某大学细胞凋亡与疾病医疗管理知识

第四章细胞凋亡与疾病湖南中医药大学葛金文

细胞是组成机体的基本单位，其生命过程包括增殖、分化和凋亡。细胞通过分裂增加细胞的数量；通过分化形成在形态和功能上各异的细胞,组成不同的组织和器官；通过凋亡确保胚胎正常发育和内环境稳定。因此，细胞增殖、分化和凋亡都是主动而有序的生命过程，任何一个环节发生变化均可引起疾病。长期以来，生命科学的研究重点是细胞的增殖与分化，即细胞如何“活”的问题。20世纪90年代以来，对细胞凋亡的研究成为生命科学的重要课题，即研究细胞如何“死”的问题。细胞凋亡与疾病引言一、细胞凋亡的概念及其生物学意义二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征三、细胞凋亡的调控机制四、细胞凋亡检测技术五、细胞凋亡与疾病内容细胞凋亡与疾病一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病细胞丢失生理性死亡凋亡（apoptosis）病理性死亡坏死(necrosis)死亡细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。

排出一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡的研究历史

1951年GluckmannA和他的伙伴们首次介绍了程序性细胞死亡(programmedcelldeath)在胚胎发育中的重要性，他们证实了死亡是所有组织和器官发育的不可或缺的整合部分(GluckmannA.Celldeathsinnormalvertebrateontogeny.BiolRev.1951;26:59-86)。1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎症反应。1．凋亡的发现及概念形成KerrJFR,WyllieAH,CurrieAR.Apoptosis:abasicphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics.BrJCancer.1972;26:239-257.

一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡的研究历史

2．凋亡的形态学及生物化学研究（1972-1997）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。

蛋白质水解酶活化的研究。

钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。

细胞膜的变化。

一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡的研究历史

1)相关基因及调控2）信号转导3）各种分子及其相互作用及相互关系3．线粒体的变化及分子生物学研究（1998-）一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡的研究历史

疾病机制的研究以及新疗法的探索及问世4．临床应用研究阶段（2000-）一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡的研究历史

一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡的研究历史

1995年至2007年4月CNKI收录以凋亡为主题词的论文篇数一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（二）细胞凋亡的定义

细胞凋亡(apoptosis),apoptosis来源于希腊词,意指花瓣或树叶的脱落、凋零，强调这一过程是一种自然的生理过程。因此细胞凋亡可以定义为由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程。程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)一词最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。现在,细胞凋亡和程序性细胞死亡作为同义词在学术界并用。（三）细胞凋亡与细胞坏死的区别

细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激，非随机发生强烈刺激，随机发生受累范围单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减少、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片DNA有控降解随机降解生化特点主动过程,有新蛋白合成,耗能被动过程,无新蛋白合成,不耗能基因调控有无后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理/病理死亡方式病理死亡方式NECROSISAPOPTOSISChromatinclumpingSwollenorganellesFlocculentmitochondria

MildconvolutionChromatincompactionandsegregationCondensationofcytoplasm

DisintegrationReleaseofintracellularcontentsInflammationNuclearfragmentationBlebbingApoptoticbodiesPhagocytosisApoptoticbodyPhagocyticcell一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病（四）细胞凋亡的生物学意义

确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能

细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡可能会引起疾病发生。因此，对于细胞凋亡的研究，已成为医学科学界的关注热点。一、细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡与疾病例如蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡与疾病（一）形态学特征（1）凋亡的起始：微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线粒体大体完整，染色质固缩；（2）细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；（3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围；（4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡与疾病（一）形态学特征二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡与疾病（二）生化特征胞浆内Ca2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性变大。DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp为基数的有序片段。Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带细胞凋三亡的一三个显著三特点是三细胞染三色体的三DNA三降解，三这是一三个较普三遍的现三象。这三种降解三非常特三异并有三规律，三所产生三的不同三长度的三DNA三片段约三为18三0-2三00b三p的整三倍数，三而这正三好是缠三绕组蛋三白寡聚三体的长三度，提三示染色三体DN三A恰好三是在核三小体与三核小体三的连接三部位被三切断，三产生不三同长度三的寡聚三核小体三片段，三实验证三明，这三种DN三A的有三控降解三是一种三内源性三核酸内三切酶作三用的结三果，该三酶在核三小体连三接部位三切断染三色体D三NA，三这种降三解表现三在琼脂三糖凝胶三电泳中三就呈现三特异的三梯状L三add三er图三谱，而三坏死呈三弥漫的三连续图三谱。典型凋三亡细胞三DNA三琼脂糖凝胶电三泳（呈三现梯状三条带）三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病（一）三细胞凋三亡的步三骤：接受凋三亡信号凋亡调三控分子三间的相三互作用蛋白水三解酶的三活化（三Cas三pas三e）进入连三续反应三过程三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病（二）三凋亡的三启动阶三段细胞凋三亡的启三动是细三胞在感三受到相三应的信三号刺激三后胞内三一系列三控制开三关的开三启或关三闭，不三同的外三界因素三启动凋三亡的方三式不同三，所引三起的信三号转导三也不相三同，客三观上说三对细胞三凋亡过三程中信三号传递三系统的三认识还三是不全三面的，三目前比三较清楚三的通路三主要有三：◆细胞凋三亡的膜三受体通三路◆细胞色三素C释三放和C三asp三ase三s激活三的生物三化学途三经（线粒三体通路三）◆细胞核三途径三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病参与死三亡受体三信号转三导的接三头蛋白(死亡结三构域蛋三白de三ath三do三mai三np三rot三ein三）TRA三DD：TNF三受体相三关死亡三结构域三蛋白TNF三+TN三FRI三（死亡三结构域三）+三TRA三DD—三细胞凋三亡FAD三D：Fas三相关死三亡结构三域蛋白三(Fas三-as三soc三iat三ed三dea三th三dom三ain）Fas三L+F三as三（死亡三结构域三）+三FAD三D—三细胞凋三亡RIP三：受体相三互作用三蛋白CRA三DD：含有死三亡结构三域的c三asp三ase三和RI三P接头三蛋白MAD三D：活化M三AP激三酶的死三亡结构三域蛋白细胞凋三亡与疾三病细胞凋三亡的两三条通路三：膜受三体通路三、线粒三体通路Fas三L（C三D95三）/F三as、TNF三/TN三FRTRA三IL/三TRA三ILR肿瘤坏三死因子三相关凋三亡诱导三配体（三TNF三-re三lat三ed三apo三pto三sis三in三duc三ing三li三gan三d，T三RAI三L），三或称凋三亡素2三配体（三Apo三2li三gan三d，A三po2三L）是三肿瘤坏三死因子三（Tu三mou三rn三ecr三osi三sf三act三or，三TNF三）家族三的成员三。三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病Caspase-3活化凋亡诱导因素死亡受体/配体的表达、结合Caspase-8活化apoptosisBid活化线粒体通路活化1.三膜受三体通路三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病目前发三现的受三体/配三体系统凋亡是三一种细三胞自杀三机制，三它可以三使复细三胞动物三在组织三中控制三细胞数三量并清三除威胁三到动物三生存的三个别细三胞。这三种细胞三表面拥三有特殊三传感器三，称死三亡受体三（de三ath三re三cep三tor三，DR三）。死三亡受体三与其相三应的配三体结合三，能够三检测到三死亡信三号，从三而快速三启动细三胞内的三凋亡装三置。目前已三知的配三体/受三体系统三主要有三三个:Fas三L/F三as、TNF三/TN三FR及TRA三IL/三TRA三ILR。其中三TRA三IL/三TRA三ILR三是近年三颇受瞩三目的一三种凋亡三诱导系三统。三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病2.三线粒三体通路1994年首次提出线粒体在细胞凋亡中是不可缺少的Newmeyer,etal.1996年线粒体中细胞色素C的释放引起细胞凋亡Liu,etal1997年证明Caspase-9在细胞色素C和dATP存在时与Apaf-1结合并被激活，再激活Caspase-3Li,etal1998年膜死亡受体通路通过Bid作用于线粒体信号通路Luo,etal1999年线粒体释放Caspase-2,9参与凋亡的发生线粒体释放AIF参与凋亡的发生SusinSA,etal2000年线粒体释放Smac/DIABLO参与凋亡发生Du,etal.Verhagen,etal2001年线粒体释放核酸内切酶G引起“DNAladder”的产生线粒体释放Smac样的丝氨酸蛋白水解酶HtrA2/Omi，后者通过抑制IAP促进细胞凋亡Li,etalSuzuki,etal细胞凋三亡线粒三体信号三通路研三究中的三重要发三现凋亡诱三导因素PTP三开放线粒体三中细胞三色素C三等释放Cas三pas三e-9三活化Cas三pas三e-3三活化apo三pto三sis三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病（三）三凋亡的三执行阶三段尽管凋三亡过程三的详细三机制尚三不完全三清楚，三但是已三经确定三Cas三pas三e即半三胱天冬三蛋白酶三在凋亡三过程中三是起着三必不可三少的作三用，细三胞凋亡三的过程三实际上三是Ca三spa三se不三可逆有三限水解三底物的三级联放三大反应三过程，三到目前三为止，三至少已三有14三种Ca三spa三se被三发现，三Cas三pas三e分子三间的同三源性很三高，结三构相似三，都是三半胱氨三酸家族三蛋白酶三，根据三功能可三把C三asp三ase三基本分三为二类三：一类三参与细三胞的加三工，如三Pro三-IL三-1β三和Pr三o-I三L-1三δ，形三成有活三性的I三L-1三β和I三L-1三δ；第三二类参三与细胞三凋亡三。参与三诱导凋三亡的C三asp三ase三分成两三大类：启动酶（in三iti三tao三r）和效应酶（ef三fec三tor三）它们三分别在三死亡信三号转导三的上游三和下游三发挥作三用。凋亡蛋三白酶：Cas三pas三es:cys三tei三ne-三con三tai三nin三ga三spa三rta三te-三spe三cif三ic三pro三tea三se（三含半胱三氨酸的三天冬氨三酸特异三水解酶三）是一组三对底物三的天冬三氨酸部三位有特三异水解三作用，三其活性三中心富三含半胱三氨酸的三蛋白酶三。三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病apoptosis概述三、细三胞凋亡三的调控三机制细胞凋三亡与疾三病①以无三活性的三形式存三在。②在P三ro-三Cas三pas三es的三N端均三含有一三段的前三区域（三Pro三dom三ain三）。③活性三形式均三是由2三个大亚三基和2三个小亚三基组成三的杂四三聚体。三一分子三Pro三-Ca三spa三se只三能分裂三产生1三个大亚三基和1三个小亚三基。④在大三亚基的三C端均三含有Q三ACX三G（X三=R.三Q或G三）的活三性中心三，其中三半胱氨三酸（C三）是必三需氨基三酸，故三Ca三spa三se是三属于半三胱氨酸三蛋白酶三类。Cas三pas三e的结三构特征①凋三亡蛋白三酶激活三的DN三A酶抑三制物(三ICA三D)②核三纤层（三lam三ina三）蛋白③细三胞骨架三蛋白：三导致细三胞解体三，形成三凋亡小三体④其三他的c三asp三ase三s⑤灭三活细胞三凋亡的三抑制物Cas三pas三e的作三用底物使抑制三凋亡因三子失活三，如C三AD/三ICA三D破坏细三胞结构三，如L三ami三na将调节三区与催三化区分三离，使三蛋白失三活，如三Gel三sol三in细胞凋三亡与疾三病三、细三胞凋亡三的调控三机制(四)三细胞三凋亡相三关基因抑制凋三亡基因三：Bcl三-2，三IAP促进凋三亡基因三：wtP三53，三Bax双向调三控基因三：c-m三yc，三Bcl三-x三、细胞凋亡的调控机制细胞凋亡与疾病

Bcl-2----Bcelllymphoma/leukemia-2

*Bcl-2——229aa构成（鼠236）分布在线粒体内膜,细胞内膜表面，内质网，核膜等处*Bcl-2和C.elegans中的ced-9有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能*Bcl-2的功能是延长细胞的寿命，而不是刺激细胞的增殖1.BcL-2家族分子(1)Bcl三-2家族分三子结构

一类呈抗凋亡作用，有BcL-2,BcL-w，BcL-XL、BFL-1、Brag-1、MCL-1，AI。

另一类呈现促凋亡作用的，有Bax，Bak,Bok，BcL-Xs，Bad,Bid,Bik，Hrk，Bim等。BcL-2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。(2)BcL-2的同源基因和蛋白质(3)BcL三-2抗凋亡三机制①直接三的抗氧三化②抑制三线粒体三释放促三凋亡的三蛋白质③抑制三促凋亡三的Ba三x，B三ak细三胞毒作三用④抑制三Cas三pas三es激三活⑤维持三细胞钙三稳态2.FasFas属肿瘤三坏死因三子受体（TN三FR)家族成三员，Fas配体（Fas三L)属TNF家族成三员。Fas是跨膜三蛋白，三由胞外三区(1三57三aa)三，穿膜三区(1三7a三a)及三胞浆区三(14三5a三a)组三成。Fas胞浆区三一段6三0～7三0氨基三酸序列三与TNF三R胞浆区三高度同三源，并三介导细三胞死亡三，称之三为死亡三域(de三ath三do三mai三n，D三D)。Fas较广泛三地分布三于多种三类型的三细胞。Fas三L与其受三体Fas结合导三致细胞三凋亡。3.P53基因wtP53——修复受损的DNA，如修复失败则诱导细胞凋亡突变的P53失活的P53丧失监视DNA损伤的功能射线，毒素P53蛋白+细胞凋亡分子警察C-m三yc是一种三原癌基三因，是三调控细三胞周期三的主要三基因。三编码的三蛋白是DNA结合蛋三白，调三控基因三转录。三在GF充足时三主要激三活介导三细胞增三殖的基三因；反三之激活三凋亡基三因。4、C-m三yc基因5、IAP家族IAP家族是三一组具三有BIR三（ba三cul三ovi三ral三IA三Pr三epe三at)结构域三和抑制三凋亡的三蛋白。IAP家族蛋三白的BIR结构域三是IAP抑制凋三亡的结三构基础三。在人三类已确三定有6三种IAP相关蛋三白。在三酵母和三哺乳动三物细胞三中，IAP家族蛋三白能通三过抑制cas三pas三e-3,三7,9三等的活三性。6、其三他基因Jun三、fo三s、m三yb、三asy三、Rb等基因三都与细三胞凋亡三的发生三有关四、细三胞凋亡三的检测细胞凋三亡与疾三病细胞凋三亡的检三测方法.一、细三胞凋亡三的形态三学检测.二三、磷脂三酰丝氨三酸外翻三分析（三Ann三exi三nV三法）三、线三粒体膜三势能（mt）的检三测四、D三NA片三断化检三测五、T三UNE三L法六、C三asp三ase三-3活三性的检三测七、W三B检测八、凋三亡相关三蛋白T三FAR三19的三表达和三细胞定三位分析细胞凋三亡的形三态学检三测1光三学显微三镜和倒三置显微三镜未染色三细胞：三凋亡细三胞的体三积变小三、变形三，细胞三膜完整三但出现三发泡现三象，细三胞凋亡三晚期可三见凋亡三小体。染色细三胞：常三用姬姆三萨染色三、瑞氏三染色、三苏木精三染色等三。凋亡三细胞的三染色质三浓缩、三边缘化三，呈新三月状附三在核膜三周围。2荧三光显微三镜和共三聚焦激三光扫描三显微镜一般以三细胞核三染色质三的形态三学改变三来评判三细胞凋三亡的进三展情况三。常用三的DN三A特异三性染料三有：H三O,三Hoe三chs三t3三334三2;H三O,三Hoe三chs三t3三325三8;三DAP三I。3电三子显微三镜观察Nuc三lea三rm三orp三hol三ogi三cal三ch三ang三es三of三HeL三ac三ell三si三na三pop三tos三is三pro三ces三s（48三8nm400三）电镜观三察:凋亡细三胞体积三变小，三细胞质三浓缩。三凋亡Ⅰ三期的细三胞核内三染色质三高度盘三绕，出三现许多三称为气三穴现象三的空泡三结构。三细胞凋三亡的晚三期，细三胞核裂三解为碎三块，产三生凋亡三小体。磷脂酰三丝氨酸三（PS三）外翻三分析（An三nex三in三V法）磷脂酰三丝氨酸三（Ph三osp三hat三idy三lse三rin三e,三PS）正常位三于细胞三膜的内三侧，在三凋亡早三期，P三S可从三细胞膜三的内侧三翻转到三细胞膜三的表面三，暴露三在细胞三外环境三中。A三nne三xin三-V是三一种分三子量为三3536K三D的C三a2+依赖性三磷脂结三合蛋白三，能与三PS高三亲和力三特异性三结合。三将An三nex三in-三V进行三荧光素三（FI三TC、三R-P三E）或三bio三tin三标记，三以标记三了的A三nne三xin三-V作三为荧光三探针，三利用流三式细胞三仪、荧三光显微三镜以及三共聚焦三激光扫三描显微三镜检测三细胞凋三亡的发三生。Ann三exi三nV三-FI三TC三Flu三ore三sce三ncePI三Flu三ore三sce三nceTim三ec三our三se三of三apo三pto三sis三in三TF三-1三cel三ls三cul三tur三ed三in三GM-三CSF三-fr三ee三med三iumApo三pto三tic三He三La三cel三ls三wer三es三tai三ned三wi三th三FIT三C-A三nne三xin三V+P三I线粒体三膜势能三（mt）的检三测线粒体三荧光染三料：Rho三dam三ine三12三3、D三iOC6（3）三、JC三-1、三TMR三M等对三线粒体三膜电位三非常敏三感，其三荧光的三增强或三减弱说三明线粒三体内膜三电负性三的增高三或降低三。DNA三片段化三分析细胞凋三亡时主三要生物三化学特三征是其三染色质三发生浓三缩,三染色质三DNA三在核小三体单位三之间的三连接处三断裂,三形成三180200三bp整三数倍的三寡核苷三酸片段三,在三凝胶电三泳上表三现为梯三形电泳三图谱(三DNA三la三dde三r)。五、细三胞凋亡三与疾病细胞凋三亡与疾三病（一）三细胞凋三亡不足三：1.肿三瘤细胞增三殖过度三、细胞三凋亡不三足。实验研三究：P53三基因（三促凋亡三基因）三缺失或三突变Bcl三-2基三因（抑三制凋亡三基因）三表达过三度临床应三用：放疗、三化疗三诱导瘤三细胞凋三亡五、细三胞凋亡三与疾病细胞凋三亡与疾三病（一）三细胞凋三亡不足三：1