霉菌毒素检验案例

霉菌毒素检验案例第1页/共100页第2页/共100页第3页/共100页课后复习抗生素类分类：四环素类、氯霉素类、磺胺类药物、硝基呋喃类CAPs是禁止用于食品动物并不得在动物性食品中检出的抗生素。盐酸克伦特罗毒性第4页/共100页第九章食品中真菌毒素检验9.1概述9.2黄曲霉毒素的检验9.3赭曲霉毒素A的检验9.4展青霉素的检验9.5脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验9.6

T-2毒素的检验9.7玉米赤霉烯酮的检验第5页/共100页第6页/共100页第一节概述1.1霉菌及霉菌毒素1.2霉菌毒素的命名及分类1.3霉菌毒素的产生条件1.4毒性与危害第7页/共100页1.1霉菌及霉菌毒素霉菌（fungi）：是菌丝体比较发达而又没有较大子实体的一部分真菌的通称。霉菌毒素（Mycotoxin）：指少数霉菌在污染食品上繁殖所产生的有毒代谢产物，它对人、牲畜引起损害。第8页/共100页霉菌产毒的特点1）霉菌中仅少数菌种能够产毒，少数产毒霉菌只有一部分菌株可以产毒。2）霉菌产毒具有可变性3)产毒的菌种所产生的霉菌毒素无严格专一性4）产毒霉菌产生毒素需一定条件。第9页/共100页常见霉菌和霉菌毒素名称曲霉菌属：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素青霉菌属：黄绿青霉素、展青霉素、黄天精、桔青霉毒素镰刀菌属：单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸内酯、串珠镰刀菌毒素第10页/共100页1.2霉菌毒素的命名及分类霉菌毒素的命名常按产生毒素的霉菌名称来确定霉菌毒素的分类尚无统一的系统命名方法，常用的分类法是按毒素作用部位分为肝脏毒素、肾脏毒素、神经毒素等；按毒素来源分为霉菌毒素类、青霉毒素类、镰刀菌毒素类；按作用机理分为抑制蛋白质合成类、作用于离子通道类、作用于细胞骨架类、作用于细胞突触类；按毒素化学结构分为二呋喃类、内酯环类、醌类。第11页/共100页1.3霉菌毒素的产生条件霉菌毒素产生过程：是霉菌的次级代谢产物。在生长后期，初级代谢产物：如三羧酸循环的中间产物乙酰辅酶A、丙酮酸等大量堆积，使其启动另外合成途径。产生条件：水分、pH值、环境温度、湿度及氧气等因素。粮食水分在17％－18％、湿度在80％－90％、温度在25－30℃及有氧条件、中性附件处有利于霉菌的繁殖。

第12页/共100页1.3霉菌毒素的产生条件食品菌相：共存于食品中的细菌种类和相对数量的构成。如：粮谷中以曲霉和青霉常见，小麦和玉米以镰刀菌污染为主。因此，通过对食品霉菌菌相的分析，大致可判断可能产生的毒素种类。黄曲霉毒素：玉米、花生等青霉菌毒素：大米、水果等镰刀菌及毒素：小米、玉米等

第13页/共100页霉菌污染食品质量的评定及食品卫生意义

1)

霉菌菌相构成田野霉：新鲜，交链孢酶素曲霉、青霉:可检毒素，但不表示变质毛霉、根霉：粮食霉变2)霉菌的污染度：即单位重量或容积的食品或100粒粮食上霉菌总数，表示食品带染霉菌情况。第14页/共100页1.4毒性与危害霉菌引起食品和饲料霉变造成的经济损失很大，据介绍，世界上平均每年由于霉变而不能食用的各类谷物约占总量的2％。60年代以来，不断发现霉菌污染食品引起中毒的事件，研究其原因是由于不少霉菌的代谢产物为有毒物质。1960年英国的10万只火鸡发生肝损害而死亡，后来证实是饲料中黄曲霉菌的代谢产物黄曲霉毒素所致。可引起急性中毒，更多是慢性中毒。致癌、致畸和致突变的物质。特别是黄曲霉毒素。第15页/共100页第16页/共100页第二节黄曲霉毒素的检验2.1概述2.2薄层色谱法2.3酶联免疫吸附测定法2.4高效液相色谱测定法2.5微柱筛选法第17页/共100页2.1概述理化性质：结构，黄曲霉毒素（aflatoxins,AFT）是含有二呋喃环和香豆素（氧杂萘邻酮）一类化合物的总称；溶解性，难溶于水、乙醚、石油醚、己烷等，易溶于甲醇、三氯甲烷、苯、乙腈等极性较小的有机溶剂；稳定性，对光稳定，一般烹调加工温度不被破坏，中性和弱酸性条件下稳定，碱性条件下易分解为无毒物质；对氧化剂不稳定。第18页/共100页第19页/共100页第20页/共100页天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、AFTM1。从结构上看，可把它们分成两大类：即B族和G族，从B族和G族又派生出许多衍生物。所谓B族和G族的来源是在研究AFT初期，用氧化铝板作薄层板，在紫外光照射下，可观察到一些物质发蓝色荧光(blue)，称为B族；另一些物质发绿色荧光(green)称为G族。第21页/共100页第22页/共100页主要来源：主要是黄曲霉（Aspergillusflavus部分产毒）、寄生曲霉(Aspergillusparasitlas所有菌株产毒)等代谢产物。AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉子等。此外，在核桃、乳及乳制品、干辣椒中也有发现AFT的污染。常检出AFTB1，奶和奶制品中易检出AFTM1。在我国，产生黄曲霉毒素的菌种主要是黄曲霉，一般湿热地区产毒株多、产毒量大。第23页/共100页黄曲霉菌丝状菌落第24页/共100页第25页/共100页毒性与危害：是一类毒性很大的物质，对动物能造成急性中毒，其毒性是氰化钾10倍；还能引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。其慢性中毒的主要表现是动物生长发生障碍，肝脏出现亚急性或慢性损伤AFT是目前发现的最强的化学致癌物质。比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，所以，世界卫生组织(WHO)在确定重点研究的毒物中，AFT被列在首位。其作用部位主要是肝脏。AFTB1在动物体内经羟化反应生成两种主要代谢产物AFTM1和AFTQ。前者与AFTB1的毒性和致癌性近似。牛饲料、牛奶。第26页/共100页名称

LD50倍数AFB10.33516663001360DDT200630CDT59201As2O33063KCN310

AFB1与其它毒物的LD50第27页/共100页慢性毒性A肝组织学变化：肝细胞变性，坏死，再生结节，肝管上皮增生及肝纤维化、肝硬化

B肝功能变化：血清转氨酶，ATP，碱性磷酸酶,球蛋白升高C其它症状：生长发育迟缓，体重下降，食物利用率降低，母畜不育或产仔少等。第28页/共100页性别AFB1饲料

ppm喂饲时间平均周数肝癌发病率雄14118/22雌1644/4雄0.3526/20雌0.37011/11雄0.0156812/12雌0.0158213/13AFB1对大鼠致癌性第29页/共100页AFT

对人类毒性A．人体细胞体外试验：抑制细胞分裂、DNA合成、染色体破碎B．人类急性中毒：非洲、印度、中国等均有摄入AFT污染食品中毒报道

2005年5月肯尼亚7人食用AFT污染玉米中毒死亡C．人类肝癌流行病学：AFT污染程度与人群肝癌发病率死亡率正相关；AFT增加乙肝患者肝癌发病率第30页/共100页国家地区AFTB1摄入量（ng/Kg体重/日

原发性病例数肝癌发病率（1/10万人年）肯尼亚高地势区3.541.2泰国Songkhla5.022.0斯威士兰

高原5.1112.2肯尼亚中地势区5.9332.5斯威士兰温暖草原8.9293.8肯尼亚低地势区10.0494.0斯威士兰Lebombo15.444.3泰国Rntburi45.066.0斯威士兰低温草原43.1429.2莫桑比克Inhamba222.446213黄曲霉毒素摄入量与原发性肝癌发病率第31页/共100页卫生标准：污染食品的主要是AFTB1、B2、Gl

、G2、M1等，其中尤以AFTB1最为重要。世界卫生组织的粮农组织(FA0／WHO)规定食品中AFTB1不得超15ppb；美国不得超过25ppb；日本规定不得超过10ppb；以色列和瑞典规定不得检出。我国对各种主要食品中AFTB1允许含量是：玉米、花生仁、花生油及其制品不得超过20ppb；大米和其他食用油不得超过10ppb；其他粮食、豆类、发酵食品不得超过5ppb；婴儿代乳品不得检出。第32页/共100页预防措施

去毒：挑选霉粒物理方法: 碾轧加工法 加水搓洗 吸附法化学方法：加碱处理法二甲基乙醚去油脂中的AFB1新方法：高压破坏、臭氧、微生物去毒第33页/共100页二、霉菌毒素的检测黄曲霉毒素的检测我国涉及黄曲霉毒素的限量及检测的国家标准有GB2761—1981(食品中黄曲霉毒素B1允许量标准)、GB9676--1988(牛乳及其制品中黄曲霉毒索M，限量卫生标准)、GB／T17480--1998(酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素B1)、GB／T5009．22--1996[薄层色谱法(第一法)／ELISA(第二法)测定食品中黄曲霉毒素B，GB／T5009．23—1996[薄层色谱法(第一法)／微柱筛选法(第二法)测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2第34页/共100页2.2薄层色谱法原理：样品中AFTB1经甲醇-水溶液提取后，浓缩、苯-乙腈溶液定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在波长365nm紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度于标准比较来确定含量。样品处理：样品经正己烷或石油醚和甲醇-水溶液（55＋45）振荡提取，样品中油脂、色素等杂质进入正己烷层，而AFTB1和水溶性杂质留在甲醇-水层。用三氯甲烷反提取甲醇-水层，由于AFTB1更易溶于三氯甲烷层，从而进入三氯甲烷层，杂质留在水层。将三氯甲烷层通过盛有无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于蒸发皿中，水浴通风挥干，冷却后用苯-乙腈（98＋2）混合液溶解残渣，作点样液。第35页/共100页定性测定：将样液与标准液点样，用丙酮-三氯甲烷（8＋92）展开，晾干在365nm紫外光下观察，若在Rf值0.6附近有蓝紫色荧光点，可能有。然后在点样处滴加三氟乙酸，则AFTB1水解成AFTB2a

，极性增大，Rf值由0.6降为0.1。定量测定：以最低检出限量0.0004μg为标准。双向展开法：先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点外而AFTB1不动，然后再纵向展开。第36页/共100页2.3酶联免疫吸附测定法原理：将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分及游离的抗原抗体复合物，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。样品处理：粉碎均匀样品用乙腈-水（50＋50）（碳酸盐缓冲液pH至8.0）进行提取，滤纸过滤，滤液用含0.1％牛血清白蛋白（BSA）的洗液稀释后，供检测。第37页/共100页第38页/共100页第39页/共100页测定：用包被抗原（AFTB1和牛血清白蛋白结合物）包被酶标微孔板，4℃过夜。用洗液洗去酶标微孔板多余抗原后，加入毒素标准溶液或样品提取液，然后再加入AFTB1抗单克隆抗体，37℃孵育。多余抗体用洗液洗去，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育。再次洗涤酶标微孔板，加底物四甲基联苯胺溶液，37℃孵育后用硫酸中止反应。方法说明：最低检出限浓度为0.01ppb；ELISA试剂盒低温保存。第40页/共100页包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定第41页/共100页

饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）

甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测第42页/共100页河豚毒素

植物毒素如罌粟碱、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测：第43页/共100页2.4高效液相色谱测定法原理：样品中的黄曲霉毒素经C18柱分离，用带荧光检测器的HPLC检测，时间定性面积定量。样品处理：（1）样品提取，适量样品加水浸润后加入三氯甲烷振摇提取，加无水硫酸钠滤纸过滤于量筒中。（2）样品净化和衍生化反应，将少量提取液通过多功能净化柱层析管，用三氯甲烷-正己烷、三氯甲烷-甲醇淋洗液洗除杂质，用丙酮-水洗脱，水浴挥干用三氯甲烷溶解残渣，取部分溶液加入正己烷、三氟乙酸（TFA）混匀静置30min，使AFTB1衍生为AFTB2a。氮气吹干，加入少量流动相溶解供HPLC测定。第44页/共100页方法说明：提取时也可使用水溶性有机溶剂，如乙腈-水（9＋1）或甲醇-水（8＋2）。本法流动相含有磷酸盐，用完后应用去离子水彻底冲洗，再用甲醇冲洗，以保护色谱柱。流动相也可用不含盐的组分如乙腈-甲醇-水（50＋150＋300）。衍生化的目的是确证样品中是否含有AFTB1第45页/共100页二、免疫亲和层析-高效液相色谱法原理：试样用甲醇-水提取后，用免疫亲和层析柱净化，以水或含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗柱除去杂质，再用甲醇洗脱交联在柱上的黄曲霉毒素，洗脱液经高效液相色谱分离，柱后衍生后，荧光检测器检测，标准曲线法定量第46页/共100页2.5微柱筛选法原理：样品经提取后通过装有氧化铝、硅镁吸附剂的微柱管，AFT被吸附后在365nm下显示蓝紫色光环，其荧光强度与AFT在一定浓度范围成正比。样品处理：磨细混匀样品用甲醇水振荡提取过滤，再加三氯甲烷反萃取，无水硫酸钠脱水即样品提取液。测定方法：三支管中分别加入样品、标准品和三氯甲烷。加展开剂（1＋9）后照射。若出现微黄色荧光环，则未检出AFT，若出现蓝紫色荧光则进一步分析。方法说明：所测结果为AFT总含量；吸附剂应活化；柱管要保持垂直；洗脱废液要密闭。第47页/共100页

由于AFT是一剧毒且强致癌性物质，使用时应特别小心应按以下规定进行实验操作和实验后的清洗消毒工作。①实验时应戴口罩；配标准溶液时戴手术手套。②若衣服被污染，需用5％次氯酸钠溶液浸泡15—30分钟再用清水洗净。③对于剩余的AFT标液或阳性样液，应先用5％次氯酸钠处理后方可倒到指定的地方。

第48页/共100页

④实验中所用的或被污染的玻璃器皿需经5％次氯酸钠溶液浸泡5分钟再清洗之。⑤实验完毕应用5％次氯酸钠清洗消毒实验台等。⑥万一皮肤被污染，可用次氯酸钠溶液搓洗，再用肥皂水洗净。第49页/共100页第三节赭曲霉毒素A的检验3.1概述3.2薄层色谱法第50页/共100页3.1概述理化性质：赭曲霉毒素（ochratoxin）是由曲霉菌和青霉属的几个种属产生的有毒代谢产物。基本结构是异香豆素连接到β-苯丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D四种化合物。其中赭曲霉毒素A（OTA）最重要。OTB没有氯元素，OTC是A的乙酯，OTD是4-羟基A。OTA酸性条件下溶于苯、三氯甲烷和稀碳酸氢钠溶液，加碱成盐，其盐溶于水。主要来源：寒冷条件下由纯绿青霉产生，温暖气候下由赭曲霉产生。谷物、大豆和香辛料，特别是红辣椒易受污染。动物饲料优甚。第51页/共100页与人体健康关系：存在于动物的肾、肝、肌肉和血液中，猪是最敏感的动物，肾是主要靶器官。1956年巴尔干地方性肾病。特定的癌症基因变异，p53

「龙胆泻肝汤（丸）」，原药方以木通入药，至1983年因木通资源短缺，中国大陆地方标准便以关木通代替木通。关木通是马兜铃科草药，含马兜铃酸，2003年底。卫生标准：食品中没有限量标准。分析方法：薄层色谱法、HPLC、ELISA。第52页/共100页3.2薄层色谱法原理：用三氯甲烷-磷酸（0.1mol/L）或石油醚-甲醇/水提取样品中OTA，净化浓缩后薄板展开，根据样品在紫外光灯下，OTA标准点相应处产生黄绿色荧光的强度，与标准比较确定含量。样品处理：样品用三氯甲烷和0.1mol/L磷酸提取，OTA在酸性条件下进入有机相，过滤加碳酸氢钠溶液碱化，OTA进入水相分离后碳酸氢钠水层用稀盐酸溶液调节pH2-3，用三氯甲烷振摇提取分层后，挥干三氯甲烷加入苯-乙腈（98＋2）溶解残渣，供TLC用。第53页/共100页测定方法：滴加标准、样品、样品＋标准三个点。先用横展剂乙醚或乙醚-甲醇-水（94＋5＋1），将薄层板纵展2-3cm，此时OTA不动而杂质向前移动。取出挥干，再将该薄层板靠近标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂进行横展，使杂质偏离点样点，与OTA分离，避免了杂质荧光的干扰。然后将经横展后的薄层板纵展，纵展剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6＋3＋1.2＋0.06）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6＋3＋1.4），苯-冰乙酸（9＋1）。365nm下紫外观察，若与标准点处有荧光点则估计稀释倍数，再点样。同时做确证实验。第54页/共100页确证实验：用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒薄层色谱板，干燥于长波紫外灯下观察，这时OTA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加。方法说明：点样量若超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留的溶剂在横展中可将OTA点横向拉长，可根据荧光强度于标准对比，估计减少的加样体积或所需稀释的倍数；OTA标准液应用黑纸遮光；最低检出限为10ppb。第55页/共100页第四节展青霉素的检验4.1概述4.2双向薄层扫描测定法第56页/共100页4.1概述理化性质：展青霉素（patulin）为无色结晶，70-100℃可升华，分子式C7H6O4，溶于水和乙醇。在碱性溶液中很不稳定，酸性溶液中较稳定，耐热。第57页/共100页展青霉素（Patulin,Pat)

OH结构

OOO第58页/共100页第59页/共100页展青霉素（Patulin,Pat)毒性3.毒性作用

(1)

急性和亚急性毒性啮齿类动物的急性毒性中毒：痉挛、肺出血、皮下组织水肿、无尿，死亡。

(2)致癌、致畸和致突变性皮下注射部位引起雄性大白鼠发生局部肉瘤，经口服的实验动物未发现致癌现象。Pat对大鼠和小鼠没有致畸作用，但对鸡胚有明显的致畸作用。第60页/共100页展青霉素（Patulin,Pat)毒性(3)

细胞毒性：Pat能改变细胞膜的通透性，更利于K+外流。(4)对免疫系统的影响：亚致死剂量的Pat对小鼠和兔的免疫系统均有影响，Pat的免疫抑制作用是可逆的而且Pat对免疫球蛋白水平的影响具有时间依赖性。第61页/共100页展青霉素的污染

食品中的主要来源：是由荨麻青素、扩张青素和棒曲霉等霉菌代谢产生的，存在于腐烂水果及果汁制品中。第62页/共100页品种指标(μg/Kg)半成品（原汁、原酱）≤100原汁、果酱≤50果酒≤50罐头≤50山楂条（饼）≤50

苹果和山楂制品中展青霉素限量卫生标准第63页/共100页4.2双向薄层扫描测定法原理：用乙酸乙酯提取果汁，用1.5％碳酸钠净化样品。经双向薄层展开分离后，用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。样品处理：鲜果、果酱加适量无水硫酸钠研磨吸收多余水分，加乙酸乙酯震荡提取过滤，滤液加稀碳酸钠振摇去杂质，乙酸乙酯在水浴上真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷定容供TLC用。果汁、果酒直接提取。第64页/共100页测定：在薄板上滴加标准液、样品液。在样品点同一垂直线上距顶端2cm处点标准液，作为位置参考点。先用横展剂三氯甲烷-丙酮横向展开后再用甲苯-乙酸乙酯-甲酸纵向展开，254nm下观察，若在Rf0.35处有黑色斑点需做确证实验。将薄板喷3-甲基，2-苯并噻唑酮腙盐酸溶液，135℃烘烤15min，360nm下观察，呈橙黄色斑点即可确认。稀释后点样使其在线性范围内，双向展开后进行扫描定量。最低检出限3μg/L。第65页/共100页图3.9β-(1,3)-D-葡聚糖水解产物的层析水解产物与标准葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖溶液对照进行薄板层析，展开剂为正丁醇：无水乙醇（酸）：水＝4:1:5（V/V，上层液），以苯胺－邻苯二甲酸为显色剂，得到右图。第66页/共100页镰刀菌毒素1.单端孢霉烯族类 （T-2毒素、脱氧雪腐镰孢菌烯醇等）2.玉米赤霉烯酮类3.丁烯酸内酯4.串珠镰刀菌素第67页/共100页单端孢霉烯族化合物1）主要产毒菌株：镰刀菌属2）结构与性质 基本结构：倍半萜烯 毒性化学结构：C－12，C－13环氧基3）性质：稳定、烹调过程不易破坏碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性。第68页/共100页第69页/共100页单端孢霉烯族化合物种类与毒性种类：40余种毒性作用：共同特点表现为较强的细胞毒性、免疫抑制及致畸作用，部分有较弱的致癌性，急性毒性强，可致人与动物的呕吐。第70页/共100页第五节脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验5.1概述5.2脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法5.3酶联免疫吸附测定法5.4薄层色谱法（同时测定）第71页/共100页5.1概述理化性质：镰刀菌属产生的有毒代谢产物主要是单端孢霉素类，只含有C、H、O三种元素。谷物种天然污染的有A、B两型，12、13碳原子上形成的环氧基可能为毒性的化学基础。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol，NIV）属B型结构式，DON的结构式中R1为-OH，R2为-H，R3、R4为-OH。分子式为C15H20O6，NIV分子式为C15H20O7，溶于甲醇、乙醇和水。第72页/共100页主要来源：主要是雪腐镰刀菌污染谷物和饲料的代谢产物。毒性与危害：主要为细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌。人中毒后易呕吐，又称呕吐毒素（vomitoxin）。NIV在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON强。卫生标准：我国建议人食用谷物中DON≤1mg/kg。分析方法：我国规定标准为TLC和免疫测定法，其他有GC、HPLC和微柱法。第73页/共100页品种指标(μg/Kg)小麦≤1000面粉≤1000玉米≤1000玉米粉≤1000小麦、面粉、玉米及玉米粉中DON限量标准第74页/共100页

5.2免疫亲和层析净化-高效液相色谱法

原理：样品中的DON经聚乙二醇提取后，滤液过免疫亲和层析柱净化，用高效液相色谱紫外检测器检测，标准曲线法定量。第75页/共100页

5.3脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法

原理：谷物及其制品中的DON经提取、净化、浓缩后经硅胶展开，加热薄板。由于有三氯化铝因此在365nm紫外光下显蓝色荧光，与标准比较。样品处理：提取，准确称取粉碎样品加三氯甲烷-无水乙醇（8＋2）提取，过滤后水浴挥干；净化，石油醚溶解残渣转入分液漏斗再用甲醇-水（4＋1）分次洗涤，转入同一漏斗振摇，DON留在甲醇-水层，油脂进入石油醚层，将甲醇-水层加入装有氧化铝和活性炭的层析柱再用甲醇-水（4＋1）洗脱；浓缩，洗脱液水浴挥干趁热加入乙酸乙酯加热至沸腾，将残渣中DON溶出，冷却后转入浓缩瓶浓缩定容。第76页/共100页测定方法：在硅胶板上点样液，同时在板上端与样品点相对位置上点一个标准点作为定位参考，用乙醚-丙酮（95＋5）或无水乙醚横展使DON偏离原点，挥干后再点上2个等量标准点，其中一个加上样液。用纵展开剂三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8＋1＋1）或三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（75＋10＋15＋1）展开。晾干后365nm下观察，干扰点显蓝紫色荧光DON无荧光。将薄板130℃加热后冷却，再观察，DON和干扰点均有荧光且斑点明显分开。横展后DON移动0.7-1.0cm。第77页/共100页5.4酶联免疫吸附测定法原理：将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。样品处理：同5.2，浓缩瓶95℃水浴挥干，用pH7.4含20％甲醇的碳酸盐缓冲液定容，供检测。测定方法：同2.3，用酶标仪在波长450nm下测A值。第78页/共100页5.5薄层色谱法（同时测定）原理：同5.3样品处理：提取，准确称取粉碎样品用甲醇-水（96＋4）提取2次过滤。加石油醚洗涤取甲醇-水层，水浴浓缩；净化，浓缩液加水稀释后加入XAD-4树脂，蒸馏水淋洗，用甲醇分次洗提毒素，水浴挥干用甲醇溶解测定方法：取2块板同5.2处理。DON用乙醚横展NIV用三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（4＋2.5＋3.5＋0.6）横展。再分别用三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8＋1＋1）展开DON，用三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（3＋2.5＋4.5＋1.2）展开NIV。第79页/共100页第六节

T-2毒素的检验6.1概述6.2酶联免疫吸附测定法（间接法）第80页/共100页6.1概述理化性质：T-2毒素（T-2toxin）属单端孢霉烯族化合物中的A型化合物，难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯。T-2毒素的三甲硅衍生物具有强的特征质量碎片，可采用GC-质谱联用。主要来源：三线镰刀菌和拟枝孢镰刀菌代谢产物。小麦、玉米、大麦和燕麦等。毒性与危害：严重可引起死亡。卫生标准：我国小麦、玉米及制品低于1000ppb。分析方法：ELISA、TLC、GC等。第81页/共100页T-2毒素第82页/共100页6.2酶联免疫吸附测定法（间接法）原理：同2.3或5.3样品处理：同5.3测定：同5.3第83页/共100页第七节玉米赤霉烯酮的检验7.1概述7.2分析方法第84页/共100页7.1概述理化性质：玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），又称F-2毒素，ZEN白色结晶，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈，不溶于水、二硫化碳，短波紫外光下呈绿色荧光。对热稳定。毒性与危害：类雌激素有毒物质。卫生标准：我国未制定。分析方法：TLC、GC、ELISA、HPLC等。第85页/共100页第86页/共100页主要来源：镰刀菌，污染玉米、小麦、大麦、燕麦、小米、芝麻、干草和青贮饲料等。第87页/共100页7.2免疫亲和层析净化-高效液相色谱法原理：试样中玉米赤霉烯酮用乙腈和氯化钾溶液提取，提取液经ZEN免疫亲和层析柱净化，甲醇洗脱后进样，高效液相色谱分离，荧光检测器检测，标准曲线法定量。样品处理：提取，试样用乙腈提取，溶液经滤纸、玻璃纤维滤纸过滤。净化、洗脱、测定。第88页/共100页7.3分析方法原理：试样中玉米赤霉烯酮用乙腈和氯化钾溶液提取，经异辛烷脱酯、无水硫