免疫细胞化学多媒体

第六章

免疫细胞化学技术（免疫组化）(immunocytochemistry)

是利用免疫反应来定位组织和细胞中特异大分子的一类技术第一页，共五十五页。​(

第一节免疫细胞化学原理★

第二节免疫细胞化学方法

免疫细胞化学技术第二页，共五十五页。​(

一、免疫反应的特异性

二、免疫细胞化学反应

三、抗原

四、抗体

五、标记物及其在光镜和电镜下可见性第一节免疫细胞化学原理第三页，共五十五页。​(

免疫反应的特异性表现在：抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体产生对其特异的抗体并与抗体发生反应

抗体针对某种抗原分子而产生的，特异地识别该抗原并与其结合

一、免疫反应的特异性

第四页，共五十五页。​(

免疫细胞化学反应的原理：

把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下可见的标记物标记特异抗体(或者标记抗原抗体复合物)使特异的免疫化学反应具有可见性,从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的

二、免疫细胞化学反应第五页，共五十五页。​(组织抗原抗体标记物

标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标第六页，共五十五页。​(抗原

免疫细胞化学反应过程为：＋标记物第七页，共五十五页。​(间接法

直接法

两种免疫反应方法第八页，共五十五页。​(第九页，共五十五页。​(抗原：

凡能刺激机体产生抗体并能与抗体特异结合的物质称为抗原

抗原性：

物质所具有的这种特性称为抗原性

三、抗原第十页，共五十五页。​(

细胞中具有抗原性的化学成分有：

蛋白质多肽脂蛋白多糖

脂多糖糖蛋白核蛋白

这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗?从生物学功能来看都包括了哪些物质?第十一页，共五十五页。​(

酶、受体、抗体、细胞外基质激素、细胞结构蛋白、病原体等具有抗原性的物质包括：第十二页，共五十五页。​(

四、抗体CCFcFabNNNNCC第十三页，共五十五页。​(Fab片段具有抗体活性，决定某种抗体与抗原结合的能力和特异性Fc片段决定该抗体本身作为抗原刺激机体产生抗体的能力和特异性决定其本身抗原性抗体的结构第十四页，共五十五页。​(

免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：

抗血清—多克隆抗体，是用提纯的抗原免疫动物后从动物血清制备得到的

单克隆抗体—是指由单个产生特异抗体的Ｂ淋巴细胞分化增殖形成的细胞克隆产生的抗体第十五页，共五十五页。​(

1免疫荧光技术

2免疫酶技术

3免疫亲和技术

4胶体金技术五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性

标记物

使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可的物质第十六页，共五十五页。​(

免疫荧光技术将荧光素作为标记物

使组织细胞中形成的抗原抗体复合

物在荧光显微镜下可见，从而显示

抗原物质的定位

（一）免疫荧光技术第十七页，共五十五页。​(

１.异硫氰酸荧光素２.四乙基罗达明３.四甲基异硫氰酸罗达明４.藻红蛋白

▲分子量不同▲最大吸收光谱不同

▲最大发射光谱不同▲与蛋白结合方式不同

▲呈现不同的荧光：黄绿色荧光

橙色荧光

橙红色荧光等

荧光素能产生荧光并能作为染料的一类化合物第十八页，共五十五页。​(

荧光：

在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失

荧光显微镜：荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）

使受检标本内的荧光物质发光第十九页，共五十五页。​(

是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位

（二）免疫酶技术第二十页，共五十五页。​(

1.反应产物定位准确，颜色对比清晰

2.反应后标本材料可长期保存

3.能用于电镜观察免疫酶技术优点：第二十一页，共五十五页。​(酶抗原一抗二抗酶标二抗酶—抗酶抗体复合物抗酶抗体第二十二页，共五十五页。​(酶标抗体法抗酶抗体法复合物法酶标记的三种形式第二十三页，共五十五页。​(

用交联剂将酶与抗体联接成酶标抗体用于直接法和间接法

酶标抗体法第二十四页，共五十五页。​(

用酶免疫动物获得抗酶抗体，通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接在一抗上,再加入酶及其底物，达到用酶标记抗原抗体反应的效果

由于产生抗酶抗体的动物与产生第一抗体的动物是同一种属，两种抗体具有相同的免疫源性，所以在反应中本来针对一抗的二抗也能与抗酶抗体结合抗酶抗体法或称酶桥法第二十五页，共五十五页。​(

先获得抗酶抗体并将抗酶抗体与酶一起预先制成酶－抗酶抗体复合物在反应中，由二抗的桥梁作用把复合物与一抗连接在一起最后加入底物，从而达到用酶标记抗原抗体反应的效果

优点:1、抗体活性高2、灵敏度高酶－抗酶抗体复合物法第二十六页，共五十五页。​(常用的标记酶：1.辣根过氧化物酶

2.碱性磷酸酶常用的两种方法是：（1）过氧化物酶标记抗体法（2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法

（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）

一抗与组织抗原特异结合二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起然后加入HRP的天然底物H2O2和捕捉底物DAB光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)１.辣根过氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）第二十七页，共五十五页。​(

２.碱性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）

碱性磷酸酶技术常用的两种方法：

(1)碱性磷酸酶标记抗体

(2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）

APAAP法的原理：以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等

常用于标记的酶：1.辣根过氧化物酶

2.碱性磷酸酶第二十八页，共五十五页。​(

利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子

亲和物质具有多价能力的物质，与亲和物质有高度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合最常用的亲和物质系统：1、生物素（biotin）与亲和素（avidin）两者结合能力为不可逆的

2、葡萄球菌A蛋白与免疫球蛋白IgG

（三）亲和细胞化学技术第二十九页，共五十五页。​(

(1)标记亲和素－生物素技术

（Labeledavidinbiotin,LAB）

(2)桥式亲和素－生物素技术

（Bridgedavidinbiotin,BAB）

(3)亲和素－生物素-酶复合物技术

（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系统标记技术的基本方法第三十页，共五十五页。​(生物素化酶生物素化抗体亲和素—生物素—酶复合物生物素亲和素第三十一页，共五十五页。​(

生物素与抗体共价偶联后加入与过氧化物酶（或荧光素）结合的亲和素利用生物素－亲和素之间的结合，间接显示组织细胞中的抗原

标记亲和素生物素法第三十二页，共五十五页。​(

利用亲和素为桥梁连接生物素化的抗

体和生物素化的酶桥式亲和素－生物素法第三十三页，共五十五页。​(

亲和素－生物素-酶复合物技术

亲和素与生物素偶联的过氧化物酶组合成亲和素－生物素－酶复合物

①特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合，

②生物素化抗体（二抗）再与一抗结合

③复合物与生物素化抗体结合①→③→②→第三十四页，共五十五页。​(葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)

◆是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白简称为A蛋白或蛋白A

◆

SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG呈非特异性结合又能与标记物结合

经标记的SPA可代替相应标记的二抗2.葡萄球菌A蛋白与IgG系统亲和素第三十五页，共五十五页。​(（四）免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以光镜和电镜下都可见的胶体金作为抗体或Ａ蛋白的标记物，间接显示组织细胞中特异分子的技术

胶体金颗粒大小一般在5--60nm第三十六页，共五十五页。​(

胶体金颗粒表面带负电荷，蛋白质表面带正电荷，蛋白质在等电点或偏碱时被吸附于金颗粒表面,形成一个蛋白层阻止了金颗粒的相互接触，使免疫金处于稳定状态胶体金对蛋白质的标记:胶体金A蛋白第三十七页，共五十五页。​(

1.免疫金法※(ImmunogoldstainingIGS)

2.免疫金银法（Immunogoldsilverstaining,IGSS)

3.彩色免疫金银法（ColouredIGSS,CIGSS）免疫胶体金技术常用方法第三十八页，共五十五页。​(免疫金法

一抗与抗原结合金标抗体或金标A蛋作为二抗与抗原抗体复合物结合抗原抗体反应部位在光镜下呈现红色，在电镜下呈高电子密度第三十九页，共五十五页。​(

1、采用不同大小的金颗粒(通常5-20nm)标记不同抗体或A蛋白，达到双重甚至多

重标记定位多种抗原的目的2、金颗粒便于计数，可对反应作定量分析

3、可用于透射、扫描电镜和冷冻蚀刻标本可将结果与光镜免疫金技术结果进行对照

免疫交体金体金优点：第四十页，共五十五页。​(

免疫细胞化学技术是在原位检测细胞中抗原

基本过程:抗原固定↓抗原与抗体结合反应↓标记系统反应

第二节免疫细胞化学方法第四十一页，共五十五页。​(

一、样品制备

二、抗体准备

三、基本实验过程

四、一些关键问题第四十二页，共五十五页。​(固定光镜醛类固定,常规石蜡包埋和切片

(冷冻切片→化学固定→免疫细胞化学反应)电镜4％多聚甲醛为首选固定剂

(多聚甲醛混合0.05-0.5%戊二醛)

包埋前技术免疫细胞化学反应在未经包埋的组织片上进行包埋后技术免疫细胞化学反应在超薄切片上进行

一、样品制备第四十三页，共五十五页。​(

抗体制备：特异抗体主要从购买获得

(也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体)

抗体标记:直接法对每种一抗进行标记，很少用

间接法对二抗进行标记(标记二抗使用十分普遍)标记抗体的方法：1.荧光素标记抗体方法2.酶标记抗体3.生物素化抗体4.胶体金标记抗体或A蛋白

二、抗体准备第四十四页，共五十五页。​(免疫细胞化学方法有:直接法、间接法间接法中有:二抗、三抗或复合物

标记系统有:荧光素、酶、亲和素胶体金观察方法有:荧光显微镜、普通光镜、电镜三、基本实验过程第四十五页，共五十五页。​(切片,丙酮固定，石蜡切片脱蜡复水

1%H2O2/甲醇阻断内源性过氧化物酶正常羊血清(二抗的正常血清)1:20室温封闭适当稀释一抗(兔抗体)孵育适当稀释二抗(羊抗体)孵育适当稀释兔PAP复合物孵育

0.04%DAB+0.03%H2O2

显色，充分水洗终止反应苏木素衬染,封片光镜观察棕褐色阳性反应沉淀物

过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（PAP法）第四十六页，共五十五页。​(80nm左右厚度超薄切片置于镍网上

1-10%H2O2蚀刻

1%BSA室温封闭适当稀释一抗孵育室温

1%BSA室温封闭适当稀释的10-20nm金标A含2%戊二醛/3%多聚甲醛固定铀、铅染色电镜观察高电子密度的金颗粒

电镜包埋后胶体金细胞化学反应第四十七页，共五十五页。​(

(一)样品固定：抗原和结构的保存

(二)抗体、标记物以及方法选择：单抗、多抗种属关系

(三)通透处理：蛋白酶、表面活性剂

(四)对照设定：阴性、阳性、自身对照

(五)非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释阻断

四、一些关键问题第四十八页，共五十五页。​(第六章重点

一、免疫细胞化学反应原理

把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下的可见标记物(或标记抗原抗体复合物)标记特异抗体,使特异的免疫化学反应具有可见性从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的第四十九页，共五十五页。​(二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法

直接法：组织抗原直接与标记的特异抗体反应

间接法：抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应

第五十页，共五十五页。​(三、何谓标记物，包括哪几种？标记物：使抗体或抗原抗体复合物在