第4讲+细胞融合与体细胞杂交

第4讲+细胞融合与体细胞杂交第一页，共70页。2第二页，共70页。杂交1.通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。2.两条单链DNA或RNA的碱基配对。杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品质优良等。一般情况下，通过生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交。较多的是种间、种内杂交。由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。3第三页，共70页。部分野生品种的块茎、果实虽不能食用，但它们的植株具有较强的抗病虫害、抗盐碱性和耐寒能力。因此，用野生马铃薯和番茄分别与马铃薯、番茄作物杂交，培育出了生存能力较强的杂交系植物。杂交玉米等杂交植物比它们的亲本更为健壮，产量更高。杂交拟南芥（中间）比其亲本（左和右）要大《自然》（Nature）2008年11月23日：中美科学家近日研究发现杂交植物比其亲本生长更大更好的原因:负责光合作用和淀粉代谢的基因在白天要更为活跃4第四页，共70页。5第五页，共70页。不亲和性不亲和性：在有性生殖过程中，由于生物个体的细胞或组织水平上的不协调而使受精或接合不能正常进行，或是受精后不能产生后代的现象。例如：生殖细胞不能融合，或受精卵不能发育，或子代无繁殖能力等。是双亲个体间基因型的不协调或是染色体组非同源性在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是稳定物种的重要机理之一。种间不亲和性：异种、异属生物个体之间的生殖不亲和现象常由染色体组的不同所造成。一般地说，越是远缘则不亲和性越高，直到完全不能受精。种内不亲和性：种内个体间的不亲和现象往往是受不亲和基因所制约而并不是染色体组不同的结果。6第六页，共70页。远源杂交远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。由于种属间存在着种种隔离机制，致使远缘杂交常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。体细胞杂交是解决远源杂交不亲和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因资源，培育新物种7第七页，共70页。视频：8第八页，共70页。9第九页，共70页。第一部分细胞融合10第十页，共70页。一定义与意义细胞融合（Cellfusion）是指用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。对于植物也叫“原生质体融合”。亲本细胞是体细胞，也叫“体细胞杂交（somaticcellhybridization）”。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大。11第十一页，共70页。二细胞融合的分类1.材料：原生质体（去除了细胞壁的裸露的细胞）、动物细胞。2.从亲本来源：（1）同核体（Homokaryon）：基因型相同的细胞融合成的融合细胞。（2）异核体（Heterokaryon）：来自不同基因型的融合细胞。3.从融合效果：（1）对称融合（Symmetricfusion）：两个完整的细胞间的融合。（2）不对称融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合。12第十二页，共70页。原生质体A原生质体B同质融合（B+B）异质融合（A+B）同核体（BB）异核体（AB）核融合B的核丢失杂种细胞（A+B）B的染色体丢失胞质杂种不对称杂种B的染色体部分丢失13第十三页，共70页。三发展历史自发融合现象最初在动物细胞中发现。1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。动物体内的破骨细胞也是自发融合形成的多核细胞。1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。20世纪70年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。20世纪80年代，齐默曼（Zimmerman）等建立电场诱导细胞融合方法。14第十四页，共70页。15第十五页，共70页。主要环节（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备）（2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附（3）质膜融合形成细胞桥（4）胞质渗透（5）细胞核融合（6）融合细胞筛选16第十六页，共70页。原生质体及其制备（1）定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体（protoplast）。（2）特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。17第十七页，共70页。（3）制备18第十八页，共70页。两步法：

酶分离法果胶酶处理材料游离出单细胞纤维素酶处理单细胞分离出原生质体优点：所获得的原生质体均匀一致、质量好；缺点：操作复杂，已被淘汰。19第十九页，共70页。一步法外植体酶液配制：注意纤维素酶、果胶酶和渗透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH酶液离心过滤灭菌后-20℃保存外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理26℃摇床振荡2-8小时20第二十页，共70页。（4）分离、鉴定与活力分析（1）分离飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。沉降法：低速离心，收集沉淀。不连续梯度法:无菌下，浓度较高溶液（如20%蔗糖溶液）加入离心管加入原生质体混合液封口后，离心，原生质体漂浮在上面用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次将原生质体悬浮在液体培养基中备用飘浮法21第二十一页，共70页。沉降法

微孔滤膜过滤酶混合液低速离心3-5min弃去上清液和酶液液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次除去未消化的组织细胞使原生质体沉淀将原生质体悬浮在液体培养基中备用22第二十二页，共70页。不连续梯度法离心管中配制成不同的浓度梯度加入原生质体混合液离心5min，原生质体位于某一浓度梯度，用吸管收集液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次将原生质体悬浮在液体培养基中备用23第二十三页，共70页。叶片原生质体分离纯化流程图24第二十四页，共70页。（2）鉴定与活力分析低渗爆破法：爆破后是无形的。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色法：有活力的原生质体吸收不同染料显示与死亡细胞不同的颜色来分析。FDA（二乙酸荧光素）能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性25第二十五页，共70页。酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法：有活力原生质体光照下放出氧气，黑暗耗氧气

26第二十六页，共70页。关键：细胞核的融合27第二十七页，共70页。五细胞融合方法1.生物法病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。28第二十八页，共70页。原理与过程（1）足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起。（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏，不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合（病毒也随之进入细胞质）。（3）有丝分裂，细胞核融合，形成杂种细胞。29第二十九页，共70页。2化学法可以采用的化学诱导剂包括：NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。细胞膜电荷平衡被打破。30第三十页，共70页。（1）NaNO3诱导融合1909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶液中可以恢复并伴随着细胞融合。1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种。NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。31第三十一页，共70页。（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）发现采用强碱性（例如）的高浓度钙离子溶液（50mmol/LCaCl2•2H2O）在37℃下处理两个品系的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可以达到10%。钙离子中和原生质体膜或细胞膜表明表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合。32第三十二页，共70页。（3）PEG诱导聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之间，分子量1,000以下者为液体，1,000以上者为固体。

PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。33第三十三页，共70页。（4）高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导34第三十四页，共70页。细胞融合例子1

甘蓝与大白菜的化学诱导融合35第三十五页，共70页。36第三十六页，共70页。37第三十七页，共70页。38第三十八页，共70页。39第三十九页，共70页。3物理法电融合诱导法（Electrofusion）：利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。优点：融合率高、重复性与可控制性强。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。40第四十页，共70页。41第四十一页，共70页。细胞融合举例2

——薄荷的电诱导融合42第四十二页，共70页。43第四十三页，共70页。六融合细胞筛选因融合的随机性而成为细胞融合的关键而必需的技术44第四十四页，共70页。1筛选的原因与必要性细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。问题：A与B融合过程中，你能预见有哪些形式的细胞吗？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚体。未融合的A，B。45第四十五页，共70页。2杂种细胞筛选方法（1）细胞形态大小差异

(2)荧光标记选择（3）再生后杂种与亲本形态、性质差异46第四十六页，共70页。。

FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显微镜下呈绿色RITC(异硫氰酸罗丹明)

RITC在荧光显微镜下呈红色47第四十七页，共70页。（4）选择性培养基筛选法：互补选择法.利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法。例如：利用抗性标记、酶缺陷型、激素需求差异等。亲本原生质体生长要求外源激素，而有的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素，从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。48第四十八页，共70页。原生质体矮牵牛爬山虎冠瘿混合体融合处理矮牵牛+爬山虎细胞团愈伤组织（异核体）NT培养基MS培养基(无激素)NT培养基NT培养基细胞团MS培养基(无激素)死亡MS培养基(有激素)愈伤组织原生质体细胞团MS培养基(无激素)死亡愈伤组织49第四十九页，共70页。细胞融合例子3：

利用抗性标记进行的融合细胞筛选50第五十页，共70页。51第五十一页，共70页。费氏中华根瘤菌52第五十二页，共70页。七细胞融合的应用植物：体细胞杂交培育新品种动物：单克隆抗体生产（动物细胞生物制药讲授）53第五十三页，共70页。第二部分体细胞杂交Somaticcellhybridization54第五十四页，共70页。一体细胞杂交育种的意义1克服有性不亲和性，实现远源遗传重组。2问题：与基因工程改造相比有什么优点？植物的抗逆性多为多基因控制，因此易于实现多基因控制性状。55第五十五页，共70页。二技术路线关键技术：细胞