微生物工程 第章 发酵过程及控制

第五章发酵过程及控制发酵是一个复杂的生物化学过程影响因素很多：菌种、培养基、温度、pH、溶氧、污染等。一、种子制备工艺及质量控制二、发酵过程中的代谢变化及规律三、基质浓度变化及控制四、温度对发酵的影响及控制五、溶解氧对发酵的影响及控制六、pH对发酵的影响及控制七、CO2对发酵的影响八、泡沫的形成及控制九、染菌分析及控制第五章发酵过程及控制一、种子制备工艺及质量控制菌种是发酵的关键，从一个保存的菌种，到生产上使用的种子，如果按几十～几百吨的发酵规模，10％的种子量（接种量）计，需要几吨～几十吨的种子。（一）、作为种子的要求：1、细胞的生活力强，移种至发酵罐后能迅速生长2、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求3、无杂菌污染4、生理形状稳定、保持稳定的生产能力（二）、种子制备的工艺流程及对发酵的影响1、工艺流程2、接种时间（种龄）和接种量接种时间：对数生长期，菌体量还未达最高峰。接种量：决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。谷氨酸棒状杆菌：1％大多数抗生素发酵：5～10%个别的发酵：20～25％接种量过小，除延长发酵周期外，往往还引起其它不正常情况。接种量过高，会使菌体生长过快，培养液粘度过高，造成供氧不足。3、种子质量检查与判断①检查pH②检查培养基灭菌后糖、氮、磷等的含量③检查菌丝的形态、浓度、种子液外观等④无菌检查⑤稳定性检查⑥其它参数检查：某种酶的活性产物量等（三）、影响种子质量的因素：1、原材料质量2、培养温度、湿度、时间等3、种子罐通气量4、冷藏时间5、传代次数二、发酵过程中的代谢变化及规律与代谢有关的参数：1、物理参数⑴、温度⑵、罐压⑶、搅拌速度⑷、空气流量⑸、表观粘度⑹、发酵液重量与代谢有关的参数：2、化学参数⑴、基质浓度⑵、pH⑶、产物浓度⑷、DNA量⑸、关键酶⑹、溶解氧⑺、排气中的氧含量⑻、排气中的CO2含量与代谢有关的参数：3、生物参数⑴、菌丝形态⑵、菌丝干重或湿重⑶、菌体比生长速率⑷、氧的比消耗速率⑸、糖的比消耗速率⑹、氮的比消耗速率⑺、产物的比生产速率三、基质浓度变化及控制（一）、碳源浓度变化及控制碳源物质是发酵过程中菌体生长和产物合成的能量和碳素的来源。在发酵的前期，碳源物质主要用于生长，消耗较快，在发酵后期，碳源物质主要用于产物合成，消耗速度放缓。快速利用的碳源物质：对生长有利，对次级代谢产物的形成有抑制作用。缓慢利用的碳源物质：对延长产物的合成是有利的，尤其是次级代谢产物。到发酵的中后期，发酵液中的残糖基本耗尽，影响产物的合成。

如果采用丰富碳源的培养基，又会产生其它的问题; 如培养基浓度过高，影响通气搅拌，过高的碳源浓度也抑制菌体的生长。解决的方法是采取“中间补料”补糖的方法：连续滴加补糖小量多次间歇补糖大量少次补糖“中间稻补料”钳可以延眠长产物稼的产生鼓时间，雨推迟菌玩体的自顿溶时间乱，增加顶了发酵缴液的体街积，而析使发酵雪单位大挂幅度上润升。（二）尿、氮源伍浓度变惰化及控倚制氮源物奴质主要先用于菌济体中蛋格白质、尸核酸等浑含氮物话质的合雁成，有盼些发酵渠产物中役含有氮架。发酵前期肥，氮源物鸭质随菌体验浓度的急昂剧增加而约迅速减少势，发酵中都期，氮源忧（氨基氮就）的下降纸速度比较惠缓慢，发强酵后期，像由于菌体狭自溶，氨掏基氮会回令升。氮源物跳质往往太抑制次胸级产物骗的合成盘。快速利达用的氮痒源物质三：如氨酸水、铵良盐促进业菌体生台长。缓慢利用模的氮源物枕质：有利怪于延长产青物的合成雄期。一般情况湾下，发酵移培养基中赢同时含快付速利用的块氮源和缓她慢利用的搜氮源物质纲。如果氮源遇物质投料拐多，会造掠成菌体生过长快，但伍菌体衰老挨也快。解决方法阀：“中间饶补料”。四、温度独对发酵的恋影响及控被制（一）、炒温度对微用生物和发仅酵的影响1、不里同的菌阴、不同伪的发酵鬼对温度谢的要求芹不一样件。2、菌体蓝生长的最纳适温度与箭产物形成示的最适温量度往往不吉一致。3、菌千种在不违同的生搁长期对培温度的桐敏感性跑不同。4、温朱度归根绿结底是腐影响酶豆的活力饥。菌种温度（℃）12996171542T-613最适生长温度最适产物形成温度30-323432-3434-3630-3434-3632-3636-38谷氨酸英菌种的斗最适生猫长温度香和产物挑形成的侄最适温宅度（二）、吉温度在发飘酵中的变掉化规律图生物热运的变化规石律（三）练、温度绪的控制依靠夹择层或蛇坏管控制增。目前许多士发酵罐都羽采用自动道化控制。五、溶解迟氧对发酵锡的影响及桶控制溶解氧作：溶解声于液体杂（发酵煎液）中殊的氧。氧难溶于柔水，在2点5℃，1同atm下徐，氧在水隙中的溶解烦度为0.颜26m填mol/堵升，临界溶铺解氧浓超度：满红足微生御物呼吸挎的最低宅限度的低溶解氧脑浓度。一般好疗气性微缠生物约舱为0.湖003丈～0.点05m萝mo犹l/升珍之间。微生物名称温度（℃）C临界（mmol/升）固氮菌300.018-0.049大肠杆菌150.0031大肠杆菌37.80.0082酵母菌200.0037酵母菌34.80.0046橄榄型青霉菌240.0022橄榄型青霉菌300.009橄榄型青霉菌320.02影响微生棉物需氧量疫的因素1、菌种2、菌阵体浓度3、菌龄4、培养霞基（一）影旺响需氧和坛供氧的因月素影响供氧搁量的因素1、搅拌2、通气届量3、空呀气分布必管的结覆构4、发酵育罐的液柱火高度/直后径比5、培句养液的衫物理性篇质6、泡睬沫溶解氧找的控制僵：应满足需情氧≤供氧（二）撕溶解氧意的控制需氧方面控制最苏适的菌泛体浓度供氧方面著：1、改璃变气体壤成份2、提高久搅拌速度3、增加看挡板4、增加稠通气量5、提高伪罐压几个概念赚：呼吸强度挺：指一克确干菌体，体在一小时挣内所需氧割的毫摩尔边数摄氧量固：指一霸升发酵尘液，在奏一小时轧内所需推氧的毫挖摩尔数通气量：撤指一分钟内，通馋过发酵讽液的空民气体积迹比发酵担液的体著积六、p琴H对发捡酵的影溜响及控盗制（一）、pH值对设发酵的影里响：1、p苗H影响银酶的活京性2、pH仪影响微生铲物细胞膜睡的带电状迅况，从而榆影响微生炒物对养料窃的吸收和犹对代谢产宿物的分泌3、p代H影响执培养基捐中某些弹营养物教质的可闸给性4、pH邻可能改变统培养基的微氧化还原咽电位5、pH枪会影响某宫些微生物五的形态（二）、朝影响pH风变化的因凤素：1、菌种喷特性2、培拐养基组禽成3、发酵安条件（三）、亚pH在发冷酵过程中寺的变化规豪律在发酵洪前期，秤菌体生便长缓慢捧，糖分陕解的少么，铵离坐子利用烂的也少柜，所以绢pH变宪化缓慢要。随菌的瞧生长，圣菌分解塑了含氮脂有机物忘，释放隔出铵，悄培养基融的pH择会缓慢残上升。当菌转鉴入对数俘生长期猪，由于亡菌体大慈量繁殖贞，大量旨利用糖塌和铵离帅子，培役养基的萌pH逐姑渐下降骆。在生长后缴期，由于画菌体自溶饼，释放出母铵，pH默又回升。1、调节僻培养基的稠配方2、补料烂控制①加像酸、加医碱②增加拼无机氮源③增加碳知源物质3、调轮节通气柏量（四）盆、发酵哲过程中碌pH的灾调节七、C窄O2对发酵的寺影响CO2是微生物篇的代谢产衬物，同时侮它往往也啊是合成所狂需的一种迫基质。排气中C泊O2的浓度与全细胞量有颈一定的联缓系，通过桑测定CO2的生成挺，可用额来估算迷菌的生各长速率简和细胞通量。溶解在抛发酵液眠中的C沃O2对氨基酸夜、抗生素献等发酵具依有抑制或毁刺激作用离。（一）、雁CO2对菌体生阅长及产物弃形成的影冬响当排气陕中的C耽O2浓度高谎于4％叨时，菌数体碳水道化合物担的合成捷及呼吸振速率下反降。发酵液孙中的C麦O2浓度为哄1.6伞×10－2mol换时，会竖严重抑欲制酵母键菌的生搜长。CO2影响产盯黄青霉沫的形态事。CO2对氨基览酸合成仓的影响进气中CO2含量（％）紫苏霉素相对产量01234100661500CO2对紫苏车霉素生妄物合成逼的影响（二）感、排气强中CO2与菌体削生长的维关系（三）、英排气中C探O2与pH泰的关系对数生询长期pH变他小生长后厌期,菌渴体自溶,恳铵离子来被释放,pH升驱高RQ（嘱呼吸商掠）=CEOOUTCEO：校CO2释放率（羞molC原O2/Lh）OUT：扫菌耗氧率如（mol胳O2/Lh）（四）辟、排气配中CO2与排气轻中O2之间的直关系酵母菌：RQ=0柴.93栽生成柠檬历酸RQ=互1.0腊生成菌节体RQ＞1处.1容生成乙蜜醇青霉素发烦酵RQ=0猴.909筑菌体捷生长RQ=1船菌体平维持RQ=旬4讨青霉锣素生产八、泡沫宜的形成及拐控制泡沫的危歉害：泡沫的臭持久存较在影响发着微生关物对氧环的吸收嫂；妨碍二愚氧化碳尘的排除鸡，因而密破坏其丝式生理代楚谢的正址常进行匙，不利饼于发酵奖；致使培混养液的地容量一筝般只能透等于种赖子罐容次量的一闯半左右大，大大衬影响了周设备的崖利用率颗，甚至惨发生跑碰料，招贵致染菌吼，造成慰巨大损氧失。泡沫多会勾从轴封溢付出，容易错造成染菌同。降低了处发酵罐脖的装料睁系数。严重时停沾搅拌，影文响正常的诱发酵过程株。产生泡倡沫的原回因:通气和机崖械搅拌使因液体分散颈和空气窜鱼入，形成念气泡；培养基像中某些火成分的猫变化或米微生物详的代谢喜活动产辅生气泡哥；培养基玻中某些搞成分(淋如蛋白贷质及其内他胶体烘物质)线的分子卷，在气果泡表面躬排列形重成坚固千的薄膜纽奉。因此堡，气泡种不易破慰裂，聚妖成泡沫喂层。玉米浆>伍花生饼粉帜>黄豆饼避粉通气搅拌值的强烈程析度种子和超接种量染菌1、机伴械消泡泡沫的消傲除靠机械桶强烈振胁动和压猾力的变引化，促炸使气泡煤破裂，耻或借助灰机械力主将排出零气体中沿的液体杜加以分秃离回收尼，达到黄消泡作虑用。优点：不毒需再发酵上液中加入织其它物质店，减少了谊由于加入态消泡剂所骆引起的染裳菌机会和把对后继分序离工艺的军影响。缺点：索效果不掩如化学燥消泡迅攻速、可固靠、不阳能根本溪上消除化引起稳话定泡沫金的因素脏，同时被它还需缎要设备崖和消耗盛动力。机械消柜泡分类罐内消咽泡和罐月外消泡罐内消汤泡：耙坝式消泡您桨、旋永转圆板搜式、气鞠流吸入狂式、冲竞击反射菊板式、肾碟式及富超声波闷式等罐外消泡然：旋转叶乎片式、喷率雾式、离钻心式及转纠向板式等2、化榜学法消沙泡发酵工业常常用的消疮泡剂有各种天动然的动植物昌油及来自石凑油化工生妙产的矿物油痛、改性乓油、表吵面活性怕剂等。新型的有咬机硅聚合朗物如硅油杰、硅树脂妻等，则具橡有效率高蚀、用量省缺、无毒性矿、无代谢猪性，同时董兼有提高刘微生物合晒成酶等多在种优良特鞭性，是一腰类有发展纲前途的消偿泡剂。泡沫的初控制除漠了添加饶消泡剂撞外，改上进培养始基成分野也是相章辅相成勺的一个攀重要方拥面。化学消泡凯剂应具备肿以下特点唤：必须是表控面活性剂科，具有较揪低的表面紧张力，消滑泡作用迅翼速有效；具有一定穿的亲水性萌，使消泡贵剂对气－钳液界面的无分散系数盖足够大，淹从而迅速侄发挥消泡徒活性；在水中的叔溶解度必杆须小，以歌保持持久咐地消泡或蛛抑泡性能何；对人、比畜及微搏生物无厘毒；不影响警氧在发籍酵液中搅的溶解乘和传递绝；来源方便餐、广泛、芹价格便宜眉；常见的消商泡剂:天然油氏脂:玉滑米油,亩米糠油雾,豆油榆,棉子亏油….聚醚类贫,高呈级醇,肿脂肪酸明,….耗.九、染菌贫分析及控连制（一）染汁菌原因分叹析归结起来怜是：设备、管丧道、阀门刺漏损、灭云菌不彻底免；空气净化殊不好；无菌操魂作不严支或菌种脱不纯等炼。染菌的兆原因1、种子赵带菌或怀轧疑种子带艳菌挥9.6梳4%2、罐钟压跌零责造成染社菌剪0.1山9%3、培苹养基未碌彻底灭水菌蚁0.7坚9%4、空气割系统带菌漏19.盟96%5、泡杰沫冒顶纸0.欢48%6、夹层奸穿孔鲜1赶2.36占%7、其它星管道穿孔绞5.薪89%8、接秩种管穿摄孔遣0.5每9%9、阀门乡丰泄漏赏1.54构%10、搅性拌轴密封再泄漏巡寿2.0象9%11、罐棋基漏捆1.5尊4%12、厉其它设袜备漏羡1驻0.1也3%13、操状作问题训1织0.15团%14、挎原因不肥祥逗20.问91%某发酵衡厂染菌杠现象的密统计分除析1、种子美带菌或怀较疑种子带佳菌县～10昨%2、培养娘基未彻底纯灭菌准～1%3、空慈气系统蜘带菌辞～2封0%4、操臭作问题册～10功%5、设刃备问题居～40钟%6、原瘦因不祥供～20糖%染菌规浓模：大批发酵测罐染菌、国部分发酵巴罐染菌、嘴个别发酵倒罐染菌染菌时齿间：早期、舱中后期染菌种挺类：芽孢杆菌凝、小球菌照、霉菌、废酵母菌、帖水生细菌（二）防森止染菌的东措施主要是加武强管理：1、培养避基的无菌剥试验2、种天子的无雄菌试验3、设要备的定悔期检查晓、维修4、严同格、规爹范的操食作（三）染砍菌后的挽冰救措施1、种子哑罐染菌：国倒罐，从叠其它未染币菌的罐移仰种。2、发酵暗罐早期染伪菌：调酸获以抑制杂刃菌生长；裙加入药物富抑制杂菌通生长；培归养基重新多灭菌，转鸭入发酵旺设盛的发酵列液。3、发押酵罐后帮期