乳酸菌的益生及免疫调节作用

乳酸菌的益生及免疫调节作用第一页，共21页。InternationalJournalofFoodMicrobiologyAvailableonline13May2011Keywords:LactobacilliProbioticcharacteristicsImmunemodulation第二页，共21页。Inthecurrentstudy,theprobioticpotentialofapproximately350strainsoflacticacidbacteriaisolatedfromKoreaninfantfecesandKimchiwasinvestigated.Commonprobioticpropertiesofthebacterialstrains,suchasacidtolerance,biletoleranceandadhesiontohumanintestinalepithelialcells(HT-29cells),wereexamined.Somestrainswerefoundtohaveimmunemodulatoryandantimicrobialproperties.Antagonisticactivityagainstapanelofpathogenicbacteriawasfoundtobestraindependent.Toevaluatetheimmunemodulatoryactivityofthestrains,lymphocyteinterferon(IFN)-γsecretionwasdeterminedinconjunctionwithcellproliferation.SomestrainsofLactobacillusgasseri,L.fermentumandL.plantarumexhibitedincreasedIFN-γlevelsandlymphocyteproliferation.Toevaluatetheeffectsoftheseimmunemodulatinglactobacillionhostlifespan,Caenorhabditiseleganswasusedasaninvivomodel.Nematodesthatweresuppliedheat-killedlactobacilliasafoodsourceexhibitedobviousdifferencesinlifespancomparedwiththosefedEscherichiacoliOP50.Themeanlifespan(determinedasmeanpercentsurvival)ofwormsfedL.plantarumCJLP133andL.fermentumLA12was13.89%and13.69%greater,respectively,thanthatofcontrolnematodesafter21days(P=0.036and0.043,respectively).Inaddition,someofsafetyprofiles,includinghemolytictype,gelatinhydrationanddegradationofurea,werefoundtobepositive.Thesenewlyidentifiedlactobacilliholdpromiseforuseasprobioticagents,feedadditivesand/orinfoodapplications.第三页，共21页。Abstract研究发现，从韩国婴儿的粪便及泡菜中分离出的乳酸菌大约有350株菌株有益生潜力。益生菌的普遍益生特性主要包括：耐酸性，耐胆盐及对人肠上皮细胞的粘附性。还有一些菌株有免疫调节作用及抗菌作用。一些细菌对致病菌有一定的抵抗作用。为了评估这株菌的免疫调节作用，测定淋巴细胞干扰素（IFN）

-γ的分泌与增值。一些发酵乳杆菌和植物乳杆菌会使干扰素（IFN）

-γ分泌增加及淋巴细胞的增值。一些安全指标，包括溶血性，明胶水化及尿素降解发现是阳性的。这些分离出来的菌株可以作为益生菌用于饲料及食物中。第四页，共21页。1Introduction

乳酸菌作为益生菌可以有益于人类健康及阻止人类疾病。乳酸杆菌是一个有较好益生效果的菌属。大量的研究证实许多的乳酸杆菌都有益生特性。虽然在传统的食品中乳酸杆菌作为益生菌有很长的历史了，但它作为益生作用及用于食品加工之前一些指标还是需要测定的。益生菌能够抵抗胃酸和胆盐，并能够定植于人体的肠道中。已经证实乳酸菌能够抑制致病菌的生长，如大肠杆菌，李斯特菌，沙门氏菌等。临床上也显示出了乳酸杆菌的有益作用，如降低胆固醇，预防腹泻，缓解乳糖不耐症，抗癌及免疫调节作用，这些都说明它具有益生功能。近年来认为免疫调节作用对宿主肠道健康有很重要的作用。益生菌的益生作用被应用于功能性食品及药物制剂中，主要是由于这些微生物能够刺激宿主的免疫系统。对致病菌及微生物抗原的防御反应能够促进肠道成熟及完整性。一些体外实验也证明了乳酸杆菌具有抑制致病菌的作用。第五页，共21页。本实验的研究主要集中在对从韩国婴儿粪便及泡菜中分离出乳酸杆菌的益生特性的研究主要集中在耐酸性（acidtolerance），耐胆盐（biletolerance）及人体上皮细胞的粘附性上（humanintestinalepithelialcells）。一些测试菌株表现出免疫调节作用及抗菌作用并且能够延长宿主的寿命。主要应用于亚洲人群的发酵乳杆菌和植物乳杆菌有潜在的益生特性。这些益生特性可以应用于功能性食品及饲料中。第六页，共21页。2Materialsandmethods

2.1Isolationandpreliminaryidentification乳酸杆菌来自于韩国婴儿的粪便及泡菜中。乳酸杆菌用改良的MRS固体培养基，37℃厌氧培养48h。从平板中挑取单菌落在纯化的MRS固体培养基中培养，并进行革兰氏染色。在-80℃条件下用含15%甘油的MRS液体培养基储存。传代三次。第七页，共21页。2.2Specieslevelidentification通过16rDNA序列分析对209个分离菌株进行测定。从每个菌株中提取DNA进行引物扩增。PCR引物序列如下：正向引物，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3';反向引物5'-GGTTACCTTTGTTACGACTT-3'；94℃下变性5min。然后进行30个循环，持续一分钟。退火：50-55℃,1min,72℃，40s聚合反应，最后72℃聚合5min。扩增产物使用凝胶提取试剂盒进行纯化。最终产品的序列通过ABI377DNA自动测序仪进行分析。将得到的序列与DNA数据库中序列进行比较进行同源性分析。第八页，共21页。2.3pHandbiletolerance耐酸性：含有1000单位/毫升的胃蛋白酶的酸化MRS液体培养基

37℃培养3h，观察活菌存活数。胆盐耐受性：含0.3%胆汁的MRS液体培养基37℃培养24h,观察活菌数第九页，共21页。2.4AdhesionassayHT-29肠上皮细胞储存于24孔培养板中并供给补充10%的胎牛血清的RPMI-1640，细胞浓度为4×104个细胞/孔。所用细胞浓度大约为约1×107CFU/毫升。在37℃培育两个小时后，用PBS洗涤单层膜6次。用无菌水吹打粘附的细菌，使其分离，进行平板计数。重复两次。第十页，共21页。2.5Inhibitionofintestinalpathogens六个代表性的肠道致病菌：大肠杆菌O157和H7ATCC43894，鼠伤寒沙门氏菌KCCM11806，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌和李斯特菌。致病菌在37℃BHI液体培养基中培养18h。取1ml细菌培养液与100ml含有1.2%琼脂的BHI一起倒入平板中。将乳酸杆菌（40微升）涂在平板的表面，37℃培养12h。不含乳酸杆菌的MRS作为阴性对照组。培养后，测定抑菌圈的范围。出现明显的超过2mm的抑菌圈为阳性。重复三次。第十一页，共21页。2.6Lymphocyteproliferationassay采用MTT法。淋巴细胞取自六周龄小鼠的脾脏，将其接种于96孔板中，加入200微升的RPMI-1640（补充10%FBS），培养24h。将乳酸杆菌加入到每孔中，在37℃含5%CO2培养箱中培养。细菌细胞的准备：在MRS液体培养基37°C培养18小时后，将细胞悬浮液以8000r/min离心10min,用PBS洗涤两次。每个细菌细胞数的调整6×106CFU/毫升。72h后，将培养液从每孔移出，并在每孔加入20微升的MTT溶液。1h后，有色甲臜结晶溶解，用酶联免疫检测仪测定490nm的吸光度（OD值）。重复三次。阳性对照组，淋巴细胞培养在含有刀豆蛋白A（10微克/毫升），植物血凝素（

PHA，

10微克/毫升）或脂多糖（

LPS，

10微克/毫升）；阴性对照组：不含乳酸杆菌的的细胞第十二页，共21页。2.7Determinationofinterferon(IFN)-gammaproduction此实验使用活菌体及热灭活的细菌。活菌体的制备同上，细菌的悬浮液的体积调节到105菌落形成单位/毫升。热灭火细胞的制备：37℃MRS液体培养基中培养18h，8000r/min离心10min,用PBS洗涤两次。调整细胞悬浮液的体积到105菌落形成单位/毫升的密度~108菌落形成单位/毫升；最后细胞在70℃热灭活10min，在-20℃储存待用。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定培养上清液中的IFN-γ的水平。从小鼠取出的脾淋巴细胞，将其接种于96孔板中，加入200微升的RPMI-1640（补充10%FBS），将细菌细胞加入其中，37°C在含5%CO2的培养箱中培养。3天后，回收培养上清，通过酶联免疫吸附法（

ELISA）测定IFN-γ释放量。在酶联免疫吸附法（

ELISA）中，微量滴定板涂覆有5微克/毫升纯化的抗IFN-γ抗体，室温下反应4小时，然后孔板用PBS洗涤三次。用1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS封存。重复三次。孔板在室温下培养2h，之后用PBS洗涤5次。IFN–γ通过生物素标记的抗IFN-γ抗体来测定。将孔板洗涤，加入辣根过氧化物酶。加入100微升的盐酸终止反应。在450nm处测定OD值。对于阳性对照组，淋巴细胞培养在含有刀豆蛋白A（10微克/毫升），植物血凝素（

PHA，

10微克/毫升）或脂多糖（

LPS，

10微克/毫升）；阴性对照组：不含乳酸杆菌的的细胞。第十三页，共21页。2.8Safetyevaluation

在含5％羊血琼脂平板上培养48h后，测定溶血性和菌落形态。明胶液化程度在25°C冷冻的营养明胶管中测定至少72h。第十四页，共21页。3Results

3.1pH值及胆盐耐受性350株菌株中有118株在含有1000单位/ml，pH2.5的条件下存活。一些菌株能够在胆盐环境中存活24h以上。总结起来，共有59株乳酸杆菌在酸性及胆盐条件下有较强的存活性。第十五页，共21页。3.2粘附力测定用上述59株菌株粘附HT-29肠上皮细胞（表1）。菌株间的差异性很大。在测试菌株中，有29株对上皮细胞有较强的粘附性，粘附性高于或接近阳性对照组鼠李糖乳杆菌。其余30株表现出低度或中度的粘附性。第十六页，共21页。3.3肠道致病菌的抑制乳酸杆菌对肠道致病菌的抑制作用有很大的不同。许多的菌数显示出对肠道致病菌有弱的或没有致病性，但是一些菌株，包括发酵乳杆菌LA12和CJMA3，植物乳杆