选择性杀灭血液制品中病原微生物病毒的研究方法介绍

选择性杀灭血液制品中病原微生物病毒的研究方法介绍第1页/共24页血液制品的种类人血白蛋白人胎盘血白蛋白静脉注射用人免疫球蛋白肌注人免疫球蛋白组织胺人免疫球蛋白特异性免疫球蛋白第2页/共24页主要方法1热处理方法2有机溶剂／去污剂法(S/D)3紫外线照射法4光化学病毒灭活法5其他方法第3页/共24页1热处理方法

原理：使病毒外膜蛋白和衣壳蛋白变性，使病毒包膜上的糖蛋白棘突发生改变。从而阻止病毒吸附于宿主细胞。此外，热力也可破坏病毒复制时所需的酶类。方法：干热处理、蒸汽加热处理、悬浮加热处理、巴斯德加热处理第4页/共24页各种热处理方法的比较灭活方法处理方法灭活病毒无效病毒主要应用干热处理80℃干热处理72hHIV、HCV和HBV等耐热的无脂质包膜的人微小病毒B19F1I的病毒灭活蒸汽加热60℃的热蒸汽加热10hHIV以及肝炎病毒等暂未发现静注免疫球蛋白制品的病毒灭活悬浮加热处理悬浮于氯仿或庚烷中，60℃加热处理20小时各种病毒有发现肝炎病毒中纯度FⅧ浓制剂和FⅨ复合物巴斯德加热处理法有保护凝血因子稳定剂存在，60℃处理10小时各种脂包膜病毒、蛋白包膜病毒极少数情况下对乙型肝炎和人微小病毒B19无效各种液态的血液制品第5页/共24页巴斯德加热处理法1948年，巴斯德消毒法首先由Gellts等在白蛋白的生产过程中应用，即将溶液状态的白蛋白经60℃10小时加热，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)均可被灭活，临床应用及动物实验没有传播病毒性疾病的报道。经巴斯德加热处理的人血白蛋白制剂在防止肝炎传播方面早有良好的记录第6页/共24页这几种方法中，用巴斯德消毒法(60℃，10h)处理液体状态的血制品效果较好。灭活的同时会导致细胞成分发生变性和代谢破坏，不适合对全血和细胞成分的消毒第7页/共24页2有机溶剂／去污剂(S／D)法

S／D法是由美国纽约血液中心于八十年代中期开发的病毒灭活方法，自1985年该技术获得FDA认可在美国获准使用以来，迄今已在世界上多个国家和多种血液制品中得到推广，具有良好的应用前景。 其机制就是利用化学试剂破坏脂包膜病毒外膜结构的完整性或靶细胞受体识别位点，使其失去传染性或复制能力。第8页/共24页用1%3-正丁基磷酸盐(Tri-n-butylphsophate,TNBP)TNBP加1%TritonX-100

在30℃处理血浆4h。处理后的血浆按每200ml分装,于-30℃保存2年,血浆蛋白的活性仍保持良好,凝血因子也未见被激活。第9页/共24页S／D法的优点：对脂包膜病毒特别有效，且具有不会使蛋白变性，较高的制品回收率，所应用设备简单等。S／D法的缺点：据报道,经其处理的血制品仍可引起使用者发生细小病毒B18和HAV感染。将S/D法与巴氏消毒法(60℃,10h)联用,因巴氏消毒法可灭活蛋白包膜病毒而克服以上缺点。第10页/共24页3

紫外线照射法紫外线(UV)因其良好的杀菌作用,能刺激血液中免疫成分的活性,对蛋白质损害轻微,早在四十年代即曾用于血液制品净化。UV一方面可使核酸突变,阻碍其复制、转录封锁及蛋白质的合成;另一方面,产生的自由基可引起氨基酸光电离,从而导致细胞死亡。第11页/共24页UV灭活的优点：UV消毒血液制品时,灭活病毒效果好,特别是对抗力较强的无脂质包膜和耐热病毒,而对血液成分活性的破坏亦并不严重。UV消毒的缺点：经紫外线照射的病毒具有在可见光照射下重新复性的可能，若紫外线与一些化学光敏剂联合使用，则可提高其破坏病毒核酸的作用。第12页/共24页4光化学病毒灭活法

利用光敏剂杀灭病毒，主要是依靠光敏剂在光照下产生的单线态氧或自由基氧化损伤病毒的分子结构，从而杀灭病毒。根据光敏剂灭活病毒的机理和靶点不同可分为三类：以膜为靶点的光敏剂、以核酸为靶点的光敏剂、多靶点的光敏剂

第13页/共24页各种光敏剂的比较光敏剂有效成分（结构）靶向位点最大吸收峰灭活对象及范围无效病毒及对象血卟啉衍生物双卟啉醚以膜为靶点630nmHSV-1，CMV等有包膜病毒，

而对无包膜病毒无效酞菁类化合物与卟啉类似以膜为靶点650~670nm红细胞制品的病毒灭活暂无报道补骨脂内酯衍生物平面芳香族化合物以核酸为靶点365nm灭活血小板制品中的病毒不适合用于红细胞制品的病毒灭活吩噻嗪类化合物平面杂环化合物多靶点300001ux不仅能灭活有包膜病毒。而且能灭活无包膜病毒，对细胞外和细胞内的病毒都有效暂无报道~45000lux部花菁540带负电荷的杂环化合物以膜为靶点540nm各种包膜病毒对无包膜病毒无效第14页/共24页4.1亚甲蓝／光化学法病毒灭活使用无菌技术连接血浆袋和亚甲监光照袋，将溶入亚甲蓝的血浆收集到光照袋后放入4±2℃医用病毒灭活箱，100份血浆加入亚甲蓝后含量为0.93～3.13μmol／L(1.28±0.30μmol／L)，其中4份容量为260～280ml血浆加入亚甲蓝后浓度<1μmol／L，经荧光(30000lux)照射35min，用过滤器过滤血浆，经滤过后亚甲蓝残留量为0.07～0.62μmol／L(0.23±0.12mol／L)，绝对残留量为0.014～0.146μmol(0.005±0.026μmo1)。第15页/共24页病毒灭活效果的测定采用口炎疱疹病毒(VSV)和Sindbis病毒作为指示病毒，以细胞病变法检测灭活前后病毒滴度检测，vero细胞作为指示细胞，病毒滴度按Karber法计算。Sindhis病毒和VSV病毒灭活前病毒滴度(1gTCID50)均为6.0，灭活后均为0.5，病毒降低量>4，病毒灭活效果符合国家规定要求第16页/共24页血浆主要成分分析在制备前随机抽取100份血浆，血浆量为200～280ml，设亚甲蓝灭活病毒前组及亚甲蓝灭活病毒后组，分别对血浆主要成分进行下列成份测定：纤维蛋白原、总蛋白、白蛋白、血浆Ⅷ因子。第17页/共24页不同的灭活条件，其灭活效果不同。黄庆等以MB为光敏剂，以登革热病毒为指示病毒，以单波长点阵式发光二极管为光源，将指示病毒与不同浓度的MB工作液混合后，收集不同光照强度的MB／病毒混合液，研究对RNA脂包膜病毒的灭活效果，发现当MB浓度<1.0mg／ml时，病毒灭活效果并不理想，而当MB浓度≥1.0mg／ml时，可在较短时间内完全灭活指示病毒。周锡鹏等将含有1μmol／L的MB血浆置于40000lux的可见光下，室温条件处理血浆，结果发现除凝血因子Ⅶ，PT和APTT有一定程度降低外，其它血浆蛋白活性未见明显变化，血浆中的葡萄糖、多种无机盐含量及血浆pH值未受影响第18页/共24页4.2补骨脂素病毒灭活法在UVA照射下，补骨脂素分子两端与病毒核酸嘧啶间形成环丁烷类型的共价键。如果这种共价键形成在双股核酸相邻的嘧啶碱基上，两股核酸间则形成交联。单股核酸如果折叠成双股区也能形成这种交联。当交联度达到1／100碱基时。病毒核酸就不能进行转录，病毒也不能复制。第19页/共24页补骨脂素除了能灭活多种病毒外，它还能灭活白细胞。这不仅无害，甚至还可能有利于消除白细胞相关病毒以及白细胞输送后所导致的异体免疫作用和移植物抗宿主疾病。第20页/共24页5其他方法5.1靶向核酸化学灭活作用对象广,对包膜病毒和非包膜病毒均有效,对其他病原