沉淀法去除杂质（等电点法）

药物分离与纯化技术课程

项目2药物分离纯化前的预处理技术

——沉淀法去除杂质（等电点法）大纲1.等电点沉淀法2.等电点沉淀法的操作3.等电点沉淀法操作注意事项1.等电点沉淀法

利用蛋白质在等电点时溶解度最低的特性，向含有目的药物成分的混合液中加入酸或碱，调整其pH值，使蛋白质沉淀析出的方法。一、等电点沉淀法蛋白质在溶液中存在如上平衡沉淀法去除杂质（等电点法）

等电点沉淀一般在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行，一般蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，可通过加入无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸等）调节pH值完成等电点沉淀。

等电点沉淀法一般多用于疏水性较大的蛋白质。

与盐析法相比，等电点沉淀法省去了后续的脱盐操作，当沉淀操作的pH值较低时，杂蛋白更容易变性，所以该方法仍是蛋白质初级分离的有效手段。沉淀法去除杂质（等电点法）2.等电点沉淀法原理在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。沉淀法去除杂质（等电点法）二、等电点沉淀法的操作

操作条件：低离子浓度pH=pI（等电点）。等电点沉淀操作需要低离子浓度下调整溶液的pH至等电点，或在等电点的pH下利用透析等方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。等电点沉淀操作中，多通过加入无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸等）调节pH。沉淀法去除杂质（等电点法）三、等电点沉淀法操作注意事项1．不同的蛋白质，具有不同的等电点。在生产过程中应根据分离要求，除去目的产物之外的杂蛋白；若目的产物也是蛋白质，且等电点较高时，可先除去低于等电点的杂蛋白。

如:细胞色素C的等电点为10.7，在细胞色素C的提取纯化过程中，调pH＝6.0除去酸性蛋白，调pH＝7.5～8.0，除去碱性蛋白。沉淀法去除杂质（等电点法）2．同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。

在盐溶液中，蛋白质若结合较多的阳离子，则等电点的pH值升高。如:胰岛素在水溶液中的等电点为5.3，在含一定浓锌盐的水—丙酮溶液中的等电点为6；如果改变锌盐的浓度，等电点也会改变。

蛋白质若结合较多的阴离子(如C1-、SO42-等)，则等电点移向较低的pH值，因为负电荷相对增多了，只有降低pH值才能达到等电点状态。沉淀法去除杂质（等电点法）3．目的药物成分对pH值的要求。

生产中应尽可能避免直接用强酸或强碱调节pH值，以免局部过酸或过碱，而引起目的药物成分蛋白或酶的变性。

另外，调节pH值所用的酸或碱应与原溶液中的盐或即将加入的盐相适应，如:溶液中含硫酸铵时，可用硫酸或氨水调pH值;原溶液中含有氯化钠时，可用盐酸或氢氧化钠调pH值。

应以尽量不增加新物质为原则。沉淀法去除杂质（等电点法）4．各种蛋白质在等电点时，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，而多数蛋白质的等电点都十分接近。当单独使用等点电沉淀法效果不理想时，可以考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。沉淀法去除杂质（等电点法）讨论：1.查找资料，