微生物检验专题知识讲座

微生物检验专题知识讲座微生物检验专题知识讲座第1页主要内容第一节核酸探针技术检测食品微生物（第六章p108）第二节PCR技术检测食品微生物（第七章p121）第三节环介导等温扩增技术检测食品微生物（第八章p161）第四节基因芯片技术检测食品微生物（第九章p172）微生物检验专题知识讲座第2页第一节核酸探针技术检测食品微生物一、探针定义定义：探针(probe)，是指与特定靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊方法探知分子。类型：抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体

核酸探针：是指带有标识物已知序列核酸片段，它能和与其互补核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列检测。

微生物检验专题知识讲座第3页二、核酸探针工作原理

两条碱基互补DNA链在适当条件下按碱基配对标准形成杂交DNA分子。依据DNA遗传序列相对稳定性和互补标准，用已知特异碱基序列作成有标识一小段单链(或核苷酸序列)与被检测材料进行分子杂交。假如被检测材料中病原遗传序列与探针含有互补碱基序列，就会形成杂交双链，从而证实它们之间含有一定程度同源性。（p108）微生物检验专题知识讲座第4页微生物检验专题知识讲座第5页三、核酸探针种类（一）按起源及性质划分1.基因组DNA探针2.cDNA探针3.RNA探针4.寡核苷酸探针（二）按标识物划分1.放射性标识探针：用放射性同位素做为标识物2.非放射性标识探针：生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。微生物检验专题知识讲座第6页四、核酸探针制备方法（略p109）（一）探针制备要求：长度普通以50~300bp为宜。制备方法：

(1)DNA重组技术

(2)PCR扩增

(3)化学合成微生物检验专题知识讲座第7页四、核酸探针制备方法（二）核酸探针标识方法（略p109）1.核酸探针放射性同位素标识（1）缺口平移法（2）末端标识法（3）应用特异单引物法标识DNA探针2.核酸探针非放射性标识法

（1）核酸探针生物素标识（2）核酸探针地高辛标识（3）核酸探针光敏DNP标识（4）核酸探针三硝基苯磺酸（TNBS）标识（5）核酸探针辣根过氧化物酶标识微生物检验专题知识讲座第8页四、核酸探针制备方法理想标识物（核酸探针）应满足：(1)标识前后探针基础结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好；(3)操作简单、节时；(4)安全、无环境污染。微生物检验专题知识讲座第9页五、核酸探针杂交方法分子杂交：把亲源关系较近，不一样生物个体起源变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。应用：(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷贝数及表示丰度。微生物检验专题知识讲座第10页微生物检验专题知识讲座第11页杂交类型（1）按杂交对象：DNA-DNARNA-DNA（2）按作用环境：固相杂交：是将参加反应一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸（标识探针）游离在溶液中。液相杂交：所参加反应两条核酸链都游离在溶液中微生物检验专题知识讲座第12页（一）印迹杂交基础过程：第一，经过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上；第二，用标识探针与支持物上核酸片段进行杂交；第三，杂交信号检测。主要类型：斑点印迹杂交(Dot-blot)Southern印迹(Southernblot)Northern印迹(Northernblot)微生物检验专题知识讲座第13页1.Southern印迹法Southern印迹法(Southernblotting)是最早DNA探针杂交技术，1975年，由英国分子生物学家E.M.Southern所创造。就是将凝胶上DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜上后，在进行杂交。被检测对象为DNA

微生物检验专题知识讲座第14页

Southern印迹操作方法有三种①毛细管转移(或虹吸印迹)

进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。②电转移利用电场电泳作用将凝胶中DNA转移到固相支持物上，可到达简单、快速、高效目标。③真空印迹法利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层容器抽到下层，凝胶中核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面固相支持物上。微生物检验专题知识讲座第15页微生物检验专题知识讲座第16页2.Northern印迹法Northern（Northernblotting）印迹杂交技术是1979年，J.C.Alwine发展出来一个新方法检测目标RNA存在是否及含量。是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上过程

微生物检验专题知识讲座第17页Northern印迹方法与Southern印迹基础相同，可参考进行。但RNA变性方法与DNA不一样。DNA样品可先经过凝胶电泳进行分离，再用碱处理凝胶使DNA变性。而RNA不能用碱变性,因为碱会造成RNA水解。所以，在Northern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链分布在凝胶上，再进行印迹转移。微生物检验专题知识讲座第18页3.斑点杂交将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢靠结合在膜上，通常还将点样后膜进行80℃真空烘烤2h。特点：可在一张膜上同时进行多个样品检测，操作简便、快速，在临床诊疗中应用较广。适用范围：特定基因定性及定量研究，微生物检验专题知识讲座第19页（二）原位杂交用探针对细胞或组织切片中核酸杂交并进行检测方法称之为核酸原位杂交特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定细胞代替纯化核酸，然后将载玻片浸入溶有探针溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。微生物检验专题知识讲座第20页检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系1.待检菌株DNA双链2.用碱或热变性使双链解开 （DNA变性）3.将单链DNA在硝酸纤维素膜上固定

4.加放射性标识DNA或RNA5.保温（普通是66℃，24h）进行互补碱基配对（杂交）6.用缓冲溶液洗脱未杂交个别7.测定膜放射性，计算杂交率微生物检验专题知识讲座第21页关键：固定、冲洗。杂交率=

标识参考菌株DNA与待测菌株DNA杂交分子放射性计数×100%

标识参考菌株DNA与未标识参考菌株DNA杂交分子放射性计数微生物检验专题知识讲座第22页（三）结果判断：杂交率＞75%，高重组表示两分子差异小。杂交率＜25%，低重组表示两分子不相关杂交率＞60%，认为是同一个种杂交率60~70%，是同一个种中不一样亚种杂交率70%，以上是同一亚种不一样菌株杂交率20%以下，应考虑是不一样属菌株微生物检验专题知识讲座第23页DNA-DNA主要判别同一科中种属间菌株DNA-RNA主要判别不一样科菌株，因其DNA-DNA杂交率=0微生物检验专题知识讲座第24页金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌能产生各种与毒力和致病力相关毒素和酶,其中由nuc基因编码耐热核酸酶（Thermostablenuclease,Thermonuclease),不但为金黄色葡萄球菌所特有,而且在不一样菌株之间含有较高保守性[5]。可依据已经发表金黄色葡萄球菌耐热核酸酶ｎｕｃ基因序列设计引物,用ＰＣＲ技术从金黄色葡萄球菌菌株中扩增ｎｕｃ基因特异片段,经生物素标识作为核酸探针,建立了斑点杂交试验,能够从试验动物及其组织中快速、敏感、特异地检测出金黄色葡萄球菌。微生物检验专题知识讲座第25页探针检测技术中存在问题1.存在假阳性和假阴性问题。2.DNA探针还不能完全取得常规检验提供细菌特征信息，3.检测食品时，样品中待检菌量低杂质成份复杂，样品DNA纯度不够高等都会限制探针检测敏感性。4.不能检测基因序列表示产物，所以在评价食品安全卫生上存在一定不足。微生物检验专题知识讲座第26页六、分子信标技术检测微生物

1996年Tyagi和Kramer报道了一个含有发夹结构新型荧光核酸探针——分子信标(molecularbeacon)。微生物检验专题知识讲座第27页（一）基础原理

分子信标技术是基于荧光共振能量转移(ＦＲＥＴ)设计一段与特定核酸互补寡聚核苷酸探针，空间结构上呈茎环结构，其中环序列是与靶核酸互补探针；茎一端连接上一个荧光分子，另一端连上一个淬灭分子。当靶序列不存在时,分子信标呈茎环结构,茎部荧光分子与淬灭分子非常靠近(7～10ｎｍ)，可发生ＦＲＥＴ，即荧光分子发出荧光被淬灭分子吸收并以热形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标环序列与靶序列特异性结合，形成稳定双链体比分子信标茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，此时荧光分子发出荧光不能被淬灭分子吸收，可检测到荧光。微生物检验专题知识讲座第28页（二）分子信标结构

(1)环状区，普通为长度15～30碱基序列，能与目标分子特异结合；(2)信标茎干区，通常为长度5～8碱基互补序列，茎干区与杂交后环状区-目标分子双链结构之间热力学平衡关系，使分子信标杂交特异性显著高于常规线状探针；(3)荧光基团和猝灭基团，荧光基团普通联接在信标分子5’-端；微生物检验专题知识讲座第29页（三）分子信标检测特点

1.能够进行液相杂交检测2.有效消除核酸交叉污染3.可进行核酸实时检测4.特异性强5.灵敏度高6.可实现核酸大规模自动化检测7.可对活体内核酸动态进行检测微生物检验专题知识讲座第30页应用

分子信标用于核酸检测分析1.实时定量PCR测定靶标浓度2.分子信标用于活体内核酸动态检测3.利用多色分子信标对多个靶核苷酸同时定量检测4.分子信标用于检测双链DNA

分子信标用于研究DNA-蛋白质相互作用1分子信标用于核酸酶研究2.分子信标用于非特异性单链DNA结合蛋白研究3.分子信标用于蛋白质直接检测依据分子信标原理,NobukoHama分子信标用作生物芯片和生物传感器探针利用

微生物检验专题知识讲座第31页第二节PCR技术检测微生物微生物检验专题知识讲座第32页一、PCR反应基础原理

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)就是模板DNA、引物以及四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化作用下所发生酶促聚合反应，PCR反应是由变性--退火--延伸三个基础反应步骤组成。微生物检验专题知识讲座第33页PCR技术简史DNA复制核酸体外扩增构想聚合酶链反应创造1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与适当引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不停重复该过程便可克隆tRNA基因。但因为测序和引物合成困难，以及70年代基因工程技术创造使克隆基因成为可能，所以，Khorana构想被大家遗忘了……微生物检验专题知识讲座第34页（一）PCR技术简史DNA复制核酸体外扩增构想聚合酶链反应创造1985年，美国PE-Cetus企业Mullis等人创造了聚合酶链反应（PCR）基础原理是在试管中模拟细胞内DNA复制最初采取E-coliDNA聚合酶进行PCR，因为该酶不耐热，使这一过程耗时，费劲，且易犯错耐热DNA聚合酶应用使得PCR能高效率进行，随即PE-Cetus企业推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等所以项技术获诺贝尔化学奖微生物检验专题知识讲座第35页（二）PCR基础原理PCR反应条件PCR过程PCR特点标准PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L微生物检验专题知识讲座第36页基础步骤1、变性(Denaturation)模板双链DNA加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成DNA双链两条链碱基对之间氢键破裂，双螺旋解开，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备,这一过程咱们称之为变性。微生物检验专题知识讲座第37页2、退火(Annealing)模板DNA经加热变性成单链后，当温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；咱们把这一过程称之为退火。微生物检验专题知识讲座第38页3、延伸(Extension)在适宜温度下，DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，发生酶促聚合反应，咱们把这一过程称之为延伸。延伸时是按照碱基互补配正确标准与，从而合成了一条新与模板DNA链互补半保留复制链。微生物检验专题知识讲座第39页所以重复循环变性--退火--延伸这三个过程，就可取得更多“半保留复制链”，而且这些新合成链又能够成为下次循环模板。PCR反应最终结果是，经过n次循环之后，反应混合物中所含有双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间DNA区段拷贝数，在理论上最高值应该是2n。而每完成一次循环大约需要2～4分钟，所以，2～3小时就能将待扩增目标基因扩增放大几百万倍。微生物检验专题知识讲座第40页微生物检验专题知识讲座第41页（三）PCR特点PR反应条件PCR过程PCR特点特异性强

1.引物与模板DNA特异、正确结合；

2.碱基配对标准；（A和T,G和C配对）

3.TaqDNA聚合酶合成反应忠实性；

4.靶基因特异性与保守性。灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测灵敏度可达3个RFU细菌检测最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物普通用电泳分析微生物检验专题知识讲座第42页（三）PCR特点PR反应条件PCR过程PCR特点能够扩增RNA或cDNA

用一小段寡核苷酸引物和逆转录酶将mRNA逆转录成主链cDNA，再将得到cDNA进行PCR扩增对标本纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织粗提DNAPCR技术含有一定程度错误渗透

核苷酸错误渗透几率大约是每2×109个核苷酸中错误渗透一个核苷酸微生物检验专题知识讲座第43页PCR反应应用1、在法医判定上应用；2、在亲子判定上应用；3、在古生物学中应用；4、在生态学研究中应用；

5、在食品中有害微生物检测应用微生物检验专题知识讲座第44页二、PCR反应体系一个标准PCR反应反应体系为：10×扩增缓冲液10uL

4种dNTP混合物200umol/L

引物1umol/L模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至100uLPCR反应体系五个要素：PCR扩增所需引物（primer）、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）、4种dNTP混合物（dNTPs）（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、模板（template）和缓冲液。

微生物检验专题知识讲座第45页（一）引物PCR扩增引物是指与待扩增靶DNA区段两端序列互补人工合成寡核苷酸短片段。包含正向引物（ForwardPrimer）和反向引物（BackwardPrimer/ReversePrimer）。（1）引物设计软件和引物合成能够在线设计引物，比如etPrimer；也能够使用PrimerPremier5.0和Oligo6.22、DNAMAN等设计软件。设计好引物则完全由专业引物合成企业来进行合成。微生物检验专题知识讲座第46页（2）引物设计标准1）引物长度（primerlength）2）产物长度（productlength）3）引物及产物GC含量（composition）4）序列Tm值(meltingtemperature)5）ΔG值(internalstability)6）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）7）错误引发位点（falseprimingsite）8）对引物进行修饰，比如在引物5’末端添加限制性酶切位点9）有时候，在设计引物时仅了解有限序列信息。比如仅知道氨基酸序列，这时咱们能够设计简并引物。10)引物特异性：设计好引物应该含有很好特异性即设计出引物应与核酸序列数据库中其它序列无显著同源性。微生物检验专题知识讲座第47页（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶发觉是促进ＰＣＲ反应自动化一个关键原因。在PCR反应体系中用热稳定性TaqDNA聚合酶代替DNA聚合酶ＩKlenow大片段当前主要有两种TaqDNA聚合酶供给，一个是从栖热水生杆菌中分离提纯天然酶，另一个是大肠杆菌合成基因工程酶。催化一个经典PCR反应，普通加入酶量为2-4U，通常约需加入酶量为2.5U(指总反应体系体积为100ul时)，微生物检验专题知识讲座第48页（三）dNTPPCR反应体系中需要4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）包含：脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧胞苷三磷酸（dCTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧核糖胸腺嘧啶三磷酸（dTTP）。它们提供靶DNA序列扩增原料。在PCR反应中，dNTPs浓度普通为50～200umol/L，高浓度dNTPs会对扩增反应起抑制作用，浓度过低又会降低PCR产物产量。需要注意是4种dNTP浓度要相等(等摩尔配制)。微生物检验专题知识讲座第49页（四）缓冲液

在PCR反应体系中，普通提议用10-50mmol/LTris-HCL作为缓冲液（20℃时，pH值为8.3-8.8）。反应体系中镁离子（Mg2+）浓度对PCR反应影响：影响DNA聚合酶活性；影响引物退火普通来说，当游离镁离子浓度较高时，能够增加PCR反应产量，不过同时也会增加非特异性扩增几率，降低PCR反应特异性；反之，当游离镁离子浓度较低时，会降低PCR反应产量。微生物检验专题知识讲座第50页（五）模板模板制备是PCR反应起始步骤几个常见纯化方法(1).浓盐法利用RNP（核糖核蛋白）和DNP（脱氧核糖核蛋白）在电解溶液中溶解度不一样，将二者分离，微生物检验专题知识讲座第51页（2）.阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,能够直接从生物材料中提取DNA.因为细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常见阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase降解作用.用苯酚处理匀浆液时,因为蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相同相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，屡次重复操作，再合并含DNA水相，利用核酸不溶于醇性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法特点是使提取DNA保持天然状态.（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后搜集上清液.在上清中加入固体氯化钠调整至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,马上用搅拌法搅出.然后分别用66%٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最终在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取DNA中蛋白质含量较高,故普通不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.微生物检验专题知识讲座第52页三、PCR反应参数（一）变性经典变性条件是在95℃温度下30s。变性步骤应该高温、短时。假如变性温度过高、时间过长，会加紧DNA聚合酶失活；变性温度很低，会造成解链不完全。

微生物检验专题知识讲座第53页（二）退火

温度快速冷却至40℃～60℃，双链模板DNA或经PCR扩增形成双链DNA经加热变性成为单链后，引物与单链模板DNA互补序列配对结合引物长度、碱基组成及其在反应体系中浓度决定了引物退火时间与温度，靶基因序列长度也与退火温度与时间相关。复性时间30～60秒足以使引物与模板之间完全结合。普通退火温度设定比扩增引物熔解温度（Tm值）低5℃左右。选择较高退火温度会大大降低引物二聚体和引物和模板间非特异性结合。微生物检验专题知识讲座第54页（三）延伸引物延伸温度取决于DNA聚合酶最适温度。。PCR反应延伸温度普通选择在70～75℃之间，常见温度为72℃，此靠近于TaqDNA聚合酶最适反应温度75℃。延伸反应时间则取决于待扩增片段长度、浓度和延伸温度。延伸反应时间则取决于待扩增片段长度、浓度和延伸温度。延伸时间越长，非特异性扩增带出现机率就越大。微生物检验专题知识讲座第55页（四）PCR循环次数PCR反应扩增程度由循环次数决定。当PCR反应其它各项参数都确定之后,PCR反应循环次数主要取决于模板DNA起始浓度。靶分子数适宜循环次数3×10525-301.5×10430-351×10335-405040-45微生物检验专题知识讲座第56页普通而言，PCR适宜循环次数为25-30轮。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性扩增产物大量增加；循环次数过少，会降低PCR扩增产量。微生物检验专题知识讲座第57页四、PCR扩增产物判定（一）琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射出荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中溴化乙锭（EB）就会插入到DNA分子中形成荧光络合物，从而使DNA分子发射荧光比最初增强了好几倍。因为DNA分子发射荧光强度和样品中DNA含量是成正比，所以当用已知浓度标准样品作为琼脂糖凝胶电泳对照时，就能够比较出待测样品浓度。微生物检验专题知识讲座第58页汇报结果依据引物位置可知目标扩增产物大小为279bp，所以咱们能够依据PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上是否形成279bp条带来判断扩增是否发生。假如PCR扩增产物在琼脂糖凝胶279bp位置有条带，证实乳品中有金黄色葡萄球菌存在。（以下列图）图中最右边为DNAMarkerDL，然后从右往左依次为阳性对照。阴性对照和扩增产物。假如PCR扩增产物在琼脂糖凝胶279bp位置处没有形成条带，就证实检测乳品中不存在金黄色葡萄球菌。←279bp微生物检验专题知识讲座第59页（二）免疫检测

免疫检测方法是一个ELISA方法，它能快速、灵敏和特异地检测PCR产物。基础原理：SHARP信号系统是指首先用一个用生物素修饰引物和一个非修饰引物进行PCR扩增。扩增结束后，让一个别反应混合物在变性剂作用下先变性，然后在溶液中加入能与之互补配正确非标识RNA探针进行杂交，得到RNA：DNA杂合体。然后用捕捉板对生物素化RNA：DNA杂合体进行捕捉。最终用对生物素化RNA：DNA杂合体特异结合碱性磷酸酯酶抗体进行检测，读取在405nm时吸光度。微生物检验专题知识讲座第60页准备探针混合物↓取50μl样品稀释液加到杂交管中↓在每个杂交管中加入25μl变性剂↓取5μl样品或对照加到每个管中，1000r/min摇30秒↓室温孵育10分钟↓取25μl探针混合物加到每个管中↓室温摇30秒↓65℃水浴温育30分钟↓从杂交管转移到捕捉板微孔中↓捕捉板在25℃摇30分钟（准备洗涤缓冲液）↓倒掉捕捉板中液体并用吸水纸吸干，然后在每个微孔中加100μl检测试剂↓盖上捕捉板，并在25℃摇30分钟↓倒掉捕捉板中液体，并用洗涤缓冲液冲洗捕捉板5次，再用去离子水冲洗捕捉板1次↓在捕捉板每个微孔中加100μl底物，盖上捕捉板，并在37℃孵育1小时↓在405nm读取吸光度图7-5SHARP信号系统检测基础步骤微生物检验专题知识讲座第61页1）不对称PCR

目标：扩增产生特异长度单链DNA。方法：采取两种不一样浓度引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最正确百分比普通是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物绝对量。用途：制备核酸序列测定模板制备杂交探针基因组DNA结构功效研究PCR种类微生物检验专题知识讲座第62页2)反向PCR(reversePCR)

是用反向互补引物来扩增两引物以外DNA片段对某个已知DNA片段两侧未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段序列；用于仅知个别序列全长cDNA克隆,扩增基因文库插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列PCR种类微生物检验专题知识讲座第63页3）多重PCR用于检测特定基因序列存在或缺失。电泳引物微生物检验专题知识讲座第64页4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标识，用以直观地检测目标基因。尤其适合大量临床标本基因诊疗可同时检测各种基因成份病毒1病毒2病毒3病毒4微生物检验专题知识讲座第65页7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶链式反应（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整细胞作为一个微小反应体系来扩增细胞内目标片段，在不破坏细胞前提下，利用一些特定检测伎俩来检测细胞内扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适合用于检测病理切片中含量较少靶序列微生物检验专题知识讲座第66页8）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增微生物检验专题知识讲座第67页实时PCR技术原理微生物检验专题知识讲座第68页应用PCR技术检测乳品中金黄色葡萄球菌试验器材及试剂1、试验器材：PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统2、试验试剂:10×PCRbuffer、dNTPs、TaKaRaTaq、DNAMarkerDL.溶葡萄球菌酶、无水乙醇、石油醚、氯仿、氨水、糖原、引物（正向引物5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’，反向引物5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’）。操作步骤利用PCR技术从乳品中直接检测金黄色葡萄球菌，其操作方法以下。微生物检验专题知识讲座第69页1、DNA模板制备详细步骤以下：（1）、将1ml无水乙醇、1ml氨水和1ml石油醚分别加入到5ml待检测乳品中，并混匀。（2）、混合物以12000×g，离心10min。弃去上清液，沉淀用300ul10mmo1L-1TE(pH7.8)溶解后，加入5ul10mg.ml-1溶葡萄球菌酶，37℃温育1h,期间不停猛烈振荡。然后加入50ul10%SDS,煮沸5min。（3）、将等体积氯仿加入上述混合液中，充分振荡混匀，17000×g离心10min，弃沉淀，保留上清液。(4)将上清液移入一新离心管中，用0.1倍体积2.5mo1.L-1乙酸铵(pH5.4)，2.5倍体积预冷无水乙醇和5ul10mg.ml-1糖原沉淀DNA,混合物17000×g，离心20min。DNA沉淀干燥后用100ul灭菌双蒸水溶解，备用。微生物检验专题知识讲座第70页2、配置反应体系总反应体系为50ul，其中包含5ul10×PCRbuffer、4uldNTPs混合物，0.5ul40umol正向引物，0.5ul40umol反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq，模板2ul，水37.75ul。微生物检验专题知识讲座第71页3、PCR扩增PCR扩增反应采取冷开启。94℃预变性4min，再按94℃1min→52℃0.5min→72℃1.5min进行35个循环，最终72℃延伸3.5min.4、PCR扩增产物检测取5ulPCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。微生物检验专题知识讲座第72页汇报结果依据引物位置可知目标扩增产物大小为279bp，所以咱们能够依据PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上是否形成279bp条带来判断扩增是否发生。假如PCR扩增产物在琼脂糖凝胶279bp位置有条带，证实乳品中有金黄色葡萄球菌存在。（以下列图）图中最右边为DNAMarkerDL，然后从右往左依次为阳性对照。阴性对照和扩增产物。假如PCR扩增产物在琼脂糖凝胶279bp位置处没有形成条带，就证实检测乳品中不存在金黄色葡萄球菌。←279bp微生物检验专题知识讲座第73页第三节环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediatedIsothermalAmplification，简称LAMP），是年由日本荣研株式会Notomi等人开发出来，该方法一经报道就受到各国学者广泛关注。我国对LAMP法研究起步相对较晚，~年，北京奶牛中心首次引用LAMP法进行牛胚胎性别判定。年新疆农业大学吴阳升等人应用LAMP法对牛胚胎性别进行判定。年广州中医药大学李青雅等人采取LAMP法检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）。微生物检验专题知识讲座第74页LAMP法特点1.不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA变性。只需要保持一个恒定温度就能扩增反应2.特异性强。LAMP反应是针对模板六个区段，设计四条引物，而且这六个区段次序也有要求。3、能够快速、高效地进行扩增4、灵敏度高，扩增模板可达10拷贝亦或更少。5、扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂基础上加上逆转录酶，就能够一步实现RNA扩增。6、判定简便。7、经济性强。微生物检验专题知识讲座第75页LAMP法引物四条引物分别是：引物FIP（ForwardInnerPrimer,正向内引物）：它是由F2区段（与靶基因3’端F2c区段完全互补）和F1c区段（与靶基因3’端F1c序列完全相同）组成。其中F2区段位于FIP3’端，而F1c区段位于FIP5’端。引物F3（ForwardouterPrimer,正向外引物）：它是由F3区段组成。（与靶基因3’端F3c区段完全互补）。引物BIP（BackwardInnerPrimer,反向内引物）：它是由B2区段（与靶基因3’端B2c区段完全互补）和B1c区段（与靶基因3’端B1c序列完全相同）组成。其中B2区段位于BIP3’端，而B1c区段位于BIP5’端。引物B3（BackwardouterPrimer,反向外引物）：它是由B3区段组成。（与靶基因3’端B3c区段完全互补）。

微生物检验专题知识讲座第76页LAMP法基础原理第一步：在65℃左右，模板DNA双链处于动态平衡状态，此时正向内引物FIPF2区段和目标序列上F2c互补配对，并在链置换型DNA聚合酶（BstDNApolymerase）作用下，以F2区段3’末端为起点，开启链置换DNA合成。微生物检验专题知识讲座第77页第二步：以正向内引物FIPF2区段3’端为起点，经过含有链置换活性DNA聚合酶作用，合成了模板DNA互补链。微生物检验专题知识讲座第78页第三步：正向外引物F3与目标序列F2c前端F3c序列互补，以F33’末端为起点，经过链置换型DNA聚合酶作用，一边置换先头由引物FIP合成DNA链，一边合成本身DNA链，如此向前延伸。微生物检验专题知识讲座第79页第四步：最终由引物F3合成DNA链与模板DNA形成双链。微生物检验专题知识讲座第80页第五步：由引物FIP先合成DNA链被引物F3进行链置换反应，从而产生一条单链，这条单链5’末端存在互补F1c和F1区段。微生物检验专题知识讲座第81页第六步：5’末端互补F1c和F1区段，会发生本身碱基互补配对，形成环状结构。同时，反向内引物BIP同该单链杂交结合，以引物BIPB2区段3’端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开，接着，类似于引物F3，反向外引物B3从引物BIP外侧插入，与B3c序列互补。微生物检验专题知识讲座第82页第七步：以B33’末端为起点，经过链置换型DNA聚合酶作用，一边置换先头由引物BIP合成DNA链，一边合成本身DNA链，如此向前延伸。最终由引物B3合成DNA链形成双链。微生物检验专题知识讲座第83页第八步：由引物BIP先合成DNA链被引物B3进行链置换反应，产生一条单链，这条单链DNA两端存在互补序列。本身发生碱基互补配对，形成环状结构，于是整条链展现哑铃状结构。该哑铃状结构是LAMP法核酸扩增起始结构。至此为止，以上全部步骤都是为了形成LAMP法核酸扩增起始结构。微生物检验专题知识讲座第84页第九步：以下是LAMP法核酸扩增循环：微生物检验专题知识讲座第85页LAMP法操作流程（1）反应体系配置；（2）扩增；（3）扩增产物检测。微生物检验专题知识讲座第86页微生物检验专题知识讲座第87页一个标准LAMP反应反应体系是：20MmTris-HCL(Ph=8.8)1.4mMdNTPs10mMKCL1.6μMFIP8mMMgSO41.6μMBIP10mM(NH4)2SO40.2μMF30.1%吐温200.2μMB30.8M甜菜碱模板DNA8UBstDNA聚合酶微生物检验专题知识讲座第88页LAMP反应过程LAMP反应在操作时候很简单，只需要将全部反应物混合好以后，先在60-65℃孵育，15-60分钟后，再在80℃孵育10分钟终止酶活，即可完成反应。微生物检验专题知识讲座第89页扩增产物检测1.肉眼观察法能够经过副产物焦磷酸镁沉淀产生来经过肉眼直接判断扩增反应是否发生。2.添加荧光染料法向反应体系中添加溴化乙锭（EB）、SYBRGreenI等荧光染料进行呈色，从而检测扩增反应是否发生。微生物检验专题知识讲座第90页微生物检验专题知识讲座第91页第三章基因芯片技术检测食品微生物一、生物芯片及其分类生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置排列固定于一个载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在量一个技术。微生物检验专题知识讲座第92页微生物检验专题知识讲座第93页微生物检验专题知识讲座第94页1，依据生物化学反应过程分为，及各种等、（1）用于样品制备生物芯片样品制备芯片目标是将通常需要在试验室进行多个操作步骤集成于微芯片上。实现生物大分子分离。（2）生化反应生物芯片生化反应芯片即在芯片上完成生物化学反应。它能够高效、快速地完成生物化学反应（3）检测用生物芯片用来检测生物样品一、生物芯片及其分类微生物检验专题知识讲座第95页2.依据功效和应用角度分为（1）DNA芯片（2）蛋白质芯片（3）芯片试验室为高度集成化集样品制备、基因扩增、核酸标识及检测为一体便携式生物分析系统，它最终目标是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成一、生物芯片及其分类微生物检验专题知识讲座第96页3.按基质材料分：尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠4.按检测生物信号分：核酸、蛋白质、生物组织碎片等5.按工作原理分：杂交型、合成型、连接型、亲和识别等一、生物芯片及其分类微生物检验专题知识讲座第97页（三）特点（1）

信息获取量大、效率高；（2）

生产成本低（3）

所需样本和试剂少（4）轻易实现自动化分析

微生物检验专题知识讲座第98页二、历史沿革1.生物芯片技术发展最初得益于（EdwinMellorSouthern）提出核酸杂交理论，