生物大分子分离纯化原理与技术

生物大分子分离纯化——原理与技术目前一页\总数一百一十五页\编于二十点内容提要1、层析原理与技术2、凝胶过滤层析3、UNOsphere离子交换分离技术4、CHT陶瓷羟基磷灰石分离技术5、疏水相互作用与亲和层析目前二页\总数一百一十五页\编于二十点Lifeisbasedonproteinsandtheirinteractions目前三页\总数一百一十五页\编于二十点层析原理与操作目前四页\总数一百一十五页\编于二十点

层析的起源和原理起源----1906年，俄国植物学家Tsweet原理----利用物质分配系数不同达到分离目的原理与操作Chromatography层析色谱目前五页\总数一百一十五页\编于二十点什么是生物层析

根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP

离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX

大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF

结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC

这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作目前六页\总数一百一十五页\编于二十点GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换HydrophobicInteraction疏水层析反相Affinity亲和层析CHT羟基磷灰石原理与操作目前七页\总数一百一十五页\编于二十点

最广泛的蛋白质分离纯化方法

条件温和维持蛋白质空间结构与活性

基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离层析原理与操作目前八页\总数一百一十五页\编于二十点层析的5个操作步骤装柱并平衡上样平衡洗脱再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作目前九页\总数一百一十五页\编于二十点层析图原理与操作第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量(A280),由UV检测器读出，y轴基线洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉有时这里也显示梯度浓度等检测值时间或体积，x轴目前十页\总数一百一十五页\编于二十点纯化平台的硬件结构——

层析工作站层析介质和层析柱原理与操作目前十一页\总数一百一十五页\编于二十点层析系统DuoFlow中高压层析系统LP低压层析系统Profinia全自动亲和层析系统手动层析组件目前十二页\总数一百一十五页\编于二十点DuoFlow中高压层析系统主要特点：3500psi高压力下梯度模式最大流速可达20ml/min连续波长，4波长同步检测方形X、Y轴组分收集器软件直观容易使用目前十三页\总数一百一十五页\编于二十点BioLogicLP低压层析系统LPDataView软件BioLogicLP系统BioFrac方形组分收集器主要特点：流速精确，0.01ml/min检测灵敏度更高,0.001AU兼容方形收集器目前十四页\总数一百一十五页\编于二十点Profinia蛋白质纯化系统主要特点：全自动亲和纯化，包括亲和标签、亲和无标签，抗体等纯化双紫外检测器设计纯化与脱盐串联一步完成结果直接报告目标蛋白的浓度和得率目前十五页\总数一百一十五页\编于二十点为什么在层析技术中要使用层析仪介质的要求实验的精密度和重现性要求时间的要求目前十六页\总数一百一十五页\编于二十点纯化平台的硬件结构——

层析介质与层析柱，原理与技术目前十七页\总数一百一十五页\编于二十点层析介质离子交换层析介质

UnosphereQ，SMacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM亲和层析

ProfinityIMAC金属螯合介质

ProfinityEpoxide环氧亲和介质

Affi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶

Affi-Prep多粘菌素介质

Affi-Gel硼胶

Affi-Gel配体固定化活化介质凝胶过滤层析介质

Bio-GelP系列

Bio-BeadsS-X介质羟基磷灰石介质（CHT）氟代羟基磷灰石介质（CFT）疏水层析介质

Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附剂目前十八页\总数一百一十五页\编于二十点层析柱分析柱离子交换分析柱：UnoQ,SAminex分析柱——分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子羟基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I

凝胶过滤分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHPLC分析柱反相层析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各种层析介质的Cartridges——用于条件摸索

UNOsphereMacroPrepCHTHIC目前十九页\总数一百一十五页\编于二十点层析介质结构原理UnosphereMacroPrep离子交换层析Q，S，DEAE，CM疏水层析-CH3,t-Butyl亲和层析ProteinAIDA－Ni多粘菌素凝胶过滤CHT和CFTUnosphereQ,SMacroPrepHighQ,SMacroPrepDEAE,CMMacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHICProfinityIMACProfinityEpoxideAffi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel,DEAE,CMAffi-PrepPolymixinAffi-Gel硼胶Affi-Gel配体固定化活化目前二十页\总数一百一十五页\编于二十点层析介质及其技术凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析目前二十一页\总数一百一十五页\编于二十点1.Sphericalparticlespackedintoacolumn2.Sampleapplied3. Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinandoutofmatrix4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorder

ofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.DiffusionBufferDiffusionintotheporesDiffusionoutoftheporesBuffer凝胶过滤目前二十二页\总数一百一十五页\编于二十点凝胶过滤层析分离纯化原理目前二十三页\总数一百一十五页\编于二十点Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water凝胶结构目前二十四页\总数一百一十五页\编于二十点Stericexclusionleadstoearlyelution按照分子量大小洗脱大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱目前二十五页\总数一百一十五页\编于二十点1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶的选择目前二十六页\总数一百一十五页\编于二十点Bio-GelP4(800-4,000)forseparationdigestedproductsfromIgG凝胶过滤层析凝胶的选择目前二十七页\总数一百一十五页\编于二十点凝胶过滤层析Bio-GelP6(1000-6000)凝胶的选择目前二十八页\总数一百一十五页\编于二十点凝胶过滤层析Bio-GelP10(1500-20,000)凝胶的选择目前二十九页\总数一百一十五页\编于二十点凝胶过滤层析Bio-ScaleMiniBio-GelP6脱盐预装柱操作方便，可连接在DuoFlow、LP、Profinia和Econo泵上目前三十页\总数一百一十五页\编于二十点Bio-BeadsS-X介质——

多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体Bio-BeadsS-X1Bio-BeadsS-X3600Bio-Beads

S-X81,000Bio-Beads

S-X12400高分辨率亲脂性分子排阻色谱2,00014,000中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、杂环化合物介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂凝胶过滤层析目前三十一页\总数一百一十五页\编于二十点1、三硬脂酸甘油酯，8912、三肉豆蔻酸甘油酯，7293、三月桂酸甘油酯，6454、三辛酸甘油酯，4775、三己酸甘油酯，3936、十六烷，2267、十一烷，156Bio-BeadsS-X8分离效果高分辨率亲脂性分子排阻色谱——Bio-BeadsS-X介质凝胶过滤层析目前三十二页\总数一百一十五页\编于二十点柱长的选择

分离：30－120cm

脱盐：30cm以下

洗脱液

离子强度低高离子作用排阻作用（0.1-0.5M)疏水作用pH——中性流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量：1－3％CV凝胶过滤层析操作参数选择目前三十三页\总数一百一十五页\编于二十点增加分辨率的方法检测柱效检测分离度减少上样体积降低流速使用更小的介质颗粒的介质连接2根层析柱目前三十四页\总数一百一十五页\编于二十点1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质

具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/302.脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用目前三十五页\总数一百一十五页\编于二十点凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点：层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从而设备成本很高；上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；分辨率低；不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子交换上样前的脱盐目前三十六页\总数一百一十五页\编于二十点cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQQuaternaryamineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-目前三十七页\总数一百一十五页\编于二十点pIstabilityrangestabilityrange与阳离子交换介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析原理——蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷与阴离子交换介质结合目前三十八页\总数一百一十五页\编于二十点Products:UNOsphere™Q&S,Macro-Prep®HighQ&S,CM,DEAE,AG®resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration--++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-----++++++++++++++++++++++++++++++------------++++++++++++++++++++++++++++++离子交换层析离子交换层析原理目前三十九页\总数一百一十五页\编于二十点sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead离子交换过程目前四十页\总数一百一十五页\编于二十点离子强度洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.

在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与pH

选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)

缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上

蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析操作参数选择目前四十一页\总数一百一十五页\编于二十点pI＝5.5+-pH102离子交换层析缓冲液与pHpI＝7.5阳离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷pH4.0pH9.0蛋白质稳定性范围目前四十二页\总数一百一十五页\编于二十点pH7.0pH8.0pH8.9pH6.0pH6.0pH7.0pH8.0pH8.9缓冲液与pH的影响——阴离子交换离子交换层析离子交换层析操作参数选择目前四十三页\总数一百一十五页\编于二十点离子交换层析离子交换层析操作参数选择盐溶液梯度的影响目前四十四页\总数一百一十五页\编于二十点Columns

MediaBio-ScaleMiniHighQMacro-PrephighQBio-ScaleMiniHighDEAEMacro-PrepDEAEBio-ScaleMiniHighS Macro-PrephighSBio-ScaleMiniUNOsphereQ Macro-PrepCMBio-ScaleMiniUNOsphereS Macro-Prep25QBio-ScaleMiniUNOsphererapidSMacro-Prep25SUNOQ UNOsphereQUNOS UNOsphereSUNOsphererapidS离子交换层析离子交换层析产品50um25um120um80um10um100um目前四十五页\总数一百一十五页\编于二十点更高的选择性和分辨率10%穿透载量:UnosphereQ:>150mg/mlBSA@600cm/hrUnosphereS:>30mg/mlBIgG@600cm/hr高流速，低反压

－操作压力:<2bar@1200cm/hrwith20cm更高的碱稳定性短期:1.0MNaOH@RTfor>1week长期:Storagein0.1MNaOH@RTfor>1year生产效率大大提高离子交换层析UNOsphereQ/S性能参数目前四十六页\总数一百一十五页\编于二十点Column1.1x20cmLoadbuffer:20mMTris,pH8.5ElutionBuffer:Load+0.5NaClLoad:5mg/mlBSAColumn1.1x20cmLoadbuffer:20mMNaAc,pH5.0ElutionBuffer:Load+0.5NaClLoad:1.64mg/mlhIgGUNOsphereQ:BSAUNOsphereS:HIgG高流速，高载量：Unosphere目前四十七页\总数一百一十五页\编于二十点高流速，低反压：Unosphere目前四十八页\总数一百一十五页\编于二十点SupportLinearvelocity(cm/hr)Recovery(%)BSAbindingcapacity(g/L)Processtime(hr)Productivity(g/L/hr)UNOsphereQ6151001201.5875.0QSepharoseFF30099.023.01.1919.0FractogelEMDTMAE(M)10599.082.05.0416.0SupportLinearvelocity(cm/hr)Recovery(%)HumanIgGbindingcapacity(g/L)Processtime(hr)Productivity(g/L/hr)UNOsphereS110098.632.00.6053.3SPSepharoseFF50097.814.30.7718.5FractogelEMDSO3(M)23197.066.46.5010.2离子交换层析目前四十九页\总数一百一十五页\编于二十点UNOsphere更高的生产效率：更短的工艺时间短时间内处理大量体积样品更小的层析柱，更少的介质更高的产量更短的生产周期生产成本下降离子交换层析蛋白质纯化，特别是从原材料或发酵中间体目标蛋白的大量捕获中间纯化UNOsphereQ/S应用目前五十页\总数一百一十五页\编于二十点4ProcessSteps 1.Polymerization 2.Washing 3.Deagg/Sizing 4.BaseTreatmentMonomerCross-linkerIonomerSurfactantSaltSolventInitiatorHeatBaseTreatmentBottlingIPAWashUnsizedUNOsphereBeadWetSizingSizedUNOsphereBeadDeaggUNOsphere制造过程目前五十一页\总数一百一十五页\编于二十点UNOsphere%cross-linker: S 25% Q 25%离子交换层析UNOsphereQ/S结构目前五十二页\总数一百一十五页\编于二十点Continuousnetworkofpolymernodules0.5-1µmChannels3-5µm

Q：－(CH3)3N+S：－SO3-ProfinityIMAC：－IDA-Ni，Cu，Co离子交换层析UNOsphereQ/S结构目前五十三页\总数一百一十五页\编于二十点Reference:T.Ogawaet.al.HydroxyapatiteConference2001陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术合成目前五十四页\总数一百一十五页\编于二十点左边:Bio-GelHT/HTP羟基磷灰石右边:CFT/CHTTM

陶瓷羟基磷灰石I&II晶体与陶瓷结构陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前五十五页\总数一百一十五页\编于二十点Ca10(PO4)6(OH)25个带正电荷的Ca离子对（C位点）2个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）2个羟基于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前五十六页\总数一百一十五页\编于二十点产品类型与参数陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前五十七页\总数一百一十五页\编于二十点蛋白质带正电氨基经典的阳离子交换用中性盐溶液(NaCl)或缓冲盐溶液(PO4)洗脱初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前五十八页\总数一百一十五页\编于二十点带负电羧基经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节比离子间静电相互作用强15–60倍在无PO4条件下不能被任何浓度NaCl洗脱用PO4洗脱初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前五十九页\总数一百一十五页\编于二十点大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳离子交换酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著注：对于带负电荷的酸性蛋白质，无论样品是否含有NaCl，都对上样时的吸附载量和保留无影响，这意味着可以将捕获阶段获得的中间体样品无需脱盐处理即可上样到CHT上进行高分辨率中间纯化混合保留机制陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前六十页\总数一百一十五页\编于二十点Equlibrate:5mMNaPO4pH6.5Gradient:5mM–300mMNaPO4Eq:5mMPO4,0.3MNaClpH6.5Grad:5mM–300mMPO4,0.3MNaClIgGMAbBSA混合保留机制陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前六十一页\总数一百一十五页\编于二十点单克隆抗体，多克隆抗体纯化重组疫苗抗体片段重组蛋白质酶核酸:DNA/RNA(单双链)膜蛋白质羟基磷灰石应用陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前六十二页\总数一百一十五页\编于二十点优点独特的分离机制高再生能力高分辨率容易规模放大容易进行方法开发高机械稳定性高化学稳定性层析柱寿命长易于将HT工艺直接转移到CHT/CFT上CFT比CHT更耐酸颗粒大小：20um、40um和80um陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前六十三页\总数一百一十五页\编于二十点TypeI由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.TypeII由于具有大孔结构，II型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备如何选择类型陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前六十四页\总数一百一十五页\编于二十点CHT纯化或去除DNA的机理陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术目前六十五页\总数一百一十五页\编于二十点分离纯化原理与操作参数选择羟基磷灰石（CHT）影响蛋白质色谱行为的操作参数：

CHT类型

NaCl浓度

PB缓冲液浓度梯度双梯度洗脱

PB缓冲液梯度含不同NaCl浓度缓冲液pH值双梯度洗脱模型先以0-500mMNaCl，再以0-500mM磷酸钾目前六十六页\总数一百一十五页\编于二十点不同类型CHT陶瓷羟基磷灰石在不同pH下不同蛋白质的保留时间（min）羟基磷灰石（CHT）目前六十七页\总数一百一十五页\编于二十点不同蛋白质分离纯化的Protocol：IgG羟基磷灰石（CHT）目前六十八页\总数一百一十五页\编于二十点不同蛋白质分离纯化的Protocol：球形蛋白质，质粒羟基磷灰石（CHT）目前六十九页\总数一百一十五页\编于二十点不同蛋白质分离纯化的Protocol：酸性蛋白质羟基磷灰石（CHT）目前七十页\总数一百一十五页\编于二十点双梯度洗脱羟基磷灰石（CHT）0-0.5MNaCl0-0.4MNaPO4玉米种子中纯化转基因抗体IgG目前七十一页\总数一百一十五页\编于二十点图1CHT-I柱纯化α1-AT。柱尺寸：7×52mm(10ml)；上样量：5.0ml；BufferA：10mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；BufferB：400mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；梯度：0-5%B和5-30%B各5个柱体积，30-100%B10个柱体积；流速：2.5ml/min。分部收集组分为1.5ml，收集如下：收集组分I-VIII分别为：运行组分（图上方轴）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、69-71和74-77。绿条框指示为α1-AT洗脱液。CHT纯化转基因羊奶中的重组人α1-抗胰蛋白酶

羟基磷灰石（CHT）PI其中，α1-AT，pI＝5.27α乳白蛋白，pI＝5.16β-乳球蛋白,pI=4.775.274.775.16目前七十二页\总数一百一十五页\编于二十点Markettrendoftherapeuticantibodies

Twentyapprovedantibodytherapeuticscurrentlyavailableforthetreatmentofvariousdiseases-Reopro,Rituxan,Herceptin,Remicade,Synagis,Avastin,Erbitux,Xolair,Raptiva,Lucentis,Tysabri,etc. Theantibodytherapeuticsmarketisexpectedtogrowbyabout30%annuallyreachingexcessof$22billionby2007.

Reference:目前七十三页\总数一百一十五页\编于二十点ProductionofMonoclonalsFermentationHarvestRecoveryDownstreamProcessingBulkDrugSubstance目前七十四页\总数一百一十五页\编于二十点MonoclonalsDownstreamProcess–AGenericApproach目前七十五页\总数一百一十五页\编于二十点CriticalcontaminantsindownstreamprocessdevelopmentContaminantsMolecularweightsIsoelectricpointsIgGAggregates>300,000SameasIgGProteinA42,0004.9-5.1DNA1,000-1,000,000HighlyacidicEndotoxin>100,000HighlyacidicHostcellproteinsVaryVariousViruses>1,000,000<7formost目前七十六页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionofaggregatesAggregatestendtobindCHTmorestronglythan“monomeric”IgG.ThisindicatesthatthebindingcharacteristicsoftheindividualIgGmoleculesinanaggregateareadditive.Thelargertheaggregate,thestrongerthebinding.AggregateremovalinNaClgradientsatlowconcentrationsofphosphategenerallyprovidesevenbetterseparationthansizeexclusionchromatography,athigherflowrates,andmuchhighercapacity.目前七十七页\总数一百一十五页\编于二十点TheeffectofpHonaggregateseparation15mM10mMpH7.5pH6.5Sodiumchloridegradientatconstant5mMNaPO41.5MNaCl0.5MPO4proteinApurifiedIgGonCHTtypeI20µm目前七十八页\总数一百一十五页\编于二十点TheeffectofPO4onaggregateseparation1MNaCl0.5MPO415mM10mM25mMPO4IndicatedphosphateconcentrationmaintainedacrossthesodiumchloridegradientproteinApurifiedIgGonCHTtypeI20µm目前七十九页\总数一百一十五页\编于二十点DOEtoOptimizeResolutionofAggregates目前八十页\总数一百一十五页\编于二十点ContourplotofpHandPO4onaggregateresolutionResolutionfactor=2[tB-tA]/(WA+WB)wheretandWcorrespondtotheretentiontimeandpeakwidthatbaselinerespectively.Reference:PKNget.al.JournalofChromatographyA,1142(2007)13-18目前八十一页\总数一百一十五页\编于二十点AnalysisofCHTfractionsHPSECofCHTfractionsBio-Silect400-550µLsample,0.8mL/min50mMHEPES,1.0MNaCl,2Murea,pH7.2

CHTpoolfrom0.5MPO4cleaning

NativeIgGpoolfromNaClgradientIgGpoolfromproteinANativeIgGElutionZone目前八十二页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionofproteinATheelutionzonesforfree*proteinAandfreeIgGoverlaptovaryingdegrees.HoweveritisimportanttorememberthatproteinAisnot“free”undermostconditions:itisaffinity-complexedwithIgG.AswithIgGaggregates,thebindingcharacteristicsofIgGandproteinAareapparentlyadditiveinthecomplex.WhenelutionisconductedwithNaClataconstantlowconcentrationofphosphate,proteinA-IgGcomplexeselutemuchlaterandwellseparatedfromfreeIgG.ProteinA-IgGcomplexeselutemostlyinthe0.5MNaPO4cleaningstep.Greaterthan90%reductionispossibleinasinglestep.目前八十三页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionoffreeproteinAvsIgGPhosphategradientelutionatdifferentconcentrationsofNaClCHT,typeI,40µmGreenproteinA,GrayIgG0.0MNaCl0.3MNaCl目前八十四页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionoffreeproteinAvsIgGNaClgradientelutionatdifferentphosphateconcentrationsCHT,typeI,20µmGreenproteinA,GrayIgG5mMPO420mM10mM目前八十五页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionofDNAThebindingofDNAisdominatedbymetalaffinitywithCHTcalcium.Thisalsoappliestootherphosphorylatedcontaminantssuchasendotoxins.Phosphateconcentrationsof200–400mMarerequiredforelution.WhenIgGiselutedinaNaClgradientatlowphosphateconcentration,DNAreductionofmorethan3logsispossible.Endotoxinreductionunderthesameconditionsismorethan4logs.目前八十六页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionofDNAonCHT+0.50MNaCl+1.0MNaCl0.80MPO4+0.25MNaCl10mMPO4+0.00MNaClShearedsalmonspermDNA

CHTtypeI,40micron,600cm/hrpH7.0目前八十七页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionofDNA/RNAonCHT目前八十八页\总数一百一十五页\编于二十点RemovalofvirusesacrossCHTAttribute/VirusX-MuLVMVMFamilyRetroviridaeParvoviridaeNucleicAcidssRNAssDNAEnvelopedYesNoSize80-120nm18-26nmResistanceto

PhysicochemicalAgentsLowHighLogclearance(March2006)(January2008)>3>322目前八十九页\总数一百一十五页\编于二十点RetentionofendotoxinsEndotoxinsarehighlyacidicduetoahighcontentofphosphorylandcarboxylresidues.BothshouldhavestrongaffinityforCHTcalcium.Elutionintheabsenceofphosphateshouldnotoccur.SomeendotoxinshaveaminogroupswhichmaycationexchangewithCHTphosphatesatlowionicstrength.Endotoxinsoccurinarangeofaggregationstates,intothemillionsofDaltons.MostofthechargesareinternalizedbecauseoftheirassociationwiththehydrophobiclipidAregion.Bothsizeandchargeshieldingmayaffectretention.Endotoxinsarefrequentlycomplexedwithproteinsandothercellwallcomponentsthatmayalsoinfluenceretention目前九十页\总数一百一十五页\编于二十点IgGzoneIgGzoneNaCl0-1.5MCleanwith0.5MPO4PO40-0.3MCleanwith0.5MPO4AffinityofendotoxinstoCHTLPSmixturefromE.Coli,SalmonellaandPseudomonas

CHTtypeI,40micron,300cm/hr目前九十一页\总数一百一十五页\编于二十点Removalofhostcellproteins(HCP)HCPareuniqueforeachcellline.HundredstothousandsofHCPsderivedfromcellorcelldebrisarepresentinfermentorfluid.BulkofHCPsisremovedacrossproteinAchromatography.MixedmodeinteractionwithCHTcanofferuniqueopportunityforremovalofresidualHCPs.目前九十二页\总数一百一十五页\编于二十点TheeffectofNaClandphosphateonCHOPclearance

CHOprotein(ppm)ProteinAeluate58.3NaClgradientpool<1PO4gradientpool31目前九十三页\总数一百一十五页\编于二十点CHTfractionationofcontaminantsProteinA-purifiedhumanIgG1

CHTtypeI,20micron,300cm/hr20mMNaPO4,pH6.540CVlineargradientto1MNaCl(20mMPO4)Cleanwith0.5MNaPO4MonomerAggregate(tetramer)dnaetoxpaLargeraggregates目前九十四页\总数一百一十五页\编于二十点2-StepPlatformPurification,proteinA/CHTEluteproteinAwith0.1Mglycine*orarginine*0.05MNaCl,pH3.8(nocitrateorEDTA).Holdforviralinactivation.RaisepHto6.5byadditionof0.5MNaPO4pH10.5,1%v:v.EquilibrateCHTto5mMNaPO4,pH6.5RunoptimizedCHTfractionationconditions*Glycineandarginineconcentrationcanberaisedto1-2Mtoreduceaggregation.目前九十五页\总数一百一十五页\编于二十点2-Stepplatform(ChimericIgG),Case1

OM PPA PCHTAggregate%IgG----- >40 <1 ProteinAng ----- 162 6DNAng 9.9x105 3.8x104 12EndotoxinEU 2.6x103 5.0x102 <0.05IgG% 100 25* 45*OM:originalmaterialPPA:IgGpoolfromproteinAPCHT:nativeIgGpoolfromCHT*lowrecoveryPPAduetoaggregation;PCHTduetoaggregateremoval目前九十六页\总数一百一十五页\编于二十点ThreeStepPlatformPurification,conditionsEluteproteinAwith0.1Mglycine,0.05MNaCl,pH2.5(nocitrateorEDTA).RaisepHto3.8byadditionof1MTrispH8.5,4.9%v:v.Holdforviralinactivation(seereference)RaisepHto7.0byadditionof1MTrispH8.5,2.3%v:v.Thiswillyieldaconductivityof~9mS.EquilibrateUNOsphereQcolumnto0.07MTris,0.1Mglycine,pH7.0,flow-throughmodeReducepHto6.5byadditionof0.5MmonobasicNaPO4(pH~4.1),1%v:v.EquilibrateCHTwith5mMNaPO4,pH6.5Load,wash,20CVlineargradientto1.5MNaCl*Cleanwith0.5MNaPO4* screeningconditions,increaseto10mMifIgGdoesnotelute目前九十七页\总数一百一十五页\编于二十点3-StepPlatformpurification,summaryUNOsphereSUPrACHTUNOsphere

Q4123123452450SHPSECBio-SilectSEC400-550mMHEPES0.5MNaCl2Murea,pH7目前九十八页\总数一百一十五页\编于二十点3Step-PlatformPurification,summaryAggregateremovalbyCHTMorethan99%reductionbyHPSECLeachedproteinAremovalbyCHT90%removalbyCygnusELISAreducedfrom55to5ng/mLDNAremovalbyCHT>3logsreductionbyPCRreducedto<1ng/mLbypicogreenEndotoxinremovalbyCHTSpikedwithLPSfromE.coli,Salmonella,andP.aeruginosaremoved7x104EUbyLALfinalconcentration,IgGpool,1EU/mL目前九十九页\总数一百一十五页\编于二十点基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合不同离子的疏水性Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱原理疏水层析MacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHIC产品目前一百页\总数一百一十五页\编于二十点疏水层析生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术比反相层析的配体密度低很多，无须有机溶剂洗脱，保存生物活性配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质目前一百零一页\总数一百一十五页\编于二十点作用原理溶质曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG=DH-T

DS目前一百零二页\总数一百一十五页\编于二十点为什么使用疏水层析?离子交换技术、羟基磷灰石、凝胶过滤技术、亲和层析技术的补