第四章基因克隆的质粒载体

质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体单链噬菌体载体噬菌粒载体染色体定位整合载体人工染色体载体其它特殊用途载体目前一页\总数一百一十八页\编于十一点一、基因工程四大要素：目的基因克隆载体工具酶受体系统目前二页\总数一百一十八页\编于十一点单独的基因不易进入细胞进入后不能维持.三、什么是克隆载体？vector通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。二、为什么要用克隆载体？目前三页\总数一百一十八页\编于十一点载体具有如下功能:1.运送外源基因高效转入受体细胞

2.为外源基因提供复制能力或整合能力

3.为外源基因的扩增或表达提供条件目前四页\总数一百一十八页\编于十一点四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件：1.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。2.能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。4.必须是安全的。目前五页\总数一百一十八页\编于十一点五、克隆载体的种类根据来源可分为：质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体等目前六页\总数一百一十八页\编于十一点目前七页\总数一百一十八页\编于十一点目前八页\总数一百一十八页\编于十一点目前九页\总数一百一十八页\编于十一点目前十页\总数一百一十八页\编于十一点根据用途可分为：表达克隆载体启动子探针型载体

cDNA克隆载体等根据应用对象可分为：原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。目前十一页\总数一百一十八页\编于十一点根据其复制或存在方式可分为:自主复制型载体和附加载体目前十二页\总数一百一十八页\编于十一点第四章基因克隆的质粒载体目前十三页\总数一百一十八页\编于十一点质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份.Plasmid一词由JoshuaLederberg于1952年提出。质粒的命名:例:pBR322一、与构建克隆载体相关的质粒性质p代表质粒;“BR”代表两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是实验编号.目前十四页\总数一百一十八页\编于十一点已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝并将质粒分子精确地分配给子代细胞。1.质粒的特点：目前十五页\总数一百一十八页\编于十一点其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复杂的有机化合物等。目前十六页\总数一百一十八页\编于十一点质粒通过合成长效致死物和短效解毒剂得以在细菌中生存.目前十七页\总数一百一十八页\编于十一点质粒绝大多数是环形双链的DNA但也存在有线形质粒、RNA质粒（酵母的杀伤质粒）2.质粒的生物学特征只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的线粒体中都发现有质粒的存在。质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随染色体的复制而复制,称为附加体。目前十八页\总数一百一十八页\编于十一点目前十九页\总数一百一十八页\编于十一点3.环形双链DNA质粒分子组成与构型多数为双链环状DNA分子.分子量从不足2kb到100kb以上,多数为10kb左右.具有三种不同的构型：共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口。即OC构型。线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而形成。称L构型。目前二十页\总数一百一十八页\编于十一点什么是超螺旋(superhelix或supercoil)？

DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态，

DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构的一个重要特征。

正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反目前二十一页\总数一百一十八页\编于十一点目前二十二页\总数一百一十八页\编于十一点4.作为克隆载体质粒的条件适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括三种共同的组分：复制子选择性标记基因克隆位点基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数目前二十三页\总数一百一十八页\编于十一点根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种接合型又叫自主转移的质粒具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。

可以在不同细胞间转移。非接合型的质粒不能自我转移的质粒，失去控制细菌配对和质粒接合转移的基因。不能自主转移。5、质粒的类型目前二十四页\总数一百一十八页\编于十一点F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因目前二十五页\总数一百一十八页\编于十一点目前二十六页\总数一百一十八页\编于十一点质粒的转移与迁移.转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞.迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细胞移至另一种细胞.质粒迁移的条件（自身编码）①bom位点(colE1)nic位点.②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶,切割nic位点.迁移作用(mobiligation):由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.目前二十七页\总数一百一十八页\编于十一点目前二十八页\总数一百一十八页\编于十一点从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障的潜在危险.而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌三者共培养过夜.在基因工程中得到大量的应用.目前二十九页\总数一百一十八页\编于十一点三亲杂交法目前三十页\总数一百一十八页\编于十一点根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：F(Fertility)质粒:

Ｒ(Resistance)质粒Col质粒降解质粒（Degradativeplasmids）致瘤质粒（Virulenceplasmids）农杆菌Ti质粒

目前三十一页\总数一百一十八页\编于十一点根据质粒的转移功能分类目前三十二页\总数一百一十八页\编于十一点根据质粒的表现分为:定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质粒。相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，这样的质粒称为隐蔽质粒。受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的隐蔽质粒。显性质粒和隐蔽质粒目前三十三页\总数一百一十八页\编于十一点人工构建的质粒根据其功能及用途分为:

(1)多拷贝质粒

(2)测序质粒(3)整合质粒

(4)穿梭质粒(5)表达质粒(6)探针质粒

目前三十四页\总数一百一十八页\编于十一点质粒的复制子决定其拷贝数。复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点,相关的调控元件,复制终点。6、质粒的复制复制起点是一段特定的DNA片段，长约几百碱基对，其相关的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。定义：质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。目前三十五页\总数一百一十八页\编于十一点与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列,都是作为复制子的一部分而被复制.起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所在的DNA分子.目前三十六页\总数一百一十八页\编于十一点质粒的拷贝数定义:(1)通常定义:生长在标准培养条件下(LB培养基)每个细菌细胞中平均所含有的质粒的拷贝数.(2)特殊定义:在营养富有余的培养基中,每个细胞当中每条染色体所拥有的平均质粒DNA分子数.(3)<基因工程原理>中定义:在LB液体培养基中生长的每个细胞,如果具有20个及以上的质粒DNA分子,就叫高拷贝质粒,如果低于20个则叫低拷贝质粒.目前三十七页\总数一百一十八页\编于十一点质粒就其复制方式而言分为两类：

严紧型（stringentplasmid)每个寄主细胞中仅有１－３份的拷贝。松弛型（relaxedplasmid)每个寄主细胞中仅有１０－６０份的拷贝。一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。而非接合型的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。例外，接合型的质粒Ｒ6K分子量较小，为松驰型。质粒中已鉴定的复制子已逾30个，但分子克隆中常用的几乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持１５－２０个拷贝。目前三十八页\总数一百一十八页\编于十一点即同一种质粒在不同的寄主类型中可能属于严紧型的，也可能属于松驰型的。如ColE1-K30在大肠杆菌中属于松弛型的,在奇异变形杆菌中是严紧型的。质粒拷贝数还与寄主状况有关。目前三十九页\总数一百一十八页\编于十一点氯霉素扩增:

pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。

目前四十页\总数一百一十八页\编于十一点另外两种质粒（psc101和p15A）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。

目前四十一页\总数一百一十八页\编于十一点质粒复制控制的分子模型抑制蛋白稀释模型阻遏蛋白在低浓度时处于单体状体，高浓度时处于多体状态。只有多体状态具有活性自体阻遏蛋白质模型阻遏蛋白具有自体阻遏活性。目前四十二页\总数一百一十八页\编于十一点目前四十三页\总数一百一十八页\编于十一点目前四十四页\总数一百一十八页\编于十一点7、质粒的不相容性(不亲和性)指在没有选择压力下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。只有当两种质粒在同一寄主细胞中都不受限制时，才能判断。亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同一种不亲和群。大肠杆菌质粒中至少已鉴别出３０种以上的不亲和群。目前四十五页\总数一百一十八页\编于十一点质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关。携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度与质粒的拷贝数成正比。阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链ＤＮＡ中的一条断裂从而导致质粒ＤＮＡ复制的启动。并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制反应继续进行。目前四十六页\总数一百一十八页\编于十一点目前四十七页\总数一百一十八页\编于十一点8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化(1)氯化铯密度梯度离心法(2)碱变性法(3)微量碱变性法目前四十八页\总数一百一十八页\编于十一点氯化铯密度梯度离心法1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。目前四十九页\总数一百一十八页\编于十一点流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。

目前五十页\总数一百一十八页\编于十一点目前五十一页\总数一百一十八页\编于十一点目前五十二页\总数一百一十八页\编于十一点碱变性法：

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA目前五十三页\总数一百一十八页\编于十一点流程：1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4~5mg溶菌酶）静置5分钟；3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。目前五十四页\总数一百一十八页\编于十一点影响质粒DNA产量的因素：

1、寄主菌株的遗传背景使用endA基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施：

选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶的表达；在纯化质粒DNA的过程中，用加热法核酸内切酶使失活；采用最佳的实验流程，减少核酸内切酶的污染并在纯化了质粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。目前五十五页\总数一百一十八页\编于十一点

2、质粒的拷贝数及分子的大小

插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。目前五十六页\总数一百一十八页\编于十一点二、构建质粒克隆载体的基本策略

一般条件：选择适合手头工作目标的质粒载体选择载体上的限制性内切核酸酶位点用合适的连接反应条件选用最适合扩增外源目的ＤＮＡ的质粒的大肠杆菌菌株具备筛选转化子的方法和验证目的基因克隆的技术有时需要特殊的步骤以降低转化菌落的背景在每一阶段都需要设置阴性及阳性对照目前五十七页\总数一百一十八页\编于十一点构建质粒克隆载体的基本策略：(１)质粒载体应该能在转化的受体细胞中进行有效的复制。作为质粒的克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。所以含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori)，最好是松弛型质粒的复制起始位点。(２)必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，且这样的克隆位点尽可能多。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，质粒克隆载体中往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点(MCS)连杆。目前五十八页\总数一百一十八页\编于十一点(３)必须含有供选择克隆子的标记基因。(4)质粒载体本身DNA分子应尽可能小。(５)根据需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种‘元件’，构建成不同用途的质粒克隆载体。如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，就成为强表达质粒克隆载体。或者在质粒克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。目前五十九页\总数一百一十八页\编于十一点质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则：(１)选用合适的出发质粒。(２)正确获得构建质粒克隆载体的元件。(３)组装合适的选择标记基因。(４)选用合适的启动子。(５)在能达到预期目的前提下，构建过程应力求简单。目前六十页\总数一百一十八页\编于十一点（三）、质粒载体的构建与类型

1.

天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。

目前六十一页\总数一百一十八页\编于十一点

第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr），插入外源片段后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。目前六十二页\总数一百一十八页\编于十一点ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片段后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。目前六十三页\总数一百一十八页\编于十一点2.理想的质粒载体必须具备的基本条件(1)具有复制起点自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。(2)具有抗菌素抗性理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。(3)具有若干限制酶切单一位点（MCS）(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数，可获得大量的克隆基因。目前六十四页\总数一百一十八页\编于十一点以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）目前六十五页\总数一百一十八页\编于十一点3.质粒载体的选择记号新陈代谢特性；对大肠杆菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；

四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。目前六十六页\总数一百一十八页\编于十一点二、质粒载体的选择标记目前六十七页\总数一百一十八页\编于十一点4.不同类型的质粒载体（1）高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因（2）低拷贝的质粒载体有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。目前六十八页\总数一百一十八页\编于十一点

(3)失控的质粒载体

复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。Example：pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2~3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。目前六十九页\总数一百一十八页\编于十一点

(4)插入失活型质粒载体将外源DNA片段插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example：在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片段，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片段的重组体质粒的几率会显著上升。

目前七十页\总数一百一十八页\编于十一点(5)正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。目前七十一页\总数一百一十八页\编于十一点Example：

质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片段，编码一种致死功能的kil基因。该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind或Hpa位点插入外源DNA片段后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株。目前七十二页\总数一百一十八页\编于十一点正向选择质粒载体的条件限制：1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基2、可使用的克隆位点少3、假阳性水平高4、不能够调节插入序列表达活性目前七十三页\总数一百一十八页\编于十一点(6)表达型的质粒载体表达载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

目前七十四页\总数一百一十八页\编于十一点主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。目前七十五页\总数一百一十八页\编于十一点

目前七十六页\总数一百一十八页\编于十一点四、重要的大肠杆菌质粒载体

1、pSC101质粒载体；

2、ColE质粒载体；

3、pBR322质粒载体；

4、pUC质粒载体；

5.其它的重要的质粒载体目前七十七页\总数一百一十八页\编于十一点1.pSC101质粒载体一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr

）。有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7种核酸内切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。目前七十八页\总数一百一十八页\编于十一点目前七十九页\总数一百一十八页\编于十一点（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体

—葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达

金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶

EcoR切割成4段。目前八十页\总数一百一十八页\编于十一点目前八十一页\总数一百一十八页\编于十一点（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体—在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA用核酸内切酶EcoR消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA），与EcoR消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经EcoR酶切，电泳后13个转化子含有外源片段。转化率23.6％目前八十二页\总数一百一十八页\编于十一点目前八十三页\总数一百一十八页\编于十一点2.ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。目前八十四页\总数一百一十八页\编于十一点目前八十五页\总数一百一十八页\编于十一点

用ColE1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性：1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便；2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。目前八十六页\总数一百一十八页\编于十一点3.pBR322质粒载体目前八十七页\总数一百一十八页\编于十一点pBR322的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）。

目前八十八页\总数一百一十八页\编于十一点目前八十九页\总数一百一十八页\编于十一点pBR322的结构来源目前九十页\总数一百一十八页\编于十一点pBR322质粒载体的优点：1、具有较小的分子量

它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。

2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号

pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片段可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。目前九十一页\总数一百一十八页\编于十一点Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片段，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片段的重组质粒不能在这种培养基上生长。目前九十二页\总数一百一十八页\编于十一点BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX目前九十三页\总数一百一十八页\编于十一点

b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成β–内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素β–内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。目前九十四页\总数一百一十八页\编于十一点

3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。目前九十五页\总数一百一十八页\编于十一点

pBR322质粒载体的改良为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。目前九十六页\总数一百一十八页\编于十一点应用pBR322质粒作为基因克隆载体—水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析

基因psbA编码的蛋白质，与光合作用系统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津结合的能力，推测是三维结构发生了改变；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了25%和40%。

目前九十七页\总数一百一十八页\编于十一点

通过对基因psbA的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbA基因。

首先，将水稻叶绿体DNA，用EcoR内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为1.8～2.5kb之间的DNA片段。

再与经过EcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒DNA连接。

然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成Ampr转化子菌落群体。用经32p标记的玉米psdADNA探针作菌落杂交，从1000多个菌落中筛选出8个阳性克隆。目前九十八页\总数一百一十八页\编于十一点

对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片段带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片段编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%。目前九十九页\总数一百一十八页\编于十一点4.

pUC质粒载体人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

目前一百页\总数一百一十八页\编于十一点一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。目前一百零一页\总数一百一十八页\编于十一点AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,

多科隆位点）LacpromoterlacZ’目前一百零二页\总数一百一十八页\编于十一点pUC质粒载体的形体图目前一百零三页\总数一百一十八页\编于十一点pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适