第五章 聚合酶链式反应

第五章聚合酶链式反应第1页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五章聚合酶链式反应PCR基因放大连琐反应聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)简称PCR，是以DNA为模板，利用DNA聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA聚合酶链式反应。第2页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五章聚合酶链式反应InventedbyKaryMullisin1983.Firstpublishedaccountappearedin1985.AwardedNobelPrizeforChemistryin1993.第3页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五章聚合酶链式反应KaryB.Mullis（1944－）TheNobelPrizeinChemistry1993第4页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五章聚合酶链式反应Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现，1987获专利。1986，PE-Cetus公司发现并纯化出适用于PCR的耐热DNA聚合酶1987，PE-Cetus公司推出PCR自动化热循环仪1988，PE-Cetus公司获得基因工程方法生产的耐热DNA聚合酶1989，PE-Cetus公司获得PCR方法、天然Taq酶及重组Taq酶三项专利1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第5页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五章聚合酶链式反应第6页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五章聚合酶链式反应（PCR）

第一节聚合酶链式反应扩增原理第二节聚合酶链式反应体系第三节聚合酶链式反应引物设计原则第四节聚合酶链式反应技术类型第五节聚合酶链式反应技术应用第7页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理DNA体内复制PCR原理第8页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理第9页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。①模板DNA变性：模板DNA经93℃左右加热一定时间后，双链DNA模板或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链。②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的单链。变性--退火--延伸三步骤的重复循环，就可获得更多的“模板互补链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多次循环后目的基因扩增放大几百万倍。第10页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理DNA模板的变性：将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性），并游离于反应体系中作为模板；模板与引物的结合（退火或复性）：将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）；引物延伸：将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸）

（新合成的链可作为下一轮循环的模板）按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA扩增倍数T=2n(n:循环次数)。第11页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理PCR的基本原理变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物

PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR过程

变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第12页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步,循环20-30次目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本循环第13页，共69页，2023年，2月20日，星期三第一节PCR扩增原理第14页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系一、PCR反应操作程序以30μl体系为例各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算

10×buffer：

1×30/10=3μl

MgCl2:1.5×30/25=1.8μl

dNTPs:0.2×30/10=0.6μl

引物P：

0.4×30×2/10=2.4μl

Taq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl

模板：1μl

水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl第15页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系一、PCR反应操作程序操作示例：

5份标本总体积30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列试剂：

10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P：2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：21μl×6=126μl

共174μl，先用移液器/指弹混匀，后用离心机瞬时混匀（管壁上液体沉至管底）。第16页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系一、PCR反应操作程序

2.另取5支0.2mlEp管，分别加入上述液体29μl。

3.分别取标本模板各1μl，加入上述5支Ep管中，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。

4.反应条件：PCR扩增仪

94℃5m′,(94℃30″，55℃30″，72℃

1′，35个循环)，72℃延伸5′。第17页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系二、PCR反应的成份1.缓冲液

10～50mMTris-Cl(pH8.4)

维持Taq酶作用环境的偏碱性

25～50mMKCl

促进引物退火，>50mM会抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。第18页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系二、PCR反应的成份2.MgCl2

1.5～2.0mMTaq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。第19页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系二、PCR反应的成份3.dNTPs

dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物

0.02～0.2mMdNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓度与dNTPs

浓度之间的关系，Mg2+浓度比dNTPs浓度高0.2～2.5mM。过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。第20页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系二、PCR反应的成份4.引物(Primer-P)

预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。

0.2～1μM

偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5.TaqDNA聚合酶：耐高热

0.5～5U/100μl1U/25～50μl

偏高：引物非特异产物的扩增偏低：产物量降低第21页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系二、PCR反应的成份6.模板DNA(Template)

最低102

～105bpDNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1～5μl

过高：非特异产物增加过低：产量降低7.水去离子水，补足整个反应体积第22页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系三、PCR反应条件优化1、温度、循环参数⑴变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90～95℃，30～60s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94℃30″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。第23页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系三、PCR反应条件优化1、温度、循环参数⑵复性温度和时间：

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15～25bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40～60℃，30～60s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择55℃30″，足以使引物与模板之间完全结合。第24页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系三、PCR反应条件优化1、温度、循环参数⑶延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70～75℃。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，<1Kb，1分钟足够；>1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72℃1′。第25页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系三、PCR反应条件优化1、温度、循环参数

⑷循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20～30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。第26页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系三、PCR反应条件优化

2、MgCl2浓度

可显著影响PCR的产量及产物特异性1.5～2.0mM

过高：增加非特异扩增并影响产率过低：酶活性显著下降。

3、引物

0.2～1μM

偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。引物设计原则：总原则是提高扩增的效率和特异性第27页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系平台期与平台效应

1.平台效应（plateaueffect）

PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。第二节PCR体系第28页，共69页，2023年，2月20日，星期三第二节PCR体系平台期影响因素：

1.引物及dNTP底物浓度降低。

2.酶与模板比例下降。

3.最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链DNA）

4..非特异性产物或引物的二聚体与反应模板的竞争作用

5.浓度在10-8mol/L时的特异引物的重退火（延伸率降低，TapDNA聚合酶消耗，产物链分叉，引物移位）

6.变性和在高产物浓度下产物分离不完全

实际应用提示：定量PCR应考虑平台期效应，选择最适循环次数。第29页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则引物设计缺陷而引起的后果第30页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则1.引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过Taq

DNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性2.引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列4.避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带第31页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则5.引物3’端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败6.引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处7.引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性8.引物量每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会

RT-PCR引物设计特别注意：跨越两个外显子第32页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则引物5′端修饰技术附加核酸序列用途

限制酶位点克隆（如定向克隆）噬菌体启动子合成RNA探针、测序蛋白质结合序列产物纯化、检测核糖体结合序列高效表达加错配碱基造成突变定点诱变第33页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则简并引物（degenerateprimers）（补充）

针对某一基因编码蛋白的氨基酸区域设计的一组碱基序列不同，但有相同碱基数的寡核苷酸混合物。

简并引物设计及应用

1.对纯化的未知蛋白测定一段短氨基酸序列。

2.不同物种某一基因编码的保守氨基酸区域。

应用：基于简并引物PCR策略克隆新基因第34页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则第35页，共69页，2023年，2月20日，星期三第三节PCR引物设计原则引物设计的方法

1.PC设计利用下载的引物设计软件，自己设计所需引物。引物设计的软件：primeprimer、oligo、DNAstar、DNAMAN等

2.在线引物设计

Primer3、Primerfinder、codehop等等。

GeneFisher简并引物在线设计

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Codehop简并引物设计软件

/codehop.html第36页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型巢式PCR采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内P1上P1下P2上P2下用途：验证第一次PCR产物的特异性进行特殊PCR，如合成探针模板第37页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型Alu-PCR第38页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型不对称PCR（asymmetricPCR）目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究第39页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型反向PCR（inversePCR）原理是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。第40页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型反向PCR（inversePCR）第41页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型等位基因专一PCR(AllelespecificPCR,ASPCR)

该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。第42页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型

竞争引物PCR(competitiveoligonucieotideprimerPCR,COP-PCR)有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。第43页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型cDNA末端快速扩增技术第44页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型PCR单链构象多态性（PCR-singlestrandconformation

polymorphism,PCR-SSCP）DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。第45页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型

Touch–downPCR又称降落PCR。即选定一个温度范围，如50—35℃，每降1-2℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。触-向下的的原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度第46页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型热启动PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq脱氧核糖核酸聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如位置-径直的突变、表达克隆或用于脱氧核糖核酸工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。第47页，共69页，2023年，2月20日，星期三第四节PCR技术类型差示PCR（DD-PCR)利用特殊设计的引物，在RT的基础上进行PCR，以研究不同基因的表达状况。肿瘤组织正常组织第48页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五节PCR技术应用一、核酸的基础研究二、序列分析三、检测基因表达四、从cDNA库中放大特定序列五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段六、进化分析七、医学应用八、分析生物学证据九、性别控制十、转基因检测第49页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五节PCR技术应用PCR技术的主要用途

1、目的基因的克隆：

PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。

2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。第50页，共69页，2023年，2月20日，星期三第五节PCR技术应用3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、DNA序列测定：PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化，也提高了测序的速度。5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。第51页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、出现假阴性二、出现假阳性三、出现非特异性扩增带四、出现片状拖带或涂抹带第52页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因

1．模板因素

2．酶失活

3．引物

4．Mg2+浓度

5．反应体积的改变

6．物理原因

7．靶序列变异第53页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因分析及解决方案

模板因素：

1.模板中含有杂蛋白；

2.模板中含有Taq酶抑制剂；

3.模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋白残留；

4.提取制备模板时丢失过多；

5.模板核酸变性不彻底。模板因素引起假阴性解决方案：

1.配制有效而稳定的消化处理液;

2.提取程序固定,不宜随意改动；

3.模板DNA的溶解液应固定不变。第54页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因分析及解决方案酶失活：

1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；

2.酶存放时间太长；

3.酶存放方式不当，或其他意外原因；

4.忘记添加Taq酶。

酶失活引起假阴性解决方案：

1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；

2.更换新的Taq酶;

3.新旧两种Taq酶同时使用第55页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因分析及解决方案

引物：

1.引物质量；

2.引物浓度；

3.两条引物的浓度是否对称等。

引物引起假阴性解决方案:

1.选定一个好的引物合成单位;

2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；

3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；

4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。第56页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因分析及解决方案

Mg2+浓度：

Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。

Mg2+浓度引起假阴性解决方案：设置一组反应，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2浓度不同（由0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此来摸索最佳Mg2+浓度。第57页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因分析及解决方案

反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。靶序列变异：靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。

第58页，共69页，2023年，2月20日，星期三PCR常见问题（补充）一、PCR出现假阴性原因分析及解决方案物理原因：

1.变性温度低，变性时间短；

2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；

3.延伸时间过短等。

物理原因引起假阴性解决方案：

1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循环，必要时可设为95℃

，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。

2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45℃

，然后再逐次提高（以2℃/次为宜）。

3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延