8—7.2发芽良好.若起始pH较低（例如4.5以下），会强烈抑制它的发育。在PH2.5以下，分生孢子不膨胀.当pH大于7.5时分生孢子会剧烈膨胀，甚至破裂。一般认为柠檬酸发酵在菌种生长期，pH维持在4.5，而柠檬酸积累时即产酸期的最适PH2.0〜3.0，pH3.0以上容易产生草酸，在pH5.0容易生成葡萄糖酸（葡萄糖氧化酶最适PH5.6），在PH3.0以下是柠檬酸积累的条件。采用淀粉或薯干粉等原料的柠檬酸发酵过程中，淀粉的糖化和柠檬酸的生成和积累，是处在同一个环境中，都是由黑曲霉柠檬酸产生菌完成的。发酵的技术关键是兼顾糖化和产酸，要保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。黑曲霉柠檬酸生产菌的酸性糖化酶的最适PH为4.0〜4.6.随着pH的下降，尤其当PH降至2.2时，液化酶和糖化酶会大量破坏，而柠檬酸发酵的最佳PH是2.0以下。要解决两者矛盾，可采用下列方法：（1） 采用酸性平扳驯化，分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高酌菌株；（2） 通过调节风量来控制，通常在16—18h前控制低风量，使PH维持在有利于菌种生长和糖化作用的范围。［四］接种量和接种方式1、接种量柠檬酸发酵接种量多少，直接决定于进入培养系统（包括一级种子和二级种子）的泡子数量，从理论上讲，菌球体的极限数量与接种孢子数量相等。大量文献报道，经试验证明，由于孢子相互吸附.以及孢子在发酵液中萌发时，菌丝互相缠绕等物理作用，大多数菌丝球是由几个孢子、乃至一团孢子形成的。因此接入孢子数与形成菌丝球仅为正比关系，而与孢子数量相差很远。在一定范围内孢子接入量与产酸速率成正比，随着孢子接种量的增加，柠檬酸产率也提高。2、接种方式孢子接种虽然初期产酸缓慢，但发酵24h之后，生酸速率明显提高，而且有后劲，最终产酸率高于菌丝种子。菌丝种子接种时.在同样接种量的条件下，产酸水平随着成分加高而提高。另外，菌丝接种时，如果接入发酵罐的种子内存在杂菌，这些杂菌从受到低pH抑制的种子培养基环境，恢复到自然pH环境的发酵液中，正好适宜多数杂菌繁殖。若生产菌株不能迅速产酸以降低PH，染菌机率则增大。事实证明，采用泡子接种能收到良好的效果。（五）溶解氧的控制黑曲霉柠檬酸产生菌是严格的好氧微生物，不管生长、繁殖、还是产酸均需要氧。黑曲霉生长、繁殖所需的能量是通过呼吸作用获得的，即葡萄糖彻底氧化为CO2和H20，产生大量ATP（约38个ATP）,此过程需要大量氧。图24-19传推酸发酵中甄的消耗率的变化从图2—4—19可知，由于菌体生长过程中呼吸作用，消耗大量的氧气，特别当菌体生长接近最大值时（20〜24h）即旺盛的对数生长期时，其需氧达到最高蜂，其后（一般24—30h）菌体生长缓慢，进入产酸期，氧的消耗率立即降低到一个较低的水平，并一直持续到发酵终了。二、柠檬酸深层发酵工艺流程BB2-4-20我国深层发降肝株囊基本T芝;流程三、生产实例菌种Co827、3008。麸曲菌种制法同前（表2—4—25）‘览.种子帽培养基甘一瞽干物］6强70%,（NHJwSao.S册，0.1MP,蒸汽火菌知min,接AlOUOuiL二角瓶藐曲菌种20-50H（根据发酵勤容积而定、（35±1）匚焙弄16-24箱4,发酵谶培养基甘薯干粉】6%~网％,中温中淀粉酶0一1切1157灭菌W-15m.ru培养温度（35±1）匚通风量0,08-0,15m3/（in^-min｝（视接种方式及培养情配而定L宇发酵制口）通用式,V'*=50m*,六箭叶搅拌器3挡，转速90-llOr/mnu（2）底搅拌通M.式，V^fr-100m\自吸式桨叶1挡,转速135「血而6.实例I30时发酵疆-级接种工艺结果如表2-4-26所不.表2-426 皿&27与30OT恭神发・6批平物值比赖割定项m产酸率『％骑化率淄发■靖单产S性J4.96105.577aJJ1一74J0.6?"374.631.M第八节柠檬酸深层发酵染菌的处理措施抢救染菌的措施细菌污染醪的处理发酵前期污染细菌，可加大通风量.使发酵迅速转入产酸阶段，MH下降至3.0以下时，细菌可被抑止或自溶死亡（含米曲霉菌）。发现较迟，染菌较重，要立即加柠檬酸母液或浓盐酸、硫酸等将发酵液pH调节到＜3.0再加大风量。如细菌占绝对优势，本菌较少（某些细菌所产生的毒素能抑制或溶解黑曲霉菌体），则须将发酵液pH调节到4.。〜4.5后，重新按常规消毒。再一级接种，或与正常发酵罐（产酸>6%）相互混合继续发酵，但必须谨慎使用，防止“两败俱伤”。酵母污染醪的处理这是柠檬酸发酵最难处理的染菌事故，野生酵母即使在pH<2.0时，照样生长。早期发现，培养基稍有异味而总糖消耗不多，最好把PH下调至4.。〜4.5后，间接加热至90°C重新灭菌，一级接种继续发酵。如已产酸但不高，则加CaCO3上调pH至。〜4.5,间接灭菌，重新一级接种发酵。后期污染酵母，如产酸已达到可提取程度，可提前加热灭菌后放罐提取。如产酸不高但还原糖尚有可继续发酵的量时，可采取提高培养温度至39—40C，加大风量并添加0.0025〜0.0035g/dLCuSO4-5H20，即50m3发酵罐加l〜1.4Kg的硫酸铜抑止酵母生长，加快产酸速度，减少损失。污染曲霉及青霉醪的处理如污染米曲霉，当pH<3.o时米曲霉会自溶对发酵危害不大。如污染黑曲霉或青霉则危害极大，这些杂菌能在低pH醪液中生长，结果使醪变稠、变黄、粘度增大，严重影响氧的传递，导致发酵失败，甚至“倒罐”。对付这种污染的措施：早期发现，可另补充一些新培养基，加CaCO3调节pH至4.o〜4.5,重新灭菌，一级接种发酵。所有染菌罐除早期发现细菌污染外，其他都会对发酵造成一定的危害，发现越晚，损失越大，甚至“倒罐”，尤以酵母、青霉等为甚。所有染菌醪对提取收率都有一定影响。必须指出，等到镜检时发现染茵，一般发酵液杂菌个数已达到104个/mL，是较严重的程度。所以，从事发酵工作者一定要严格执行无菌操作.熟悉业务.以防为主，勤查勤检把染菌事故消灭在萌芽之中。第九节柠檬酸生产下游工程一、概述成熟的柠檬酸发酵醪中，除含有主产物柠檬酸之外，还含有纤维、菌体、有机杂酸、糖、蛋白类胶体物质、色素、矿物质及其他代谢产物等杂质，它们或来自于发酵原料、或在发酵过程中产生，它们或溶存或悬浮于发酵醪中。通过各种理化方法，清除这些杂质，得到符合各级质量标准的柠檬酸产品的全过程，即为柠檬酸生产的下游工程。它是一个确保产物“丰收”，提高企业效益的生产系统工程。上世纪60年代，科学家们把离子交换树脂脱盐工艺引入了钙盐法提取柠檬酸工艺，解决了考钙盐法的一些弊端，此后，在工艺和提取设备方面又不断地改进和完善，使总收率可达到80%〜90%，因而，钙盐离于交换提取工艺至今不衰。••阴寓于交换柱h2so4Mjg|过3Slr了此水过制」 净化馥1FMjg|过3Slr了此水过制」 净化馥1F1F粗柠搬酸液活性凝魅*蓦甬一J洗晶水—离心阳离子交换住母波窗渣I浓有机蔚厂淡有机废水湿石膏渣图2-5-1钙盐高子交换提取工艺流程(一)发酵醪的预处理1.发酵产物的组分薯干原料深层发酵醪的组分范围值：柠檬酸90—140g/L葡萄糖酸2—38g/L残总糖15—25g/L纤维及菌体22—40g/L草酸2—38g/L其他杂酸3—48g/L蛋白质3—58g/L2.发酵醪预处理方法预处理的目的是为柠檬酸的提取工作创造一个好的条件。柠檬酸发酵醪预处理主要是将新鲜成熟发酵液进行热处理，热处理温度为75—90°C，时间宜短不宜长。热处理具有以下几个作用：及时热处理可杀灭柠檬酸产生菌和杂菌，终止发酵，防止柠檬酸被代谢分解，使蛋白质变性而絮凝，破坏了胶体，降低了料液粘度，利于过滤；(3)可使菌体中的柠檬酸部分释放出来。但热处理要注意以下两个问题；

温度过高和受热时间过长，会使菌体破裂而自溶，释放出蛋白质，反而使料液粘度增加，颜色变褐，不利于净化；过长时间的直接蒸汽加热，会增加料液稀释度，有损于收率(最好间接加热)。深层法发酵醪可在发酵罐内间接或直接加热.或在过滤加压罐中加热，或用换热器间接加热，或在输送过程中用混合式加热器加热，但不能破坏菌球体，否则影响过滤。(三)发酵醪过滤工序的主要目标彻底除去发酵醪中的悬浮物；除去发酵醪中的草酸；尽可能减少滤液的稀释度；把柠檬酸的损失减少到最低限度o工序的技术参数一次滤液柠檬酸(CAM)N9.0g/dL悬浮物W0.1g/dL滤饼含水量W55%〜70% 柠檬酸(CAM)N2.5g/dL复滤液柠檬酸(CAM)N9.0g/dL悬浮物W5mg/dL草酸03、除草酸的方法发酵液中的有机杂酸主要是草酸和葡萄糖酸，它们都能形成钙盐沉淀，但前者的溶解度很低，故可在中和前除去.后者溶解度高，中和之后绝大部分在废水中排除。利用草酸钙溶解度(0.0006g/100gH20)低于硫酸钙溶解度(0.2036g/100sgH2O)的原理，在一次滤液中加硫酸钙，使其生成草酸钙.在一次滤液复滤时，一并除去，其反应 方 程 式 如 下：|CaSU.一顷4'II2SO4或加C妃以除去，反应方程式为：(COOHL+ —g I+2HCJ游离出的H2SO4或HCl与溶液中同柠檬酸形成盐类的Na+、K+、NH4+、Fe3+等形成硫酸盐或氯化物，将在中和过滤时随废水排出，过量的CaSO4同时起助滤剂作用。(三)中和工序的主要目标从发酵清滤液中提取高纯度的四水柠檬酸钙柠檬酸钙要易过滤和洗涤；废水中柠檬酸钙沉淀要限制在最低程度;尽可能减少洗糖水量，把柠檬酸钙的溶损减少到允许范围。工序的技术参数(1)工序的技术参数(1)启动参数料液中含：柠檬酸(CAM)悬浮物碳水化物N9.0g/dL（可用母液调整）W5mg/dLW2.0g/dL极微量5如dL<1*5%<1.0%极微量5如dL<1*5%<1.0%0.03-0,15（kg/kg）70-75Vft5™90C4.4-4.6（CaCO；）4.8-5.2〔685-90V3.0-3*5倍（带式）4.5-5.0-13（抽谑）0,025-0.028MPa洗柠朦酸钙水温水量(与钙比)^40%（RCS）<0.02%（以糖计）G3tKJm£/L草酸有机条酸中和剂中含：Mg<)盐酸不溶物Fe2Oj+Al^Oj：2)技术参数中和剂浆乳中固形物含量>22%加石膏鼠中和起始湿度中和最终温度中和最终pH过滤真空度(3)效果参数柠檬酸钙含：固形物易炭化物废水中拧檬酸钙含量中和原理中和的原理是基于在一定温度和PH条件下Ca3(C6H5O7)2・4H2O在水中溶解度极小的特性，用钙盐或钙碱与溶液中的柠檬酸发生中和反应，产生四水柠檬酸钙从溶液中沉淀析出，除去残液得到柠檬酸钙固体。所用的中和剂有CaCO3、Ca(0H)2的浆乳。反应方程式为：2CJWHQ+3&CO3—尸4田。++3CQt+H2O2^^07*^0+303；OH)2—Ca3 +4^0［四)酸解本工序的主要目标把柠檬酸钙完全分解为柠檬酸和石膏；石膏渣中的柠檬酸含量减少到允许程度;尽可能提高酸解液中柠檬酸含量；控制酸解液中的SO42-在适当范围之内；⑸酸解液中的