蛋白质催组装

“可控自组装体系及其功能化”重大研究计划基于蛋白质的催组联体系：从蛋白质订书机到人工分子伴侣--及关于高分子催组装体系的一些思考张文彬2014年8月29日北京大学化学与分子工程学院软物质科学与工程中心2

教育与科研经历DATirrell院士(NAS,NAE,IOM)裴坚教授程正迪院士(NAE)

RPQuirk教授2000.9-2004.6学士2006.1-2010.5博士2010.5-2011.8博士后

美国阿克伦大学高分子科学系北京大学化学与分子工程学院

美国阿克伦大学高分子科学系2011.9-2013.8博士后

美国加州理工学院化学工程系2013.8至今研究员北京大学化学与分子工程学院有机化学高分子化学和物理蛋白质材料生物材料Caltech高分子材料3“Inordertobeacceptable,thesolutiontoascientificproblemmustsatisfyexactingcriteriaanddemands.Theseconstrains,however,donoteliminatecreativity.Theyprovokeit.”

------I.Prigogine4催组装的概念Ref.:Wang,Yu;Lin,H.-X.;Chen,L.;Ding,S.-Y.;Lei,Z.-C.;Liu,D.-Y.;Cao,X.-Y.;Liang,H.-J.;Jiang,Y.-B.;Tian,Z.etal.Chem.Soc.Rev.,2014,43,399.“…acatassemblerisasubstancethatincreasestherateofanassemblyprocesswithoutmodifyingtheoverallstandardGibbsenergychange;theprocessiscalledcatassembly.”自组装传统上被认为是一个自发进行的过程，并能够对外界刺激做出较快的响应。这意味着一个较低的能垒和一个简单的组装自由能图景。这对于具有有限成分的小分子来说是成立的，但并不总是成立的。对于一个复杂的自由能图景，自组装常常不能产生功能结构。5什么是具有roughfreeenergylandscape的体系?催组装应用范围(1).目标组装体并非动力学最快或者热力学最稳定的组装产物。(2).多组分组装体。(3).各个组装中间体不容易相互转化（容易被动力学因素控制）。(4).极限环境或复杂环境。(5).高层次组装（组装之上的组装）。组装体复杂度催组装过程是从结果或者时序的关系上来看一个自组装过程，本质上催组装的每一步都是常规自组装过程，它利用了弱键的动态特点，引导组分走过一个roughfreeenergylandscape,达到某种特定的组装产物。6

催组剂催化剂应用分子组装化学反应相互作用非共价共价活性中心多个一到两个自释放是否选择性高高机理中间体适用范围终产物催组装难点(1).很难从头开始设计催组装体系。(2).催组装是一个动态过程，很难分离表征中间体和最终组装体，阐明机理。(3).不太可能有一种催组剂适用于所有催组装过程。对于复杂组装过程，一种催组剂也不太可能可以完成整个组装过程。普遍机理？如何阐明？如何分离稳定？催组剂与组装体系的对应关系？如何稳定表征动态产物？过渡态理论7突破思路难点一：很难从头开始设计催组装体系。路线一:虽然我们很难重头设计一整个催组装体系，但是我们可以重新设计我们已认识的自组装过程（这包括每一步的自组装强度以及构型的接力），分开控制每一步以达到一个本来没有的组装结构。优点：每一步的组装过程可以严格表征，以阐明机理。(2)每一步的组装过程都是已经了解的过程要点：作用的强弱变化必须得当(2)诱导构型的形成以及别构效应是非常重要的从改造已有的组装体系做起。8突破思路难点二：催组装是一个动态过程，很难分离表征中间体和最终组装体，阐明机理。路线二:通过和化学反应的串联来改变组装的自由能图景。在一系列的催组装事件之后，利用化学反应的发生固定组装产物，得到某些非传统的组装结构或者某些非传统的化学产物。由此可以把模板组装、多组分组装、生物自反应基元等重新设计转化为催组联系统，使之成为工具。优点：将大大拓展催组装的应用范围。(2)可能赋予化学反应独特的可控性。要点：如何控制化学反应的发生与否？(2)如何保证化学反应的效率？与化学反应串联。9突破思路难点三：不太可能有一种催组剂适用于所有催组装过程。对于复杂组装过程，一种催组剂也不太可能可以完成整个组装过程。路线三:对于每一种特定的组装过程，找到一种普适的催组剂。事实上，实用的催组剂可能是催组剂的混合物，它们接力指向一个最终的组装体。现象：某些氨基酸（比如精氨酸）能有效促进蛋白质的体外复性。(2)表面活性剂对于某些蛋白质的体外重新折叠是必要的。要点：某些催组剂可以指向某个特定的组装过程(2)某些催组剂起到的是一个普遍的作用—theykeeptheassemblyfreetoexplorethefreeenergylandscape!特别催组剂：特异识别广泛催组剂：物理作用（化学作用？）普适催组剂、特殊催组剂以及催组剂鸡尾酒。10关于高分子催组装的一些思考第一部分11生物大分子组装生物大分子广泛存在催组装的现象，但其机制尚不够明确。这其中有很多是生命科学领域的基本问题。(1).折叠蛋白质比非折叠蛋白质只稳定一点点。那么，蛋白质折叠是如何选择并达到这样一个折叠态？(4).生物体系本质上是多组分的复杂体系。为了实现功能，这些分子机器必须能在时空序列上精确地安排组装过程。比如：(2).蛋白质折叠中会不会被困在不同的介稳态？(3).功能生物分子的浓度一般非常低。它是如何在一个极端复杂的环境中发挥作用？催组装在生命科学中非常重要！12“Thehypothesisthatchaperonescouldhaveanactiverole,astericactionontheirproteintargets,wasnottotallyrejectedbyJohnEllisalthoughitishardtoreconcilewiththegeneralactionofchaperones–andstillhauntsthedreamsofmanybiologists.”Ref.:Morange,M.J.Biosci.2005,30,461-464.FoldingCode（折叠码）：TheSecondHalfofGeneticCode生物大分子组装分子伴侣13高效：在缺失IF1,IF2,IF3情况下,组装的速度将分别降低7,600,和9倍。

Ref.:Antoun,A.;Pavlov,M.Y.;Lovmar,M.;Ehrenberg,M.EMBOJ.,2006,25,2539-2550.催组剂:起始因子（IF1,IF2,IF3）.高选择性：引发因子协同作用，加速组装，保证启动子的正确选择生物大分子组装如何借鉴这些原理在合成高分子体系中实现控制和应用催组装？14合成高分子组装(1).每个大分子具有天文数字量级的可能构型/组装结构。(2).组装体常常处于亚稳态（metastablestate），而且不同亚稳态组装体之间并不一定容易相互转化。(3).长链上多重官能团的集合作用和相互作用不容易控制和协调。由于高分子的长链特征…催组装在高分子科学中也非常重要！减少成核能垒，引导高分子链组装走向最稳定的结构(2)从部分有序到有序(从亚稳态到稳态)；(1)从无序到有序;改变组装路径，引导高分子链组装走向特定亚稳态结构(1)从亚稳态到亚稳态。15组装方式(1).溶液组装(2).本体组装(3).受限空间组装(a)胶束化；(b)胶体粒子；(c)结晶；(d)链折叠(a)微相分离；(b)结晶(a)薄膜；(b)界面从组装到催组装AC60-PS-PEO该化合物在热处理下难以发育好的微相分离结构；在掺入均聚物PEO(~10%)的情况下，热处理下很快就形成微相分离结构。均聚物PEO(~10%)留在PEO相中，并不能除去。“Anewterm,‘‘catassembly,’’issuggestedtorefertotheincreaseintherateandcontrolofamolecularassemblyprocess.”催组装和共组装也许有很多交叉，对于合成高分子尤其如此。16基于蛋白质的催组联体系第二部分LysAsp+GluBDTagAProteinStaplerBDTagB从改造已有的组装体系做起。与化学反应串联。“Natureisbyfarthemostimportantsourceofinspirationfordesigningandcreatingsuchsystems.”Tian,Z.etal.Chem.Soc.Rev.,2014,43,399.17生物大分子催偶联体系Ref.:Tian,Z.etal.Chem.Soc.Rev.,2014,43,399.HK97噬菌体头部衣壳组装和成熟18BacteriaareAmazingChemists,too!Corynebacteriumdiphtheriae白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)的鞭毛具有单元间和单元内的蛋白质侧链交联（发生在赖氨酸的氨基和天冬酰胺的酰胺之间），进一步增强鞭毛的机械强度，以更好的入侵宿主细胞。Ref.:Baker,E.N.etal.TrendsBiochem.Sci.2011,36,229-37.19SpaD-D2&D3Lys-332Asn-450Lys-187Asn-299分子内异肽键20解构SpaD3蛋白单元LysAsnGluBDStaplerBDTagABDTagB识别重组共价键联如果把两个肽链的平行排列看成是一个组装结构，它的形成是被订书机催化促进并进一步固定住的，所以是一个独特的催组联体系。21催偶联体系能量图22基于蛋白质的催组联体系LysAsp+GluBDTagAProteinStaplerBDTagB架起生命体系和合成体系之间的桥梁多肽标签既可以基因编码，又可以固相合成极少残余的偶联方法即使对于同一种反应也有多种不同的正交的编码方式可以进化的反应对和订书机一个超分子编码的蛋白质订书机23蛋白质材料的合成慢表达原位反应后反应表达纯化…高分子合成的四大挑战：长度，序列，立体化学，拓扑结构。+BBAAAAXAX:bioactiveunits可在生物材料方面得到广泛应用。24基于化学作用的人工分子伴侣第三部分慢表达难折叠蛋白质共同表达蛋白质订书机环化蛋白质折叠蛋白质普适催组剂、特殊催组剂以及催组剂鸡尾酒。25环化是改性的普遍策略环化可以有效增强蛋白质的热稳定性、对酶解的稳定性以及变性之后重新折叠的能力。Ref.:

(a)Iwai,H.;Lingel,A.;Pluckthun,A.J.Biol.Chem.2001,276,16548;(b)Schoene,C.;Fierer,J.O.;Bennett,S.P.;Howarth,M.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,6101–6104环化内酰胺酶线性内酰胺酶环化GFP环化的位点对于环化效率和稳定性的改进很重要。26人工“化学”分子伴侣Glu能否通过原位环化蛋白质来促进蛋白质的稳定折叠以及体外复性原位折叠体外复性27人工“化学”分子伴侣蛋白质订书机作为人工“化学”分子伴侣，在共表达中环化目标蛋白质，并促进其折叠。慢表达难折叠蛋白质共同表达蛋白质订书机环化蛋白质折叠蛋白质MolecularChaperone:防止不可逆聚集过程ChemicalChaperone:利用拓扑限制减少可能的构型，增加折叠

结构的稳定性。28蛋白质药物蛋白质订书机作为人工“化学”分子伴侣，一方面可促进不稳定蛋白质药物的正确折叠和生物活性，一方面可增强药物对于蛋白酶的抵抗，延长在体内的循环作用时间。干扰素促红细胞生成素集落刺激因子可在生物医药方面得到广泛应用。29主要创新点（1）催组联体系来源于生物体系，是在天然体系上改造，可行性高，并可进行不同方式的相互正交的基因编码；（2）人工分子伴侣通过催组联改变目标蛋白质的拓扑结构，也即通过原位共价修饰促进难折叠蛋白质的正确折叠和复性，是有别于天然分子伴侣的一种催组装机理；催组联工具（1）架起合成高分子和蛋白质的桥梁，可在不影响生物活性前提下制备杂化生物材料；（2）可促进不稳定蛋白质药物的正确折叠和体外复性。催组装理论与表征方面（1）模型体系：可以精确地理解每一步相互作用的强度，可定量比较催组装的效果，甚至可以通过晶体结构解析，阐述催组联的过程；催组装在生物材料与生物医药方面的应用30年度计划2015年1月-2015年12月：完成一对原型蛋白质订书机的构建和优化，并初步实现人工分子伴侣。2016年1月-2016年12月：优化人